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문제 정의
- 위장 보호 효능평가로 위점막(gastric mucosa)에 존재하면서 만성위 염 (chronic gastritis), 십이지장궤양(ulcer) 등의 질환을 유발시키는 Helicobacter 奶0机15)에 대한 항균효과와 이 균이 분비하는 효소 urease(16, 17)에 대한 활성 저해를 시험하였다. 또한 프리라디칼 소거작용(fee radical scavenging)과 사람 적혈구상에서 활성산소《O2, singlet oxy gen)로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과를 시험하여 간접적인 위점막세포 보호능을 시험하였고 이러한 결과들을 바탕으로 민들레 분획물의 위장보호제로서의 가능성을 살펴보았다.
- 또한, 이 실험법을 이용하여, 천연물을 대상으로 활성산소에 의한 세포 손상(또는 파괴)에 대한 보호효과를 측정할 수 있다. 본 실험 에서는 H. pylori 균에 의해 생성되는 활성산소 소거능을 광용 혈실험으로 측정하여 간접적인 위장보호 효과를 알아보았다.H.
- 본 연구에서는 민들레의 단순 추출물로부터 제조된 민들레 추출분획물이 위장보호제로서의 잠재적인 가능성을 알아보기 위한 일련의 실험들을 수행하였다. 우선 민들레의 total ethanol 추출물을 여러 용매들을 이용하여 순차적으로 분획하고 각 분획물의 총 플라보노이드와 luteolin의 함량을 분석하였다.
제안 방법
- (Taraxacum mongolicum H.) 주줄물에 대한 위장보호효과를 측정하기 위하여 민들레를 ethanol로 추출한 후 methylene chloride과 n-butan이을 이용하여 용매의 극성에 따라 순차적으로 추출물을 분획하여 각 분획물을 얻었다. 이들 분획물로 총 플라보노이드 및 luteolin 함량을 측정하고 H.
- 10%의 소혈청이 첨가된 Brucella 배지에 H. pylori 219균을 도말하고, 37oC, 10% CO2 조건에서 2-3일 배양 후 이 균을 새 Brucella 배지에 다시 도말하였다. 각 분획물을 0.
- Luteoline 민들레의 플라보노이드 성분 중의 하나로 지표물질로 선택하기 위하여 함량을 분석하였다. 결과는 Table 2에 나타내었고, HPLC chromatogram을 Fig.
- 효소반응 개시 후, 정확히 10분간 반응 시키고, 100mM 염산용액을 이용하여 측정된 초기 pH가 되도록 하고, 이때 사용된 염산 용액의 양을 정량 측정하였다. Urease 억제 활성은 대조구에 대한 상대 활성 억제효과로 나타내었으며 저해율의 계산은(1 - 시료의 염산 사 용량/대조구의 염산 사용량)X100으로 계산하였다.
- pylori 219균을 도말하고, 37oC, 10% CO2 조건에서 2-3일 배양 후 이 균을 새 Brucella 배지에 다시 도말하였다. 각 분획물을 0.01, 0.25, 0.5%, 그리고 1%의 농도로 ethan이로 희석한 후 20 |1L씩 디스크 종이에 처리하여 상온에서 건조시켰다. 건조된 디스크 종이를 H.
- 얻어진 각 분획물에 대한 총 플라보노이드의 함량 측정은 Zhishen 등(18, 19)의 방법을 개량하여 이용하였다. 각 희석된 표 준용액 및 측정 용액 2.5 mL를 10mL 증류수가 들어있는 용량 플라스크에 넣고 0.75 mg 5% NaNO2 시약을 첨가하여 5분 동안 섞는 후 다시 0.75 mg 10% AlCl3 시약을 넣고 6분 동안 섞어주었匸上 그 후 4 mg 1N NaOH 용액을 가하고 증류수로 25mL로 채워 실온에서 1분간 반응시킨 후, 500 nm의 파장에서 각 용액의 흡광도를 측정하였다. 표준용액은 catechin (5, 10, 15, 20mg/100mL)를 이용하고 총 플라보노이드 양은 catechin 의 농도와 상응하는 값으로 나타내었다.
- 간접적인 H. pylori의 항균효과를 알아보기 위한 방법으로 각 분획물의 urease 저해효과를 즉정하였다. 본 실험에 사용한 방법은 Gorin과 Chin 방법(22)을 개량한 것으로, urea가 urease에 의해 분해되면서 CO2와 NH3가 생성되는데, 이때 생성된 NH3 를 HCl로 정량하여 효소의 활성을 측정하는 방법이다.
- 5%, 그리고 1%의 농도로 ethan이로 희석한 후 20 |1L씩 디스크 종이에 처리하여 상온에서 건조시켰다. 건조된 디스크 종이를 H.pylori 219 균이 도말되어 있는 dish에 얹고, 37oC, 10% CO2 조건에서 3일 배양하여 clear zone(억제대, 또는 억제영역) 형성을 관찰하였다.
- 5 mL의 rose bengal(12 μM)를 가하고, 파라필름(Parafilm, Whatman Laboratory, USA)으로 입구를 봉한 후 15분간 광조사(photo radiation) 하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50X20X 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분간 광조사 하였다. 조사가 끝난 후 암반응(post-incubation)에 의한 적혈구의 파괴정도를 15분 간격으로 700nm에서 투광도(transmittance)로부터 측정하였다.
- 광증감제인 Rose bengal의 존재하에서 광조사로 활성산소를 유도시켜 이로부터 적혈구막 보호효과를 적혈구의 용혈정도로 측정하였다. 대조군의 경우 적혈구 세포가 50% 용혈되는데 걸리는 시간은 25분으로 나타났다.
- 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 파괴 정 도에 비례한다. 모든 실험은 20oC 항온실에서 수행하였다. 민들레 분획물들이 광용혈에 미치는 효과는 광조사 후 암반응 시간에 따른 용혈정도를 나타낸 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 T50을 구하여 비교하였다
- 모든 실험은 20oC 항온실에서 수행하였다. 민들레 분획물들이 광용혈에 미치는 효과는 광조사 후 암반응 시간에 따른 용혈정도를 나타낸 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 T50을 구하여 비교하였다
- pylori는 위점막(gastric mucosa)에 존재하면서 만성위염, 위, 십이지장궤양 등의 위장 질환을 유발시키는 미생물로 알려지고 있는데(15, 26), 십이지장 궤양의 90-95%, 위궤양의 60-80%에서 이 균이 발견되었다는 보고가 이를 뒷받침하고 있다. 민들레 추출분획물의 H. pylori 219에 대한 항균효과는 clear zone의 지름 길이로 비교하였다. 억제 효과가 없을 경우, clear zone의 크기는 디스크 종이의 지름인 8mm이다.
- 생체대사과정이나 스트레스, 염증 등으로부터 생성되는 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 DPPH(1, 1-diphenyl-2-picryl hydra-zyl) 라디칼을 이용하여 각각의 분획물에 대해 소거활성을 측정하였다. DPPH는 안정한 라디칼로 홀수 전자에 의해 517 nm 부근에서 최대 흡수를 나타내는데, 전자 또는 수소를 받아 환원되면 다시 산화되기 어려워진다.
- 각 분획물을 ethanol 용액으로 희석하여 1%가 되게 한 후 50 |1L씩 첨가하였다. 암소에서 30분간 전반응(pre-incubation)을 시킨 후 광증감제로 0.5 mL의 rose bengal(12 μM)를 가하고, 파라필름(Parafilm, Whatman Laboratory, USA)으로 입구를 봉한 후 15분간 광조사(photo radiation) 하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50X20X 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분간 광조사 하였다.
- 얻어진 각 분획물에 대한 총 플라보노이드의 함량 측정은 Zhishen 등(18, 19)의 방법을 개량하여 이용하였다. 각 희석된 표 준용액 및 측정 용액 2.
- 본 연구에서는 민들레의 단순 추출물로부터 제조된 민들레 추출분획물이 위장보호제로서의 잠재적인 가능성을 알아보기 위한 일련의 실험들을 수행하였다. 우선 민들레의 total ethanol 추출물을 여러 용매들을 이용하여 순차적으로 분획하고 각 분획물의 총 플라보노이드와 luteolin의 함량을 분석하였다. 위장 보호 효능평가로 위점막(gastric mucosa)에 존재하면서 만성위 염 (chronic gastritis), 십이지장궤양(ulcer) 등의 질환을 유발시키는 Helicobacter 奶0机15)에 대한 항균효과와 이 균이 분비하는 효소 urease(16, 17)에 대한 활성 저해를 시험하였다.
- 우선 민들레의 total ethanol 추출물을 여러 용매들을 이용하여 순차적으로 분획하고 각 분획물의 총 플라보노이드와 luteolin의 함량을 분석하였다. 위장 보호 효능평가로 위점막(gastric mucosa)에 존재하면서 만성위 염 (chronic gastritis), 십이지장궤양(ulcer) 등의 질환을 유발시키는 Helicobacter 奶0机15)에 대한 항균효과와 이 균이 분비하는 효소 urease(16, 17)에 대한 활성 저해를 시험하였다. 또한 프리라디칼 소거작용(fee radical scavenging)과 사람 적혈구상에서 활성산소《O2, singlet oxy gen)로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과를 시험하여 간접적인 위점막세포 보호능을 시험하였고 이러한 결과들을 바탕으로 민들레 분획물의 위장보호제로서의 가능성을 살펴보았다.
- 45 μm 필터로 여과하여 검액으로 사용하였다.이동상으로 acetonitrile:water: acetic acid = 350 : 745 : 5(v/v), 유속 1.0 mL/min, 파장 360 nm(PDA detector)의 조건에서 검 액20 |1L를 주입 한 후 함량을 분석하였다.
- ) 주줄물에 대한 위장보호효과를 측정하기 위하여 민들레를 ethanol로 추출한 후 methylene chloride과 n-butan이을 이용하여 용매의 극성에 따라 순차적으로 추출물을 분획하여 각 분획물을 얻었다. 이들 분획물로 총 플라보노이드 및 luteolin 함량을 측정하고 H. pylori 항균작용, urease 저해 효과, 프리라디칼소거작용, 세포막 보호 효과에 대해 시험하였다. 각 분획물의 총 플라보노이드와 luteolin 함량을 측정을 한 결과 n-butanol 분획에서 각각 27.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50X20X 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분간 광조사 하였다. 조사가 끝난 후 암반응(post-incubation)에 의한 적혈구의 파괴정도를 15분 간격으로 700nm에서 투광도(transmittance)로부터 측정하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 파괴 정 도에 비례한다.
- 적혈구는 사람 혈액으로부터 분리하였다. 채혈 즉시 헤파린(20units/mL)이 첨가된 시험관에 넣고 3,000rpm에서 5분간 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.9% 생리식염수(phosphate buffered saline, 이하 PBS)로 세척하고 흰색의 백혈구층을 제거하였다. 이 과정을 3회 반복하여 분리한 적혈구를 4oC의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 시험은 채혈 후 12시간 이내에 행하였다.
- 4 mL를 첨가하고, 초기 pH를 측정하였다. 효소반응 개시 후, 정확히 10분간 반응 시키고, 100mM 염산용액을 이용하여 측정된 초기 pH가 되도록 하고, 이때 사용된 염산 용액의 양을 정량 측정하였다. Urease 억제 활성은 대조구에 대한 상대 활성 억제효과로 나타내었으며 저해율의 계산은(1 - 시료의 염산 사 용량/대조구의 염산 사용량)X100으로 계산하였다.
대상 데이터
- )는 강원도 양양에서 재배 및 건조한 것을 구매하였으며, 모든 추출용 용매는 최상급을 사용하였다. 1, 1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), rose bengal, urease, albumin, catechin, 그리고 luteolin 은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, 소혈청 (calf serum)은 Gibco-Invitrogen사(Grand Island, NY, USA), Brucella 배지는 Difco Laboratories사(Sparks, MD,A)의 제품을 사용하였다. Luteolin 함량 분석을 위한 분리columne 일본 Shiseidc사의 Capcell Pak C18을, HPLC는 Shi- madzu CLASS-VP를 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, 소혈청 (calf serum)은 Gibco-Invitrogen사(Grand Island, NY, USA), Brucella 배지는 Difco Laboratories사(Sparks, MD,A)의 제품을 사용하였다. Luteolin 함량 분석을 위한 분리columne 일본 Shiseidc사의 Capcell Pak C18을, HPLC는 Shi- madzu CLASS-VP를 사용하였다. UV-Visible 분광측정기는 Hewlett Packard-8453을 사용하였고, 적혈구 광용혈 실험에는 Spectronic 20D+(Milton Roy)를 이용하였다.
- UV-Visible 분광측정기는 Hewlett Packard-8453을 사용하였고, 적혈구 광용혈 실험에는 Spectronic 20D+(Milton Roy)를 이용하였다. 또한, 본 연구에서사용한 H. pylori 219는 경상대학교 의과대학 미생물학교실에서 제공받아 이용하였다.
- 본 실험에서 사용한 민들레 (Traxacum mongolicum H.)는 강원도 양양에서 재배 및 건조한 것을 구매하였으며, 모든 추출용 용매는 최상급을 사용하였다. 1, 1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), rose bengal, urease, albumin, catechin, 그리고 luteolin 은 Sigma-Aldrich사(St.
이론/모형
- 3. Free radical scavenging activities of solvent fractions from Taraxacum mongolicum H. using DPPH method.
- Luteolin 함량 분석을 위한 분리columne 일본 Shiseidc사의 Capcell Pak C18을, HPLC는 Shi- madzu CLASS-VP를 사용하였다. UV-Visible 분광측정기는 Hewlett Packard-8453을 사용하였고, 적혈구 광용혈 실험에는 Spectronic 20D+(Milton Roy)를 이용하였다. 또한, 본 연구에서사용한 H.
- 각 분획을 Fujita 등(23)의 방법에 의한 DPPH(1, 1-diphenyl2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거법으로 각 분획의 활성을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 ethan이에 녹여 2mL가 되게 하고, 1mL의 2mM DPPH/ethan이을 첨가한 후, 실온에서 10분간 방치한 다음 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 세포막 보호효과는 적혈구를 이용한 광용혈 실험을 이용하였으며 Park 등(24)의 방법에 따라 수행하였다. 적혈구는 사람 혈액으로부터 분리하였다.
성능/효과
- 0 μg/mL의 농도에서 150분까지 적혈구가 용혈되지 않고 계속 유지되다가 150분 이상에서 용혈현상을 보였다. T50 값은 172분으로 가장 좋은 결과를 보였으며 0.05 μg/mL, 0.5 μg/mL 농도에서는 t50 값은 각각 37, 38분으로 대조군과 거의 비슷한 결과를 나타내었다. 수층 분획 에서는 0.
- n-Butanol 분획에서 clear zone의 지름은 10 mm로 대조군에 비해 다소 높은 효과를 보였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다. n-Butanol 분획물의 총플라보노이드함량이 다른 분획물 보다 가장 높은 결과를 나타내는 것과 민들레 추출분획물들의 H. pylori 219에 대한 항균효과를 비교하여 보면 민들레 추출물의 플라보노이드 성분이 항균 효과를 나타내는 것으로 판단되어 진다.
- 2에 나타내었다. nButanol 분획에서 총 luteolin 양은 1.14 %로 가장 많은 함량을 나타내었고, 분획 수층에서 0.002%로 가장 낮았다.
- 민들레 추출분획물의 총 플라보노이드의 함량을 Table 1에 나타내었다. 〃-Butanol 분획층에서 총 플라보노이드의 함량이27.75%로 가장 높은 함량을 나타내었으며 물분획층에서는 1.00%로 가장 낮은 함량을 나타내었고 일반적으로 사용하는 용매극성에 따른 분획방법의 결과와 유사하게 n-butanol 분획 층에서 플라보노이드의 함량이 가장 높은 함량을 나타내었다. 사람의 경우 3일간 플라보노이드가 함유되지 않은 음식을 먹은 후 400 mg의 은행잎 추출물을 섭취한 다음 1시간 후 플라보노이드 성분인 quercetin과 kaempferole 평균 농도는 2.
- pylori 항균작용, urease 저해 효과, 프리라디칼소거작용, 세포막 보호 효과에 대해 시험하였다. 각 분획물의 총 플라보노이드와 luteolin 함량을 측정을 한 결과 n-butanol 분획에서 각각 27.75%, 1.14%로 다른 분획들보다 2가지 성분 모두 가장 많이 함유하고 있었다. 효능 시험에서도 n-butanol 분획은 위장 질환을 일으키는 직접 적인 요인 중 하나인 H.
- 0 μg/mL)이 었다. 따라서 각 분획물의 성분 분석과수행되어진 효능 실험 결과들을 비교하여 볼 때 민들레 추출 물의 n-butanol 분획물이 위점막 보호에 효과가 있음을 예측할 수 있었으며 위장 보호를 위한 조성물의 성분으로 사용될 수 있음을 시사하였다.
- pylori 에 대한 항균 및 urease 저해 시험에서 다른 분획물 보다 좋은 결과를 보였다. 또한, 위장 장애의 간접적인 요인이 될 수 있는 라디칼의 소거 작용 및 활 성산소로부터 세포막 보호에 대한 각 분획물의 시험에서도 n- butanol 분획물이 가장 우수한 효과를 나타내었으며 DPPH 라 디칼소거능의 SC50 값은 47 μg/mL, 세포막 보호실험에서 t50 = 172min(C = 5.0 μg/mL)이 었다. 따라서 각 분획물의 성분 분석과수행되어진 효능 실험 결과들을 비교하여 볼 때 민들레 추출 물의 n-butanol 분획물이 위점막 보호에 효과가 있음을 예측할 수 있었으며 위장 보호를 위한 조성물의 성분으로 사용될 수 있음을 시사하였다.
- 민들레 주출물의 urease 저해는 total ethanol 주출물의 경우10.53%의 저해 활성을 나타내었고 n-butanol 분획에서는 13.16%의 저해율을 보여 분획물 중 가장 좋은 저해효과를 나타내었으며 이것은 H. pylori에 대한 n-butanol 분획물의 항균효과와일치하는 결과이다. 한편, 분획 수층에서는 n-butanol 층보다 낮은 7.
- 억제 효과가 없을 경우, clear zone의 크기는 디스크 종이의 지름인 8mm이다. 실험결과 n- butanol 분획을 제외하고는 Clear Zone을 나타내지 않아 항균 효과를 보이지 않았다. n-Butanol 분획에서 clear zone의 지름은 10 mm로 대조군에 비해 다소 높은 효과를 보였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다.
- 이는 적혈구 세포가 50% 용혈되는데 걸리는 시간에 이르기까지 서로 다른 보호 효과를 보여주는 것으로 용혈이 계속 서서히 진행되는 경우보다 용혈되지 않고 유지되는 시간이 길수록 더 좋은 보호효과를 지닌 물질로 판단된다. 위의 결과 들로 볼 때 민들레 추출 분획물 중 광용혈 억제효과가 total ethanol 추출물보다 n-butanol 층의 분획물이 가장 높게 나타남을 알 수 있었다.
- 4에 나타내었다. 총 ethanol 추출물은 5.0 μg/mL의 농도에서 t50 값이 24분으로 control 값과 거의 유사한 가장 낮은 효과를 보였다. Methylene chloride 분획에서 0.
- 14%로 다른 분획들보다 2가지 성분 모두 가장 많이 함유하고 있었다. 효능 시험에서도 n-butanol 분획은 위장 질환을 일으키는 직접 적인 요인 중 하나인 H. pylori 에 대한 항균 및 urease 저해 시험에서 다른 분획물 보다 좋은 결과를 보였다. 또한, 위장 장애의 간접적인 요인이 될 수 있는 라디칼의 소거 작용 및 활 성산소로부터 세포막 보호에 대한 각 분획물의 시험에서도 n- butanol 분획물이 가장 우수한 효과를 나타내었으며 DPPH 라 디칼소거능의 SC50 값은 47 μg/mL, 세포막 보호실험에서 t50 = 172min(C = 5.
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