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문제 정의
- 따라서 수확한 과채류의 품질과 부가가치를 향상시키는 하나의 수단 으로서 저장성 향상 및 선도 유지 방법의 개발이 요구된다. 과채류의 선도를 향상시키는 방안으로서는 안전성에서 우수한 천연 항균제를 이용하는 것이다. 또한 과채류의 유통시 에 포장은 필수적이므로 항균력이 뛰어난 천연항균제를 함유한 포장재의 개발도 과채류의 선도 유지에 바람직한 방안 의 하나가 될 수 있다.
- 따라서, 본 실험에서는 전보(10)에서 시설채소산물의 선도유지를 위하여 활용했던 약용식물추출물 등을 비교실험구로 하여, 안정성과 항균력이 뛰어난 자몽종자추출물제 재(Botanical antimicrcbial agent-grapefruit seed extract mixture : 이하 BAAG라 칭함)로부터 항균활성물 질을 추출하고 BAAG의 항균활성성분이 미생물세포막 또는 세포벽의 유동성에 미치는 영향을 검토하는 한편, 전자현미경을 이용하여 변패미생물의 세포형태 및 기능성변화를 살펴봄으로써 BAAG의 항균작용을 확인하였다. 이를 기초로 해서, 항균력이 우수한 BAAG를 제조하여, 과채류에 대한 분무 또는 침지처리제 및 포장소재등의 천연 선도유지제로 서의 이용가능성을 검토하여, 저장, 수송등 유통과정에서 과채류의 half life를 연장함으로써, 우리나라 과채류 산업의 국제경쟁력 강화에 기여할 수 있는 기초를 마련하고자 하였 다.
제안 방법
- 1 mL를 여러농도(50, 100, 250, 500, 1000 Jig/mL)의 BAAG가 함유된 TSB에 접종한후 배양하였다. BAAG의 첨가농도별 항균효과는 미생물의 생육정도를 spectrometer(620 nm)로 흡광도를 측정, 비교하고 천연항균 소재인 BAAG를 넣은 TSB를 blank로 사용하였다. 공시균주에 대하여 BAAG의 생육억제를 확인하기 위하여 생육저해 농도곡선을 측정하였다.
- BAA의 항균력 시험에서 항균력이 우수한 것으로 입증된 BAAG를 선택하여 BAAG 첨가 농도를 달리하여 공시균주인 과채류 변패미생물에 대한 생육저해 농도곡선을 측정하였다. 실험결과, Fig.
- BAA의 항균력 시험에서 항균력이 우수한 것으로 입증된 자몽종자추출제재 (BAAG)를 선택하여 membrane filter(0.2 m) 로 제균시키고, tryptic soy broth(TSB) 에 BAAG를 여러 가지 농도(50, 100, 250, 500, 1000 mg/mL)단위로 첨가한 후, 각 공시균주의 slant에서 배양된 균주 1백금이를 취하여 10 mL TSB에 접종, 30℃에서 24시간 동안 배양시키고, 이 배양액 0.1 mL를 취해 다시 10 mL TSB에 접종하여 30℃에서 24시 간 동안 배양한 배양액 0.1 mL를 여러농도(50, 100, 250, 500, 1000 Jig/mL)의 BAAG가 함유된 TSB에 접종한후 배양하였다. BAAG의 첨가농도별 항균효과는 미생물의 생육정도를 spectrometer(620 nm)로 흡광도를 측정, 비교하고 천연항균 소재인 BAAG를 넣은 TSB를 blank로 사용하였다.
- Paper disc method에 의하여 BAA의 항균성을 즉정하여 항균력이 가장 우수한 BAAG를 대상으로 열 및 pH 안정성를 검토하였다. 열 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100, 120, 150℃까지 30분 동안 열처리한 후, 처리온도 별로 BAAG를 1000 ug/mL 농도가 되게한 다음, gram 양성균, gram 음성균, 곰팡이 및 효모 분류에 해당된는 각각의 공시 균주를 이용하여 항균력 시험 방법과 동일하게 생육저해환 을 비교, 측정하였다.
- Paper disc method에 의하여 BAA의 항균성을 측정하여 항균력이 가장 우수한 BAAG를 대상으로 열 및 pH 안정성를 검토하였다. 열 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100, 120, 150℃까지 30분 동안 열처리한 후, 처리온도 별로 BAAG를 1000 ug/mL 농도가 되게한 다음, gram 양성균, gram 음성균, 곰팡이 및 효모 분류에 해당된는 각각의 공시 균주를 이용하여 항균력 시험 방법과 동일하게 생육저해환 을 비교, 측정하였다.
- 탈수된 조직은 critical point dryerS. 건조시킨후 ion sputter를 이용하여 gold ion particle을 두께 20 nm로 피막을 입힌 후 주사전자현미경(Scanning electron micrograph, SEM : DS-130C, ISI ABT)으로 관찰하였다.
- 또한 pH안정성을 측정하기 위하여, buffer solution으로 BAAG의 pH를 4, 6, 7, 8, 10으로 조정한 후, 37℃에서 1시간 방치한 다음, 다시 pH 7로 중화시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육저해환을 비교. 검토하여 pH 안정성을 측정하였다.
- 즉, BAAG 1, 000 mL의 농도로 처리한 것과, 처리하지 않은 대조구 균체세포의 주사전 자현미경 (SEM : Scanning electron microscope : DS-130C, ISI ABT)촬영사진을 비교 . 검토하여 미생물 세포조직의 변화를 측정하였다. 주사전자현미경의 조직 표본 제작과정은 다음과 같다.
- 4)에서 2〜4시간 정도에서 고정하였다. 고정 후, phosphate buffer (monobasic & dibasic) pH(7.0~7.4)로 2회 정도 세척하고, 다 시 1 —2% osmium tetroxide용액 (pH7.0〜7.4, 4℃)로 1 〜2시간 고정하고, phosphate buffer pH(7O〜7.4)로 2회 정도 세척한 후, 95% Ethanol 각각 15분 간격으로 탈수를 실시하였다. 이어서 acetone이나 isoamylacetate0]] 침전시키고, 바로 CO2나 HMDS(hexamethyldisilazane)를 이용하여 시료를 완전히 건조 시켰다.
- BAAG의 첨가농도별 항균효과는 미생물의 생육정도를 spectrometer(620 nm)로 흡광도를 측정, 비교하고 천연항균 소재인 BAAG를 넣은 TSB를 blank로 사용하였다. 공시균주에 대하여 BAAG의 생육억제를 확인하기 위하여 생육저해 농도곡선을 측정하였다. 이때 실험에 사용한 균주는 과채류의 생육 및 저장유통중에 오염되어 상품가치를 떨어뜨리는 것으로 알려져 있는(13, 14) 건부병균 Fusarium solani, 잿빛 곰팡이 병균 Botrytis cinerea, 녹색곰팡이 병균 Pencillium anstosum, 연부병균 Erwinia carotovora, 실부병균 Phoma destructiva, 흑반병균 Altemaria radicina 등을 공시균주로 하였다.
- 즉, 배양된 공시균액 10 mL를 petri dish에 가하고 멸균된 배지를 약 15 mL 부어 혼합하고 굳혀서 그 위에 다시 10 mL을 중첩하여 굳힌다. 그 위에 paper disc를 놓고 BAA의 농도를 250 - 1000 의 농도로 조제된 액 을 10 11L 흡수시켜 세균의 경우 생육최적온도인 35C에서 48시간 배양하고, 곰팡이의 경우는 25 ℃에서 72시간 배양 후 균이 증식하지 못한 clear zone의 직경을 대조구(약용식물 추출물을 처리하지 않은 것)와 비교하여 항균력을 시험하였다.
- 현재, 국내외적으로 진행되고 있는 천연항균제에 관한 연구(3-9)는 대부분 실제응용분야에 있어서 효과면에 치중한 연구로서 항균작용을 확인하기 위한 기초연구가 부족한 형편이다. 따라서, 본 실험에서는 전보(10)에서 시설채소산물의 선도유지를 위하여 활용했던 약용식물추출물 등을 비교실험구로 하여, 안정성과 항균력이 뛰어난 자몽종자추출물제 재(Botanical antimicrcbial agent-grapefruit seed extract mixture : 이하 BAAG라 칭함)로부터 항균활성물 질을 추출하고 BAAG의 항균활성성분이 미생물세포막 또는 세포벽의 유동성에 미치는 영향을 검토하는 한편, 전자현미경을 이용하여 변패미생물의 세포형태 및 기능성변화를 살펴봄으로써 BAAG의 항균작용을 확인하였다. 이를 기초로 해서, 항균력이 우수한 BAAG를 제조하여, 과채류에 대한 분무 또는 침지처리제 및 포장소재등의 천연 선도유지제로 서의 이용가능성을 검토하여, 저장, 수송등 유통과정에서 과채류의 half life를 연장함으로써, 우리나라 과채류 산업의 국제경쟁력 강화에 기여할 수 있는 기초를 마련하고자 하였 다.
- 열 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100, 120, 150℃까지 30분 동안 열처리한 후, 처리온도 별로 BAAG를 1000 ug/mL 농도가 되게한 다음, gram 양성균, gram 음성균, 곰팡이 및 효모 분류에 해당된는 각각의 공시 균주를 이용하여 항균력 시험 방법과 동일하게 생육저해환 을 비교, 측정하였다. 또한 pH 안정성을 측정하기 위하여, buffer solution으로 BAAG의 pH를 4, 6, 7, 8, 10으로 조정한 후, 37℃에서 1시간 방치한 다음, 다시 pH 7로 중화시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육저해 환을 측정하였다. 그 결과, BAAG는 gram 양성균, gram 음성균, mold 및 yeast 등 폭넓은 미생물영역에 대하여 넓은 범위의 처리온도(Fig.
- 열 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100, 120, 150℃까지 30분 동안 열처리한 후, 처리온도 별로 BAAG를 1000 ug/mL 농도가 되게한 다음, gram 양성균, gram 음성균, 곰팡이 및 효모 분류에 해당된는 각각의 공시 균주를 이용하여 항균력 시험 방법과 동일하게 생육저해환 을 비교, 측정하였다. 또한 pH안정성을 측정하기 위하여, buffer solution으로 BAAG의 pH를 4, 6, 7, 8, 10으로 조정한 후, 37℃에서 1시간 방치한 다음, 다시 pH 7로 중화시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육저해환을 비교. 검토하여 pH 안정성을 측정하였다.
- 일반 약용식물을 건조된 상태로 구입하여 각각 100 g씩을 분쇄기에 분쇄하여 시료와 증류수를 1 : 5의 비율로 넣고 100℃ water bath에서 3시간 동안 추출하여 1차 여과포를 이용하여 여과한 후 10분 동안 5, 000 ipm에서 원심분리하여 상등액을 수집하였다. 이상등액에 2차 여과시켜 얻은 액을 합쳐 회전진공증발기로 최초량의 약 1/1。로 농축하고 동결건조기를 이용하여 분말상태로 조제하였다. 한편, 자몽종자 추출물은 외국산 자몽을 구입하여 과육부와 종자의 비율이 1 : 4 정도로 혼합되어 있는 자몽과실체를 60℃ 〜70℃의 건조실에서 drum-drying을 행하여 건조시킨 후, milling system 으로 80-120 mesh 크기로 분쇄하고, 자체 개발된 감압추출 장치를 이용하여 glycerine을 추출용매로 연속 추출하고, 층 분리시켜 자몽종자추출물(Grapeft什it seed extract : GFSE)을 수집 하였다(11).
- 항균력을 측정하기 위하여 공시균주에 대하여 각각 조제한 일정농도의 BAA를 paper disk 상에 접종하여 생육저해도 를 측정하였다. 실험결과, Table 1에서 보는 바와 같이, 본 실험시료로 선택한 BAA중 넓은 영역의 변패미생물에 대하여 항균력이 뛰어난 것은 비교실험용 항균소재인 마두령, 대황, 황금, 치자, 황련, 호장, 정향 등으로 나타났으나, 광범위한 영역의 미생물군에 대하여 뚜렷한 생육저해환을 보이고 있어 본 연구의 항균포장지 제조용 항균소재로 BAAG를 선택하고 그 항균특성을 검토하였다.
- Paper disc method에 의하여 BAA의 항균성을 즉정하여 항균력이 가장 우수한 BAAG를 대상으로 열 및 pH 안정성를 검토하였다. 열 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100, 120, 150℃까지 30분 동안 열처리한 후, 처리온도 별로 BAAG를 1000 ug/mL 농도가 되게한 다음, gram 양성균, gram 음성균, 곰팡이 및 효모 분류에 해당된는 각각의 공시 균주를 이용하여 항균력 시험 방법과 동일하게 생육저해환 을 비교, 측정하였다. 또한 pH안정성을 측정하기 위하여, buffer solution으로 BAAG의 pH를 4, 6, 7, 8, 10으로 조정한 후, 37℃에서 1시간 방치한 다음, 다시 pH 7로 중화시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육저해환을 비교.
- BAAG는 목적에 맞게 일정농도로 희석하여 실험용 시료로 이용하였다. 이때 얻어지는 BAAG는 자외선이 조사되는 무균실에서 특정 온도, 압력, 시간 등의 조건 하에서 품질관리 방법에 의한 검사를 실시하여 일정한 규격의 제품이 되도록 하였다.
- 일반 약용식물을 건조된 상태로 구입하여 각각 100 g씩을 분쇄기에 분쇄하여 시료와 증류수를 1 : 5의 비율로 넣고 100℃ water bath에서 3시간 동안 추출하여 1차 여과포를 이용하여 여과한 후 10분 동안 5, 000 ipm에서 원심분리하여 상등액을 수집하였다. 이상등액에 2차 여과시켜 얻은 액을 합쳐 회전진공증발기로 최초량의 약 1/1。로 농축하고 동결건조기를 이용하여 분말상태로 조제하였다.
- 항균력이 뛰어난 BAAG의 처리로 인한 공시균주의 세포 형태 및 기능성 변화를 알아보기 위해 전자현미경을 이용하여 전술한 방법(15, 16)에 준하여 BAAG처리전후의 미생물의 세포구조를 관찰하였다. 즉, BAAG 1, 000 mL의 농도로 처리한 것과, 처리하지 않은 대조구 균체세포의 주사전 자현미경 (SEM : Scanning electron microscope : DS-130C, ISI ABT)촬영사진을 비교 . 검토하여 미생물 세포조직의 변화를 측정하였다.
- 이상등액에 2차 여과시켜 얻은 액을 합쳐 회전진공증발기로 최초량의 약 1/1。로 농축하고 동결건조기를 이용하여 분말상태로 조제하였다. 한편, 자몽종자 추출물은 외국산 자몽을 구입하여 과육부와 종자의 비율이 1 : 4 정도로 혼합되어 있는 자몽과실체를 60℃ 〜70℃의 건조실에서 drum-drying을 행하여 건조시킨 후, milling system 으로 80-120 mesh 크기로 분쇄하고, 자체 개발된 감압추출 장치를 이용하여 glycerine을 추출용매로 연속 추출하고, 층 분리시켜 자몽종자추출물(Grapeft什it seed extract : GFSE)을 수집 하였다(11). 이와 같이 추출조제 한 종자추출물에 lactic acid 5%, citric acid 5%가 되도록 혼합, 교반하고 균질화하는 과정을 반복한 다음, 50〜80 rpm의 느린 속도로 일정시간 교반하여 얻어진 추출물을 식물성 천연항균제 자몽종자추출 물제재(Botanical antimicrobial agent-GFSE mixture: 이하 BAAG라 칭함)로 선택하여 항균력 실험원액으로 사용하였다.
- 식물성 천연항균소재(Botanical antimicrobial agent : BAA) 의. 항균력을 측정하기 위하여 공시균주에 대하여 각각 조제한 일정농도의 BAA를 paper disk 상에 접종하여 생육저해도 를 측정하였다. 실험결과, Table 1에서 보는 바와 같이, 본 실험시료로 선택한 BAA중 넓은 영역의 변패미생물에 대하여 항균력이 뛰어난 것은 비교실험용 항균소재인 마두령, 대황, 황금, 치자, 황련, 호장, 정향 등으로 나타났으나, 광범위한 영역의 미생물군에 대하여 뚜렷한 생육저해환을 보이고 있어 본 연구의 항균포장지 제조용 항균소재로 BAAG를 선택하고 그 항균특성을 검토하였다.
- 항균력이 뛰어난 BAAG의 처리로 인한 공시균주의 세포 형태 및 기능성 변화를 알아보기 위해 전자현미경을 이용하여 전술한 방법(15, 16)에 준하여 BAAG처리전후의 미생물의 세포구조를 관찰하였다. 즉, BAAG 1, 000 mL의 농도로 처리한 것과, 처리하지 않은 대조구 균체세포의 주사전 자현미경 (SEM : Scanning electron microscope : DS-130C, ISI ABT)촬영사진을 비교 .
대상 데이터
- 이와 같이 추출조제 한 종자추출물에 lactic acid 5%, citric acid 5%가 되도록 혼합, 교반하고 균질화하는 과정을 반복한 다음, 50〜80 rpm의 느린 속도로 일정시간 교반하여 얻어진 추출물을 식물성 천연항균제 자몽종자추출 물제재(Botanical antimicrobial agent-GFSE mixture: 이하 BAAG라 칭함)로 선택하여 항균력 실험원액으로 사용하였다. BAAG는 목적에 맞게 일정농도로 희석하여 실험용 시료로 이용하였다. 이때 얻어지는 BAAG는 자외선이 조사되는 무균실에서 특정 온도, 압력, 시간 등의 조건 하에서 품질관리 방법에 의한 검사를 실시하여 일정한 규격의 제품이 되도록 하였다.
- 공시균주에 대하여 BAAG의 생육억제를 확인하기 위하여 생육저해 농도곡선을 측정하였다. 이때 실험에 사용한 균주는 과채류의 생육 및 저장유통중에 오염되어 상품가치를 떨어뜨리는 것으로 알려져 있는(13, 14) 건부병균 Fusarium solani, 잿빛 곰팡이 병균 Botrytis cinerea, 녹색곰팡이 병균 Pencillium anstosum, 연부병균 Erwinia carotovora, 실부병균 Phoma destructiva, 흑반병균 Altemaria radicina 등을 공시균주로 하였다.
- 한편, 자몽종자 추출물은 외국산 자몽을 구입하여 과육부와 종자의 비율이 1 : 4 정도로 혼합되어 있는 자몽과실체를 60℃ 〜70℃의 건조실에서 drum-drying을 행하여 건조시킨 후, milling system 으로 80-120 mesh 크기로 분쇄하고, 자체 개발된 감압추출 장치를 이용하여 glycerine을 추출용매로 연속 추출하고, 층 분리시켜 자몽종자추출물(Grapeft什it seed extract : GFSE)을 수집 하였다(11). 이와 같이 추출조제 한 종자추출물에 lactic acid 5%, citric acid 5%가 되도록 혼합, 교반하고 균질화하는 과정을 반복한 다음, 50〜80 rpm의 느린 속도로 일정시간 교반하여 얻어진 추출물을 식물성 천연항균제 자몽종자추출 물제재(Botanical antimicrobial agent-GFSE mixture: 이하 BAAG라 칭함)로 선택하여 항균력 실험원액으로 사용하였다. BAAG는 목적에 맞게 일정농도로 희석하여 실험용 시료로 이용하였다.
이론/모형
- 식물추출물에 대한 항균력 시험은 paper disc method(12)에 의해 측정하였다. 즉, 배양된 공시균액 10 mL를 petri dish에 가하고 멸균된 배지를 약 15 mL 부어 혼합하고 굳혀서 그 위에 다시 10 mL을 중첩하여 굳힌다.
성능/효과
- 또한 pH 안정성을 측정하기 위하여, buffer solution으로 BAAG의 pH를 4, 6, 7, 8, 10으로 조정한 후, 37℃에서 1시간 방치한 다음, 다시 pH 7로 중화시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육저해 환을 측정하였다. 그 결과, BAAG는 gram 양성균, gram 음성균, mold 및 yeast 등 폭넓은 미생물영역에 대하여 넓은 범위의 처리온도(Fig.4)와 pH(Fig. 5)에서 뚜렷한 항균력을 보임으로써 열과 pH에 안정한 것으로 나타났다.
- BAA의 항균력 시험에서 항균력이 우수한 것으로 입증된 BAAG를 선택하여 BAAG 첨가 농도를 달리하여 공시균주인 과채류 변패미생물에 대한 생육저해 농도곡선을 측정하였다. 실험결과, Fig. 1, Fig. 2 및 Fig. 3에서 보는 바와 같이 대부분의 과채류 변패미생물들이 100-500 Ug/mL 이상의 BAAG농도에서 생육이 크게 억제되는 것으로 나타났다.
- 7과 같다. 즉, SEM에 의한 시료촬영결과에서 BAAG처리로 미생물 균체가 세포벽 또는 세포막의 기능파괴로 인하여 세 포형태의 변화가 뚜렷하게 발생하고, 사멸하게 되어 미생물 균체세포에 대한 BAAG의 항균작용을 확인할 수 있었고, 부패성 및 병원성 균주오염 가능성이 있는 식품을 BAAG로 예방처리함으로써 변패성 미생물균주에 의한 농축수산 식품 원료 및 그가공식품의 변패현상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 이상과 같은 실험을 통하여 BAAG가 강한 항균력이 있다는 것을 확인하였으나, 이로부터 항균물질을 분리동정하고 과채류에 직접 또는 포장소재로 적용할 수 있기까지는 많은 기초연구가 지속되어야 할 것으로 생각된다. BAAG의 항균 활성물질 및 그 작용기작을 확립하기 위해서는 먼저 항균작 용에 관여하는 BAAG의 항균작용을 분자구조적인 차원에서 이해하고 유효활성물질을 순수분리하여, 이들의 복합적인 작용기작을 조사하여 항균성분의 미생물 생육억제작용에 대한 다각적인 실험이 더 많이 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 이러한 포장소재는 수확후 과채류의 저장 및 유통기간 동안 변패 미생물의 발생을 억제하고, 호흡 작용을 통하여 방줄하는 숙성 호르 몬인 에틸렌가스나, 이산화탄소 및 산소를 흡수 제거하며, 과채류의 수분 손실을 최소화할 수 있어야 한다. 따라서 수확한 과채류의 품질과 부가가치를 향상시키는 하나의 수단 으로서 저장성 향상 및 선도 유지 방법의 개발이 요구된다. 과채류의 선도를 향상시키는 방안으로서는 안전성에서 우수한 천연 항균제를 이용하는 것이다.
- 이상과 같은 실험을 통하여 BAAG가 강한 항균력이 있다는 것을 확인하였으나, 이로부터 항균물질을 분리동정하고 과채류에 직접 또는 포장소재로 적용할 수 있기까지는 많은 기초연구가 지속되어야 할 것으로 생각된다. BAAG의 항균 활성물질 및 그 작용기작을 확립하기 위해서는 먼저 항균작 용에 관여하는 BAAG의 항균작용을 분자구조적인 차원에서 이해하고 유효활성물질을 순수분리하여, 이들의 복합적인 작용기작을 조사하여 항균성분의 미생물 생육억제작용에 대한 다각적인 실험이 더 많이 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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