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문제 정의
- 본 연구에서는 in vitro 항산화 활성을 간편하게 측정하는 방법으로 그 활성을 측정하여 치자의 식품 염료 및 항산화 식품으로서의 가능성에 대하여 알아보았다. 치자의 총 메탄올 추출물로부터 극성이 다른 여러 분획물들로 제조하여 nitrite 소거작용을 이용하여 발암 전 단계의 억제작용을 탐색하였고, ABTS radical cation 저해작용과 SOD 유사활성을 측정하여 그 항산화 활성을 살펴보았으며, 유지 산화 지연효과도 측정하였다.
제안 방법
- 55의 anomeric proton의 존재로 치자에서 분리되어온 iridoid 계통의 배당체임을 추측할 수 있었다. 1H-NMR spectra의 정밀 분석결과와 발표된 문헌치를 비교하여 geniposide로 동정하였다(21)(Table 1, Fig. 1).
- ABTS radical cation 저해작용 측정 실험은 Djeridane 등과 Ozcan Erel의 방법(17,18)을 변형하여 실험하였다. 증류수에 녹인 5 mM ABTS 용액 60 µL에 peroxidase 100 µL를 넣고 NaH2PO4와 Na2HPO4를 혼합하여 만든 50 mM sodium phosphate buffer 용액(pH 7.
- 가공하지 않은 palm oil을 이용하여 치자의 총 메탄올 추출물 125-1000 ppm의 산화 유도시간을 측정하여 AI값을 산출하였다. 130℃에서 시료를 첨가하지 않은 유지는 4.
- 9 mL를 취하여 24 mM pyrogallol 50 µL를 가한 후 420 nm에서 2분간의 흡광도 증가율을 측정하였다. 대조구는 시료대신 TCB 0.9 mL를 취하여 동일한 방법으로 흡광도 증가율을 측정하였다.
- 4 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 방치시킨 후 분광광도계를 이용하여 생성되는 azo화합물의 흡광도를 520 nm에서 측정하여 잔존하는 nitrite량을 비교하였다. 대조구로는 Griess 시약 대신 증류수를 0.4 mL 가하여 상기와 같은 방법으로 실시하였으며, nitrite 소거 작용은 화합물을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 흡광도 차이에 의한 백분율로 나타내었다.
- 4) 1920 µL를 첨가하여 진탕한 후 각 시료 추출물을 20 µL씩 넣어 섞어준 후 1 mM H2O2 용액 200 µL를 첨가하여 ABTS가 ABTS+로 변하면서 발현되는 청색이 시료 추출물 내의 항산화 물질에 의하여 감소되는 정도를 25℃, 734 nm에서 측정하였다. 대조구로는 시료대신 sodium phosphate buffer를 첨가하여 흡광도를 측정하였으며, 흡광도는 1분간 측정하되 결과치는 30초 후의 흡광도로 하였다.
- 이 때 발생하는 휘발성 산화 생성물을 70 mL 증류수가 들어있는 absorption vessel에 이행시켜 전기전도도의 변화에 따라 자동적으로 산출된 유도시간으로 항산화 정도를 측정하였다. 대조구로는 시료를 넣지 않은 순수한 DMSO 0.5 g에 유지 2g을 가하여 같은 방법으로 실시하였으며, 각각의 plot된 유도시간을 이용하여 sample의 antioxidative index(AI, 항산화제를 첨가한 유지의 산화 유도기간/항산화제를 첨가하지 않은 유지의 산화 유도기간) 값을 구하여 비교하였다. 또한, butylated hydroxy anisole(BHA)을 양성 대조군으로 이용하여 그 최종농도가 1000 ppm이 되도록 제조한 후 유지 산화유도 지연시간을 측정하여 치자의 유지 산화 지연효과를 비교하였다.
- 02 g을 얻어 이들 각 분획으로 nitrite 소거작용, ABTS radical cation 저해작용과 SOD 유사활성을 실험하였고, 양성대조군으로 cholorogenic acid와 vitamin C를 시료추출물과 같은 농도별로 제조하여 저해작용을 비교, 측정하였다. 또한 총 메탄올 추출물을 농도별로 희석하여 Rancimat을 이용한 유지 산화 지연효과를 측정하였다.
- 5 g에 유지 2g을 가하여 같은 방법으로 실시하였으며, 각각의 plot된 유도시간을 이용하여 sample의 antioxidative index(AI, 항산화제를 첨가한 유지의 산화 유도기간/항산화제를 첨가하지 않은 유지의 산화 유도기간) 값을 구하여 비교하였다. 또한, butylated hydroxy anisole(BHA)을 양성 대조군으로 이용하여 그 최종농도가 1000 ppm이 되도록 제조한 후 유지 산화유도 지연시간을 측정하여 치자의 유지 산화 지연효과를 비교하였다.
- 55의 anisaldehyde 발색시 황자색, long wave에서 blue형광, short wave에서 검게 보이는 단일물질로 확인되었다(compound I). 또한, 물 분획을 부탄올:아세트산:물(5:1:0.5) 용매계로 TLC를 이용하여 비교하면서 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 클로로포름:메탄올(5:1)에서 4개의 소분획을 얻었고 그 중 세 번째 소분획을 다시 클로로포름:메탄올:물(1:1:0.
- 흡광도 측정기기로는 UV Spectrometer(Shimadzu UVPC-2101, Kyoto, Japan), UV lamp(Spectroline ENE-260C, Westbury, NY, USA)와 ELISA Reader(Molecular Devices Thermomax microplate reader, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하였고, 구조분석을 위한 기기로 NMR(Bruker AMX 500 sptectrometer[500 MHz], Ettlingen, Germany)을 사용하였다. 또한, 유지 산화 지연효과를 측정하기 위한 기기로 Rancimat(Metrohm 679, Herisau, Swizerland)을 이용하였다.
- 치자의 총 메탄올 추출물로부터 극성이 다른 여러 분획물들로 제조하여 nitrite 소거작용을 이용하여 발암 전 단계의 억제작용을 탐색하였고, ABTS radical cation 저해작용과 SOD 유사활성을 측정하여 그 항산화 활성을 살펴보았으며, 유지 산화 지연효과도 측정하였다. 또한, 활성이 있는 분획의 주성분을 정제, 분리하여 1H-NMR을 이용하여 그 화학적 구조를 동정하고 표준품의 data와 비교함으로서 그 구조를 밝혔으며, 분리된 순수 물질의 활성을 각각 측정하여 항산화 기능성 식품 및 첨가제로서의 개발 가능성을 탐색하였다.
- 53에서의 두 개의 anomeric proton으로 disaccharide임을 알 수 있었다. 발표된 문헌치와 1H-NMR의 정밀 비교결과, 이 물질은 crocin으로 동정하고 authentic sample과 동일한 기기를 사용하여 1H-NMR spectra를 측정 비교하여 crocin으로 확정하였다(22)(Table 2, Fig. 1).
- 시료액 0.9 mL를 취하여 24 mM pyrogallol 50 µL를 가한 후 420 nm에서 2분간의 흡광도 증가율을 측정하였다.
- 치자의 부탄올 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 칼럼크로마토그래피를 수행하였다. 유출 용매는 클로로포름:메탄올(10:1)의 혼합용매를 시작으로 극성을 증가시키면서 순차적으로 용매를 유출시켜 TLC로 확인하면서 동일색의 형광을 가지며 Rf값이 같은 성분을 함유하는 6개의 소분획으로 분리하였다. 6개의 소분획 중 소분획 II를 silica gel로 충진시킨 후 클로로포름:메탄올(9:1) 용매계에서 재 분리하여 흰색의 분말을 얻었다.
- 5 g을 취한 후 130℃로 맞춘 aluminum heating block 상에서 시간당 20 L의 공기를 주입하며 산화시켰다. 이 때 발생하는 휘발성 산화 생성물을 70 mL 증류수가 들어있는 absorption vessel에 이행시켜 전기전도도의 변화에 따라 자동적으로 산출된 유도시간으로 항산화 정도를 측정하였다. 대조구로는 시료를 넣지 않은 순수한 DMSO 0.
- 21의 short wave에서 검게 보이는 단일물질을 얻었다(compound II). 이 물질을 1H-NMR spectra를 이용하여 그 구조를 동정하였다(50 MHz, 용매 DMSO-d6).
- 7 g을 얻었다. 이 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 용매극성에 따라 순차적으로 추출하여 헥산(n-hexane) 분획물 3.72 g, 클로로포름(CHCl3) 분획물 2.03 g, 부탄올(n-BuOH) 분획물 27.48 g과 물(H2O) 분획물 30.02 g을 얻어 이들 각 분획으로 nitrite 소거작용, ABTS radical cation 저해작용과 SOD 유사활성을 실험하였고, 양성대조군으로 cholorogenic acid와 vitamin C를 시료추출물과 같은 농도별로 제조하여 저해작용을 비교, 측정하였다. 또한 총 메탄올 추출물을 농도별로 희석하여 Rancimat을 이용한 유지 산화 지연효과를 측정하였다.
- 5로 조절하여 반응용액을 10 mL로 하였다. 이용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액을 1 mL씩 취하여 2% 초산용액 5 mL와 Griess 시약(30% HCl으로 제조한 1% naphthylamine과 1% sulfanilic acid의 1:1 혼액) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 방치시킨 후 분광광도계를 이용하여 생성되는 azo화합물의 흡광도를 520 nm에서 측정하여 잔존하는 nitrite량을 비교하였다. 대조구로는 Griess 시약 대신 증류수를 0.
- 증류수에 녹인 5 mM ABTS 용액 60 µL에 peroxidase 100 µL를 넣고 NaH2PO4와 Na2HPO4를 혼합하여 만든 50 mM sodium phosphate buffer 용액(pH 7.4) 1920 µL를 첨가하여 진탕한 후 각 시료 추출물을 20 µL씩 넣어 섞어준 후 1 mM H2O2 용액 200 µL를 첨가하여 ABTS가 ABTS+로 변하면서 발현되는 청색이 시료 추출물 내의 항산화 물질에 의하여 감소되는 정도를 25℃, 734 nm에서 측정하였다.
- 치자의 부탄올 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 칼럼크로마토그래피를 수행하였다. 유출 용매는 클로로포름:메탄올(10:1)의 혼합용매를 시작으로 극성을 증가시키면서 순차적으로 용매를 유출시켜 TLC로 확인하면서 동일색의 형광을 가지며 Rf값이 같은 성분을 함유하는 6개의 소분획으로 분리하였다.
- 본 연구에서는 in vitro 항산화 활성을 간편하게 측정하는 방법으로 그 활성을 측정하여 치자의 식품 염료 및 항산화 식품으로서의 가능성에 대하여 알아보았다. 치자의 총 메탄올 추출물로부터 극성이 다른 여러 분획물들로 제조하여 nitrite 소거작용을 이용하여 발암 전 단계의 억제작용을 탐색하였고, ABTS radical cation 저해작용과 SOD 유사활성을 측정하여 그 항산화 활성을 살펴보았으며, 유지 산화 지연효과도 측정하였다. 또한, 활성이 있는 분획의 주성분을 정제, 분리하여 1H-NMR을 이용하여 그 화학적 구조를 동정하고 표준품의 data와 비교함으로서 그 구조를 밝혔으며, 분리된 순수 물질의 활성을 각각 측정하여 항산화 기능성 식품 및 첨가제로서의 개발 가능성을 탐색하였다.
- 치자의 항산화 활성과 유지산화 지연효과를 측정하고 활성을 보인 분획에서 주성분인 geniposide와 crocin을 분리하고 그 구조를 확인하였다. 여러 분획 중 부탄올 분획과 물 분획의 항산화성이 가장 우수함을 확인하고 그 분획의 주성분으로 분리된 geniposide와 crocin의 단일물질로서의 항산화력을 측정 비교한 결과, crocin의 항산화력이 더 강함을 알 수 있었다.
대상 데이터
- , Piscataway, NJ, USA)를 사용하였으며 박층크로마토그래피 발색시약인 anisaldehyde는 Fluka Co.(Buchs, Switzerland) 제품을 사용하였다. 흡광도 측정기기로는 UV Spectrometer(Shimadzu UVPC-2101, Kyoto, Japan), UV lamp(Spectroline ENE-260C, Westbury, NY, USA)와 ELISA Reader(Molecular Devices Thermomax microplate reader, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하였고, 구조분석을 위한 기기로 NMR(Bruker AMX 500 sptectrometer[500 MHz], Ettlingen, Germany)을 사용하였다.
- Lous, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Sodium nitrite, sulfanilic acid, sodium phosphate buffer, hydrogen peroxide 및 dimethyl sulfoxide는 Junsei Chemical(Tokyo, Japan)의 것을 사용하였다. 치자의 농축을 위하여 evaporator(EYELA Unitrap UT-1000, Tokyo, Japan)를 사용하였으며, 추출 및 컬럼크로마토그래피용 용매는 1급 시약(Daejung Chemical, Seoul, Korea)을 1차 증류하여 사용하였고 분석을 위한 기타 시약 모두 1급 이상의 등급을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 치자는 전남 해남군 소재로 건조 상태인 것을 서울 경동시장 한약 건재상에서 2006년 9월에 구입하여 사용하였다.
- 항산화 활성 측정용 시약으로 chlorogenic acid, ascorbic acid, peroxidase, naphtylamine, pyrogallol, cacodylic acid, tris-base와 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)는 Sigma Chemical(St. Lous, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- (Buchs, Switzerland) 제품을 사용하였다. 흡광도 측정기기로는 UV Spectrometer(Shimadzu UVPC-2101, Kyoto, Japan), UV lamp(Spectroline ENE-260C, Westbury, NY, USA)와 ELISA Reader(Molecular Devices Thermomax microplate reader, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하였고, 구조분석을 위한 기기로 NMR(Bruker AMX 500 sptectrometer[500 MHz], Ettlingen, Germany)을 사용하였다. 또한, 유지 산화 지연효과를 측정하기 위한 기기로 Rancimat(Metrohm 679, Herisau, Swizerland)을 이용하였다.
데이터처리
- 각 시료들의 실험 결과들은 mean±SD치로 표시하였고 각 실험 결과의 통계적 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구(blank control)와 비교하여 “student t-test”에 의하여 판정하였으며 p값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- Rancimat을 이용하여 유지의 산화 지연효과를 측정한 방법은 Chon 등의 방법(20)으로 temperature 130℃, conductivity range 20 us/cm, chart speed 1 cm/hr, cell constants(C)=0.82/cm−1, measuring time=10 hr로 조건을 맞추고 측정하였다.
- SOD 유사활성은 Marklund 등의 방법(19)에 따라 측정하였다. 추출한 시료 20 g에 50 mM Tris-cacodylic acid buffer(TCB, pH 8.
- 각 시료의 nitrite 소거작용은 Kato 등의 방법(16)에 의하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mM NaNO2 용액 2 mL에 시료 추출물 0.
성능/효과
- 가공하지 않은 palm oil을 이용하여 치자의 총 메탄올 추출물 125-1000 ppm의 산화 유도시간을 측정하여 AI값을 산출하였다. 130℃에서 시료를 첨가하지 않은 유지는 4.28시간에 산화 되었으나 치자의 총 메탄올 추출물을 첨가하여 측정한 결과, 최종농도가 1000 ppm이 되도록 한 유지에서 12.53시간, 500 ppm의 유지 10.05시간, 250 ppm의 유지 7.75시간, 125 ppm의 유지에서 6.24시간에 산화되어 그 AI값이 각각 2.93, 2.35, 1.81 및 1.46으로 인공항산화제 BHA 1000 ppm 첨가 유지의 AI값 1.66에 비하여 치자 총 메탄올 추출물의 유지 산화 지연 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(Table 6).
- 양성 대조군으로 사용한 chlorogenic acid와 vitamin C의 IC50값은 각각 13 ppm과 15 ppm이었으며, compound I의 IC50값은 940 ppm, compound II는 77 ppm임을 확인하였다. Compound II는 비록 양성 대조군 보다 nitrite 소거활성이 뛰어나지는 않으나 우수한 활성을 가지고 있었으며 치차 추출물의 nitrite 소거작용을 나타내는 주 활성성분 중의 하나임을 알 수 있었다(Fig. 5, Fig. 2).
- Compound I과 compound II의 SOD 유사활성을 측정한 결과 compound I은 2000 ppm에서도 활성을 보이지 않았으나 compound II는 용매 분획물들의 유사활성보다 더욱 우수하여 총 메탄올 추출물의 500 ppm의 67.8% 보다 높은 87.5%를 나타내었다. Compound I의 EC50값은 측정할 수 없었으나 compound II의 EC50은 259 ppm으로 양성대조군인 chlorogenic acid의 EC50값 453 ppm에 비하여 그 활성이 높았다(Fig.
- Compound I의 ABTS radical cation 저해작용 측정 시 1000 ppm에서도 저해활성이 상승함을 확인하여 2000 ppm까지 농도를 높여 측정한 결과, 1500 ppm에서 80.9%의 저해활성을 보였고 2000 ppm에서도 유사한 활성을 보임을 알 수 있었다. Compound II는 1500 ppm에서 99.
- SOD 유사활성은 nitrite 소거작용과 ABTS radical cation 저해 작용에 비하여 상대적으로 높은 농도에서 활성이 나타났다. 총 메탄올 추출물이 1000 ppm에서 99.
- SOD 유사활성은 총 메탄올 추출물에 비하여 분획물에서의 활성이 더 낮았다. 이러한 결과는 치자의 SOD 유사활성이 한 종의 주된 활성성분에 기인하지 않고 적은 양의 몇 종의 활성물질에 의해서 활성이 나타나며, 분획 과정 중에 이들이 흩어지면서 활성이 약해져 나타나는 경우라고 사료된다.
- 5) 용매계로 TLC를 이용하여 비교하면서 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 클로로포름:메탄올(5:1)에서 4개의 소분획을 얻었고 그 중 세 번째 소분획을 다시 클로로포름:메탄올:물(1:1:0.5)로 확인한 결과 Rf값 0.21의 short wave에서 검게 보이는 단일물질을 얻었다(compound II). 이 물질을 1H-NMR spectra를 이용하여 그 구조를 동정하였다(50 MHz, 용매 DMSO-d6).
- 3%의 저해활성을 나타내 총 추출물 포함 모든 분획물 중 최대 활성을 나타냈다. 물 분획은 1000 ppm에서도 계속 저해활성이 증가되어 1000 ppm에서는 78.6%였으나 1500 ppm에서 96.2%의 최고 저해활성을 보임을 확인할 수 있었다(Table 4). 양성 대조군으로 사용한 chlorogenic acid와 vitamin C는 50 ppm과 20 ppm에서 각각 95.
- 9%의 높은 저해활성을 보였으며 IC50값은 159 ppm으로 분획 중 가장 낮은 IC50값을 나타내었다. 부탄올 분획 역시 농도 증가에 따라 저해활성이 증가하는 양상을 보였으며 500 ppm에서 96.3%의 저해활성을 나타내 총 추출물 포함 모든 분획물 중 최대 활성을 나타냈다. 물 분획은 1000 ppm에서도 계속 저해활성이 증가되어 1000 ppm에서는 78.
- 2%의 높은 소거활성을 보였으나 1000 ppm의 더 높은 농도에서 활성이 증가하지 않았으며 IC50값은 336 ppm이었다. 부탄올 분획과 물 분획은 1000 ppm에서 각각 97.8%, 94.2%의 높은 소거능을 보였으며 IC50값 또한 183 ppm, 194 ppm으로 총 메탄올 추출물의 IC50값과 유사하여 이들이 치차의 nitrite 소거작용의 주 활성 분획물임을 알 수 있었다(Table 3). 같은 조건에서 양성 대조군으로 사용한 chlorogenic acid와 vitamin C의 IC50값은 각각 15 ppm과 13 ppm으로 치차 추출물 및 분획물의 활성은 이에는 미치지 못했다(Fig.
- 8%로 가장 높은 활성을 보였으나 헥산 분획과 클로로포름 분획은 2000 ppm에서도 활성을 보이지 않았다. 부탄올 분획은 2000 ppm에서 50.1%의 활성이 나타났고 물 분획은 500 ppm부터 활성이 증가하여 2000 ppm에서 93.8%의 활성을 보여 분획물 중 가장 우수한 SOD 유사활성을 보였다(Table 5). 총 메탄올 추출물의 EC50값은 323 ppm으로 분획 중에서 가장 높은 활성을 나타내어 양성 대조군인 chlorogenic acid의 EC50값 453 ppm보다도 높은 유사활성이 확인되었다.
- 2%의 최고 저해활성을 보임을 확인할 수 있었다(Table 4). 양성 대조군으로 사용한 chlorogenic acid와 vitamin C는 50 ppm과 20 ppm에서 각각 95.9%, 96.6%의 최고의 저해활성을 보였고 이들의 IC50 값은 각각 17 ppm, 12 ppm으로 측정되었다(Fig. 3).
- 4%를 나타내었다. 양성 대조군으로 사용한 chlorogenic acid와 vitamin C의 IC50값은 각각 13 ppm과 15 ppm이었으며, compound I의 IC50값은 940 ppm, compound II는 77 ppm임을 확인하였다. Compound II는 비록 양성 대조군 보다 nitrite 소거활성이 뛰어나지는 않으나 우수한 활성을 가지고 있었으며 치차 추출물의 nitrite 소거작용을 나타내는 주 활성성분 중의 하나임을 알 수 있었다(Fig.
- 치자의 항산화 활성과 유지산화 지연효과를 측정하고 활성을 보인 분획에서 주성분인 geniposide와 crocin을 분리하고 그 구조를 확인하였다. 여러 분획 중 부탄올 분획과 물 분획의 항산화성이 가장 우수함을 확인하고 그 분획의 주성분으로 분리된 geniposide와 crocin의 단일물질로서의 항산화력을 측정 비교한 결과, crocin의 항산화력이 더 강함을 알 수 있었다. 특히 SOD 유사활성 시험에서 여러 분획의 활성이 총 메탄올 추출물보다도 낮음에 비하여 crocin 단일 물질은 양성 대조군 cholorogenic acid의 EC50 값 453 ppm에 비하여 절반정도 낮은 EC50값 259 ppm으로 매우 높은 활성을 보였다.
- 특히 SOD 유사활성 시험에서 여러 분획의 활성이 총 메탄올 추출물보다도 낮음에 비하여 crocin 단일 물질은 양성 대조군 cholorogenic acid의 EC50 값 453 ppm에 비하여 절반정도 낮은 EC50값 259 ppm으로 매우 높은 활성을 보였다. 유지 산화 지연효과도 치자의 총 메탄올 추출물 250 ppm 이상의 농도에서의 AI값은 BHA 1000 ppm에서의 AI값 1.66 보다 큰 1.81 이상임을 보여 유지 산화 지연효과가 우수함을 나타내었다. 이 논문의 연구결과로 치자의 항산화 기능성 식품 및 첨가제로서의 개발가능성이 확인되었다고 사료된다.
- 이 물질은 그 발색 양상과 1H-NMR spectra의 특징적인 δ3.70에서의 singlet, δ4.30에서의 J=14.4의 doublet과 δ5.16에서의 J=7.55의 anomeric proton의 존재로 치자에서 분리되어온 iridoid 계통의 배당체임을 추측할 수 있었다.
- 이 물질의 1H-NMR spectra로 δ2.01에서의 두 개의 methyl singlet, δ6.49-δ7.43에서의 conjugated polyene의 존재를 예측할 수 있었으며 전체적인 peak type은 분자내의 symmetric two-fold axis가 존재함을 보여주었다.
- 6개의 소분획 중 소분획 II를 silica gel로 충진시킨 후 클로로포름:메탄올(9:1) 용매계에서 재 분리하여 흰색의 분말을 얻었다. 이 분말을 클로로포름:메탄올(3:1) 용매계에서 TLC로 확인한 결과 Rf값 0.55의 anisaldehyde 발색시 황자색, long wave에서 blue형광, short wave에서 검게 보이는 단일물질로 확인되었다(compound I). 또한, 물 분획을 부탄올:아세트산:물(5:1:0.
- 총 메탄올 추출물은 1000 ppm에서 89.2%의 nitrite 소거작용을 나타내었으며, IC50값은 180 ppm이었다. 헥산 분획을 제외한 나머지 분획은 대부분 농도가 높아질수록 소거활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
- 8%의 활성을 보여 분획물 중 가장 우수한 SOD 유사활성을 보였다(Table 5). 총 메탄올 추출물의 EC50값은 323 ppm으로 분획 중에서 가장 높은 활성을 나타내어 양성 대조군인 chlorogenic acid의 EC50값 453 ppm보다도 높은 유사활성이 확인되었다. 같은 조건에서 vitamin C의 EC50값은 22 ppm이었다(Fig.
- SOD 유사활성은 nitrite 소거작용과 ABTS radical cation 저해 작용에 비하여 상대적으로 높은 농도에서 활성이 나타났다. 총 메탄올 추출물이 1000 ppm에서 99.8%로 가장 높은 활성을 보였으나 헥산 분획과 클로로포름 분획은 2000 ppm에서도 활성을 보이지 않았다. 부탄올 분획은 2000 ppm에서 50.
- 치자 총 메탄올 추출물은 250 ppm부터 저해활성이 상승하여 1000 ppm에서 93.6%의 저해작용을 보였고 헥산 분획에서는 모든 농도에서 저해 효과가 나타나지 않았다. 클로로포름 분획에서는 500 ppm에서 94.
- 치자에서 분리한 compound I과 II의 nitrite 소거작용을 확인한 결과 compound I은 1000 ppm에서 53.0%의 nitrite 소거작용을 나타냈으며 compound II는 같은 농도에서 93.4%를 나타내었다. 양성 대조군으로 사용한 chlorogenic acid와 vitamin C의 IC50값은 각각 13 ppm과 15 ppm이었으며, compound I의 IC50값은 940 ppm, compound II는 77 ppm임을 확인하였다.
- 6%의 저해작용을 보였고 헥산 분획에서는 모든 농도에서 저해 효과가 나타나지 않았다. 클로로포름 분획에서는 500 ppm에서 94.9%의 높은 저해활성을 보였으며 IC50값은 159 ppm으로 분획 중 가장 낮은 IC50값을 나타내었다. 부탄올 분획 역시 농도 증가에 따라 저해활성이 증가하는 양상을 보였으며 500 ppm에서 96.
- 25 ppm에서 50%의 소거작용을 보이는 것을 시작으로 농도가 높아질수록 실험 용액이 점점 탁해짐을 육안으로 확인할 수 있었고 흡광도도 다소 불규칙하였다. 클로로포름 분획은 500 ppm에서 80.2%의 높은 소거활성을 보였으나 1000 ppm의 더 높은 농도에서 활성이 증가하지 않았으며 IC50값은 336 ppm이었다. 부탄올 분획과 물 분획은 1000 ppm에서 각각 97.
- 여러 분획 중 부탄올 분획과 물 분획의 항산화성이 가장 우수함을 확인하고 그 분획의 주성분으로 분리된 geniposide와 crocin의 단일물질로서의 항산화력을 측정 비교한 결과, crocin의 항산화력이 더 강함을 알 수 있었다. 특히 SOD 유사활성 시험에서 여러 분획의 활성이 총 메탄올 추출물보다도 낮음에 비하여 crocin 단일 물질은 양성 대조군 cholorogenic acid의 EC50 값 453 ppm에 비하여 절반정도 낮은 EC50값 259 ppm으로 매우 높은 활성을 보였다. 유지 산화 지연효과도 치자의 총 메탄올 추출물 250 ppm 이상의 농도에서의 AI값은 BHA 1000 ppm에서의 AI값 1.
- 헥산 분획을 제외한 나머지 분획은 대부분 농도가 높아질수록 소거활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 헥산 분획은 31.25 ppm에서 50%의 소거작용을 보이는 것을 시작으로 농도가 높아질수록 실험 용액이 점점 탁해짐을 육안으로 확인할 수 있었고 흡광도도 다소 불규칙하였다. 클로로포름 분획은 500 ppm에서 80.
후속연구
- 81 이상임을 보여 유지 산화 지연효과가 우수함을 나타내었다. 이 논문의 연구결과로 치자의 항산화 기능성 식품 및 첨가제로서의 개발가능성이 확인되었다고 사료된다.
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