치자 열매 추출물로부터 미백제 개발을 위해 항산화, 항균, 항암 등 생리활성을 가지는 치자로부터 tyrosinase 효소활성 저해와 B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과를 실험하였다. Tyrosine을 기질로 사용하여 ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate 용매 및 증류수 추출물에 대한 tyrosinase 효소 저해활성을 실험한 결과 에탄올 추출물 ($81.5{\pm}1.6\%$)이 증류수 추출물 ($62.7{\pm}0.4\%$)보다 더 우수한 효과를 보여주었다. Ethyl acetate 분획물의 tyrosinase 효소활성 저해율은 다른 유기용매 분획물보다 현저히 우수한 $99.7{\pm}0.1\%$나타내었으며, 현재 tyrosinase 저해제로 개발된 arbutin ($97.8{\pm}1.2\%$)과 유사한 저해활성을 보였다. B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과에서도 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 우수한 억제활성을 보여 주었다. Ethyl acetate 분획물을 사용하였을 경우, melanogenesis 억제 효과가 다른 분획물보다 현저히 우수하였다. 이상의 실험결과는 치자 추출물의 미백원료로서 사용 가능성을 보여주었다.
치자 열매 추출물로부터 미백제 개발을 위해 항산화, 항균, 항암 등 생리활성을 가지는 치자로부터 tyrosinase 효소활성 저해와 B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과를 실험하였다. Tyrosine을 기질로 사용하여 ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate 용매 및 증류수 추출물에 대한 tyrosinase 효소 저해활성을 실험한 결과 에탄올 추출물 ($81.5{\pm}1.6\%$)이 증류수 추출물 ($62.7{\pm}0.4\%$)보다 더 우수한 효과를 보여주었다. Ethyl acetate 분획물의 tyrosinase 효소활성 저해율은 다른 유기용매 분획물보다 현저히 우수한 $99.7{\pm}0.1\%$나타내었으며, 현재 tyrosinase 저해제로 개발된 arbutin ($97.8{\pm}1.2\%$)과 유사한 저해활성을 보였다. B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과에서도 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 우수한 억제활성을 보여 주었다. Ethyl acetate 분획물을 사용하였을 경우, melanogenesis 억제 효과가 다른 분획물보다 현저히 우수하였다. 이상의 실험결과는 치자 추출물의 미백원료로서 사용 가능성을 보여주었다.
To determine the inhibition of tyrosinase activity and melanogenesis, gardenia fruit was extracted initially with $95\%$ ethanol (w/v), The ethanol extract was fractionated subsequently with hexane, chloroform and ethyl acetate in that order. The inhibitory effect of the ethanol extract o...
To determine the inhibition of tyrosinase activity and melanogenesis, gardenia fruit was extracted initially with $95\%$ ethanol (w/v), The ethanol extract was fractionated subsequently with hexane, chloroform and ethyl acetate in that order. The inhibitory effect of the ethanol extract on tyrosinase activity was higher than water extract. When 10 mg/mL of ethyl acetate fraction was applied, the inhibition ratio of tyrosinase activity was much higher ($99.7{\pm}0.1\%$) than that of arbutin. The inhibition of melanogenesis using B16F10 melanoma cell, the ethanol extract also showed higher inhibitory effect than water extract. The highest inhibitory activity of melanogenesis was also shown in ethyl acetate fraction ($89.1{\pm}1.4\%$ at the cone. of $100\;{\mu}g/mL$). These results suggests that gardenia extracts might be used to be a potential agents for whitening.
To determine the inhibition of tyrosinase activity and melanogenesis, gardenia fruit was extracted initially with $95\%$ ethanol (w/v), The ethanol extract was fractionated subsequently with hexane, chloroform and ethyl acetate in that order. The inhibitory effect of the ethanol extract on tyrosinase activity was higher than water extract. When 10 mg/mL of ethyl acetate fraction was applied, the inhibition ratio of tyrosinase activity was much higher ($99.7{\pm}0.1\%$) than that of arbutin. The inhibition of melanogenesis using B16F10 melanoma cell, the ethanol extract also showed higher inhibitory effect than water extract. The highest inhibitory activity of melanogenesis was also shown in ethyl acetate fraction ($89.1{\pm}1.4\%$ at the cone. of $100\;{\mu}g/mL$). These results suggests that gardenia extracts might be used to be a potential agents for whitening.
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문제 정의
본 연구는 치자 열매의 추출 용매별 및 유기용매 분획 별로 in vitro tyrosinase 효소 활성 저해 및 B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 실험을 수행하였으며 미백제로의 사용 가능성에 대하여 연구하였다.
가설 설정
1) Concentration for measuring the inhibition ratio of melanogenesis was 10μg/mℓ.
제안 방법
5 mM tyrosine solution. 0.4 mL, 시료 용액 0.2 mL의 혼합액에 효소액 (100 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 30℃에서 5분간 반응 시켜 475 nm에서 UV-Vis spectrophotometer# 이용하여 홉 광도 (UV-Vis 160A, Shimadzu)를 측정한 후 다음 식에 의해 tyrosinase 효소 활성 저해율을 구하였다. 각 반응은 3회 이상 측정하였다.
용매 분획을 위하여 건조된 5 g의 에탄올 추출물을 500 mL의 증류수에 녹였다. Hexane 500 mL을 가하여 분획한 다음 hexane층을 분리한 후 극성 도가 높은 순서대로 chloroform, ethyl acetate를 이용하여 각각 분획한 후, 농축하여 동결 건조하였다 (Fig. 1). 각각의 건조 분획을 10 mg/mL의 농도가 되도록 DMSO에 녹여 시료로 사용하였다.
Tyrosine을 기질로 이용한 tyrosinase 효소 활성의 저해는 Ishihara 등(21)의 방법을 변형 시켜 사용하였다. Test tube에 0.
에탄올 추출은 치자 100 g에 1 L의 95% 에탄올을 첨가한 다음 80℃에서 10시간 동안 3회 반복 추출하였다. 각 추출물을 여과지 (Toyo filter No. 1)로 여과 후 감압농축 (Eyela N-1000) 하여 동결건조 (Bondiro, Ilsin)하였다. 용매 분획을 위하여 건조된 5 g의 에탄올 추출물을 500 mL의 증류수에 녹였다.
치자 열매를 증류수 또는 에탄올 용매로 사용하여 추출하였다. 증류수 주출은 치자 100 g에 증류수 1 L을 첨가한 후 12「C에서 3시간 동안 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출은 치자 100 g에 1 L의 95% 에탄올을 첨가한 다음 80℃에서 10시간 동안 3회 반복 추출하였다.
치자 열매 추출물로부터 미백제 개발을 위해 항산화, 항균, 항암 등 생리활성을 가지는 치자로부터 tyrosinase 효소 활성 저해와 B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과를 실험하였다. Tyrosine 을 기질로 사용하여 ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate 용매 및 증류수 추출물에 대한 tyrosinase 효소저해활성을 실험한 결과에탄올 추출물(81.
치자 열매를 증류수 또는 에탄올 용매로 사용하여 추출하였다. 증류수 주출은 치자 100 g에 증류수 1 L을 첨가한 후 12「C에서 3시간 동안 3회 반복 추출하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 치자 열매는 시중의 한약 건재상에서 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획에 사용된 ethyl alcohol, hexane, chloroform 및 ethyl acetate는 국산 일급 시약을 구 입하여 사용하였다. Tyrosinase 효소 활성 저해 실험을 위하여 사용된 mushroom tyrosinase는 Fluka사에서, tyrosine과 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), antibiotics와 trypsineGibco 사에서서 구입하여 사용하였으며, 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다.
본 실험에 사용한 치자 열매는 시중의 한약 건재상에서 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획에 사용된 ethyl alcohol, hexane, chloroform 및 ethyl acetate는 국산 일급 시약을 구 입하여 사용하였다. Tyrosinase 효소 활성 저해 실험을 위하여 사용된 mushroom tyrosinase는 Fluka사에서, tyrosine과 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다.
Tyrosinase 효소 활성 저해 실험을 위하여 사용된 mushroom tyrosinase는 Fluka사에서, tyrosine과 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), antibiotics와 trypsineGibco 사에서서 구입하여 사용하였으며, 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다.
한국 세포주 은행에서 분양받은 B16F10 mouse melanoma cell을 10% FBS, 1% antibiotics를 첨가한 DMEM 에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다(22). B16F10 melanoma cell의 melanin 생성 저해 평가는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
이론/모형
5일간 배양 후 phosphate buffered saline (PBS) 로 씻고 trypsinization 하였다. 세포를 coming tube에 모은 후 PBS 용액으로 씻고, 1 X 106 세포 수당 IN NaOH 용액 1 mL을 넣어 세포를 녹인 다음, UV-Vis spectrophotometer# 이용하여 490 nn】에서 홉 광도를 측정하여 melanogenesis 저해율을 구하였고(23), 세포독성은 MTT assay로 평가하였다(24). Inhibition of melanogenesis (%)=
성능/효과
B16F10 melanoma cell을 이용한 치자 추출물의 melanogenesis 저해 활성을 측정한 결과, 치자 에탄올 및 증류수 추출물의 melanogenesis 저해 활성은 34.3 ± 2.6% 및 55.9 ± 1.8%로 각각 나타내었으며, tyrosinase 효소 활성 억제와 같이 치자 에탄올 추출물의 melanogenesis 억제 활성이 더욱 우수하였다. 치자 hexane, chloroform 및 ethyl acetate 분획물의 melanogenesis 저해 활성은 51.
2%)과 유사한 저해 활성을 보였다. B16F10 m이anoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과에서도 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 우수한 억제 활성을 보여주 었다. Ethyl acetate 분획물을 사용하였을 경우, melanogenesis 억제 효과가 다른 분획물보다 현저히 우수하였다.
4%)보다 더 우수한 효과를 보여주었다. Ethyl acetate 분획물의 tyrosinase 효소활성 저해율은 다른 유기용 매 분획물보다 현저히 우수한 99.7 ±0.1%나타내었으며, 현재 tyrosinase 저해제로 개발된 arbutin (97.8 ± 1.2%)과 유사한 저해 활성을 보였다. B16F10 m이anoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과에서도 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 우수한 억제 활성을 보여주 었다.
치자 열매 추출물로부터 미백제 개발을 위해 항산화, 항균, 항암 등 생리활성을 가지는 치자로부터 tyrosinase 효소 활성 저해와 B16F10 melanoma cell을 이용한 melanogenesis 억제 효과를 실험하였다. Tyrosine 을 기질로 사용하여 ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate 용매 및 증류수 추출물에 대한 tyrosinase 효소저해활성을 실험한 결과에탄올 추출물(81.5 ± 1.6%)이 증류수 추출물(62.7 ± 0.4%)보다 더 우수한 효과를 보여주었다. Ethyl acetate 분획물의 tyrosinase 효소활성 저해율은 다른 유기용 매 분획물보다 현저히 우수한 99.
Ethyl acetate 분획물을 사용하였을 경우, melanogenesis 억제 효과가 다른 분획물보다 현저히 우수하였다. 이상의 실험결과는 치자 추출물의 미백 원료로서 사용 가능성을 보여 주었다.
8%로 각각 나타내었으며, tyrosinase 효소 활성 억제와 같이 치자 에탄올 추출물의 melanogenesis 억제 활성이 더욱 우수하였다. 치자 hexane, chloroform 및 ethyl acetate 분획물의 melanogenesis 저해 활성은 51.1 + 2.8, 12.9 ±3.1 및 89.1 ±1.4%로 각각 나타났으며, 치자 ethyl acetate 분획물의 활성이 가장 우수하였다(Table 2). 이는 tyrosinase 효소 활성 저해와 유사한 결과를 보여주었다.
치자 열매 추출물의 tyrosinase 효소 활성 저해는 tyrosine을 기질로 이용하여 측정하였다. 치자 에탄올 및 증류수 추출물의 tyrosinase 효소 활성 저해는 81.5 ± 1.6% 및 62.7 + 0.4%로 각각 나타나 치자 에탄올 추출물의 효소 저해 활성이 더욱 우수하였다. 치자 에탄올 추출물을 유기용매 hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 분획한 치자 유기용매 분획물의 tyrosinase 효소 활성 저해는 각각 72.
4%로 각각 나타나 치자 에탄올 추출물의 효소 저해 활성이 더욱 우수하였다. 치자 에탄올 추출물을 유기용매 hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 분획한 치자 유기용매 분획물의 tyrosinase 효소 활성 저해는 각각 72.6 ± 0.4, 59.9 ± 1.2 및 99.7 ± 0.1% 나타나 사용한 유기용매 중 ethyl acetate 분획물이 가장 우수한 저해 활성을 나타내었으며, 동일 농도의 arbutin의 97.8 + 1.2%와 비숫한 tyrosinase 효 소저해 활성을 나타내었다(Table 1). 한 등(18)의 연구에서 치자열매의 efhyl acetate 분획물이 실험에 사용한 다른 유기용매 분획물에 비해 지질 과산화 작용이 우수한 결과를 나타내어 ethyl acetate 분획물이 우수한 tyrosinase 저해 활성 결과와 일치하였다.
6%로 나타났으며, 이는 치자 ethyl acetate 분획물과 비슷한 저해 활성을 나타내었다. 치자 추출물 및 유기용매 분획물이 첨가된 B16F10 cell의 생육을 측정한 결과, 추출물 및 유기용매 분획물이 첨가되지 않은 대조군과 비슷한 생육 정도를 나타내어, 치자 추출물 및 유기용매 분획물의 B16F10 melanoma cell에 대한 세포 독성은 나타내지 않았다.
후속연구
이상의 결과로서 치자 ethyl acetate 분획물이 양성 대조군으로 사용한 arbutine 비슷한 tyrosinase 효소 활성 저해 및 B16F10 melanoma cell의 melanogenesis 저해를 나타내어, 추후 치자 성분의 분리 - 정제 및 임상실험의 유효성 시험을 통해 치자를 이용한 새로운 미백 원료 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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