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문제 정의
- 그렇지만 아직까지 청국장 미 생물의 면역세포 활성능과 관련된 연구는 아직까지 없는 실정이다. 본 연구에서는 혈전용해 활성과 면역세포 활성능이 우수한 청국장을 제조하기 위하여 청국장 제품으로부터 분리된 Bacillus 균주 중 단백질 분해능이 우수하고 점질물질을 생성하는 균주들을 이용하여 혈전용해 활성능과 면역세포 활성능을 . 조사하는 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 7 cell이 생성한 nitric oxide, IL-la, TNF-a양을 측정하여 선별된 미생물 균주의 면역세포 활성능을 조사하기 위하여 시료는 혈전용해능에 사용한 시료를 itxrc에서 30분간 처리 후 1배와 3배로 희석하여 사용하였다. RAW 264.7 ceU linee DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) 에 10% fetal bovine serum 과 streptomycin-penicilline( 1 OOx) 1%를 첨가하여 이용하였으며, 고착성 (anchorage-dependent:)을 갖는 세 포를 cell scrapere. 회수 부유시켜 사용하였다.
- RAW 264.7 cell이 생성한 nitric oxide, IL-la, TNF-a양을 측정하여 선별된 미생물 균주의 면역세포 활성능을 조사하기 위하여 시료는 혈전용해능에 사용한 시료를 itxrc에서 30분간 처리 후 1배와 3배로 희석하여 사용하였다. RAW 264.
- 거식세포의 tumor necrosis factor(TNF) 생성능을 청국장시료 가 증진시키는지를 알아보기 위해 청국장 시료를 IL-la 분석 시와 같은 절차로 처리한 후, ELISA readei# 이용하여 TNF- a 생성능을 분석하였다. 즉, microtiter plate에 표준 TNF-a 용 액, 배양한 시료액 및 biotinylated anti-mouse TNF-a 용액을 50 |1L씩 well에 주입하고, 2VC에서 2시간 배양하였다.
- 단백질 분해력과 점질물 생성력이 우수한 28개 균주 중 그 램양성, Catalase 양성, Oxidase 양성 간균으로 Bacillus속으로 추정되는 13 균주(CHKJ 1227, CHKJ 1248, CHKJ 1249, CHKJ 1303, CHKJ 1332, CHKJ 1307, CHKJ 1308, CHKJ 1311, CHKJ 1315, CHKJ 1326, CHKJ 1329, CHKJ 1339, CHKJ 1348)와 대조군으로 KFRI Qm(Bacillus natto), KFRI 0W(Bacillus subtilis) 두 균주 그리고 시중 청국장 제품(CHKJ 0101)을 대조군으로 사용하였으며, 균주들을 콩에 1% 접종하여 청국장을 제조한 시료군과 TSB(Tryppticase soy broth) 배지를 이용하여 군주들을 배양한 두 가지 시료군으로 나누어 혈 전용해능을 조사하였다. Table 2에서는 혈전용해능 조사결과를 SAS program의 multiful range test를 이용한 유의성 검증 결과를 보여주고 있다.
- 미생물 균주의 동정은 Cappuccino(14)의 방법에 따라 위상차 현미경(Olympus BH2)을 이용한 세포 모양의 관찰과 Gram staining을 수행하였고, MacFaddin(15)의 방법에 따라 Catalase test(유리 위에 시험균주를 도말한 후, 3% 과산화수소 용액을 떨어뜨려 기포 발생을 양성으로 판정)와 Oxidase test를 실시하 였는데, Oxidase test는 시험 균주를 여과지 위에 도말하고, Oxidase 측정 시 약 (N, N, N', N-tetramethyl-P-Phenylediamine-dieydr(A chloide 0.2%, sodiumethylenediamine tetraacetate 0.1%, sodium thiosulfate 0.05%)을 균체에 떨어뜨려 15초 이내에 푸른색으로 변하였을 때 양성 반응으로 판정하였다(15). 이후 Bacillus속으 로 추정되는 미생물은 Bacillus 동정 kit(API 50 CHB/E, Bio- Merieux, France)를 사용하여 동정하였다.
- 상등액 중의 Interleukin-1 a(IL-1 a) 정량은 Dong 둥(18)에 의한 방법을 변형하여 측정하였다. 반응성 질소종 생성능 측정시와 동일한 절차로 RAW 264.7 cell(lXK)5 cells/weil)을 96 weU plate에 37℃의 CO2 incubator에서 2시간 동안 cell을 부착시킨 다음, sample을 농도 별로 첨가하여 20시간 동안 배양하였고, 배양 상등액을 즉시 취하여 -70℃에서 동결보관 하며 분석에 이용하였다. Biotinylated anti-mouse IL-la 단일 클론 항체가 pre-coated 되어 있는 96-well microtiter plate에 항체의 비특이 적인 반웅을 방지하기 위하여 blocking 시약(3% BSA용액, w/ V)을 가한 다음 Tween20이 0.
- 상등액 중의 Interleukin-1 a(IL-1 a) 정량은 Dong 둥(18)에 의한 방법을 변형하여 측정하였다. 반응성 질소종 생성능 측정시와 동일한 절차로 RAW 264.
- 18M 100μL씩 가해 발색반응을 정지시켰다. 이것을 ELISA leader로 파장 540nm에서 홉광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 IL-la 함량을 계산하였다.
- 여기에 상 기의 기질용액을 처리하고 반응 정지액으로 발색반응을 정지 시켰다. 이것을 ELISA reader로 파장 540nm에서 홉광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 TNF-a 함량을 계산하였다.
- 5% H3PO4)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 이때 ELISA reader(Molecular Devices THERMOmax™, USA)를 이용하여 540nni에서 홉광도를 측정하여 sodium nitrite의 표준곡 선으로부터 nitric oxide의 대사물인 nitrite의 생성정도를 산출하였다.
- 05%)을 균체에 떨어뜨려 15초 이내에 푸른색으로 변하였을 때 양성 반응으로 판정하였다(15). 이후 Bacillus속으 로 추정되는 미생물은 Bacillus 동정 kit(API 50 CHB/E, Bio- Merieux, France)를 사용하여 동정하였다.
- 청국장 3일간의 발효 기간 중 채취된 시료에서 순수분리한 220 균주의 단백질 분해능은 skim milk 1% 첨가된 표준한천 배지에 접종하여 배양한 후 생성된 집락 주변이 투명해지는 정도를 측정하여 단백질 분해력을 측정하였다. 점질물질 생성정도는 점질물질 생성배지(phytone 1.5%, glutamic acid sodium salt 1.5%, sucrose 3%, KH2PO4 0.25%, NajHPQ, 0.17%, NaCl 0.05%, MgCl2 - 7H2O 0.05%, Biotin 100 pL, Agar 1.5%)에 균을 접종하여 48시간 배양 후 loop를 이용하여 집락을 떼어 올렸 을 때 점질물질이 따라 올라오는 길이를 측정하여 점질물질 생 성균주를 선별하였다.
- 본 연구에서는 혈전용해 활성과 면역세포 활성능이 우수한 청국장을 제조하기 위하여 청국장 제품으로부터 분리된 Bacillus 균주 중 단백질 분해능이 우수하고 점질물질을 생성하는 균주들을 이용하여 혈전용해 활성능과 면역세포 활성능을 . 조사하는 실험을 수행하였다.
- 청국장 3일간의 발효 기간 중 채취된 시료에서 순수분리한 220 균주의 단백질 분해능은 skim milk 1% 첨가된 표준한천 배지에 접종하여 배양한 후 생성된 집락 주변이 투명해지는 정도를 측정하여 단백질 분해력을 측정하였다. 점질물질 생성정도는 점질물질 생성배지(phytone 1.
- 청국장 발효 과정 중 분리한 13개 균주를 TSB(trypticase soy broth)에 키운 배양액의 혈전 용해능과 콩에 접종중]쇼 제조한 청국장 시료에서 혈전용해능 분석을 실시하였다. TSB 배양은 tryptone 17.
- 청국장 3일간의 발효 중 시료에서 순수분리된 220개 균주의 단백질 분해능 및 점질물질 생성능을 조사한 결과는 Table 1에서 보여주는 것과 같다. 표에서 볼 수 있는 것과 같이 단백질 분해능이 가장 높고 점질물질 생성능이 가장 많은 28개 균주 를 선별한 후, 선별균주에 대한 계속적인 혈전용해 활성과 면 역활성에 대한 조사 실험을 진행하였다.
- 3)의 조성으로 하는 영양배지를 사용하였다. 혈전용해능은 fibrin plate 법(16)을 변형하여 lysed zone의 반경을 측정하였다. Fibrin plate 는 0.
- 균 배양액과 청국장 시료는 동일한 잘량의 생리식염수로 희석한 후 사용하였다. 활성측정은 제조한 fibrin plate에 paper disk(8 mm, Tbyo Roshi, Japan)를 놓고, 시료를 20gL을 점적하여 3VC에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된 투명한 부위의 직 경을 조사하였다.
대상 데이터
- 기타의 시약은 GR급 이상을 사용하였다. 면역세 포 활성실험에 사용된 RAW 264.7 cell linee 한국 세포주 은 행(KCLB, Seoul)에서 분양 받아 사용하였다.
- 세포배양에 사용된 배지와 항생제는 GIBCO(USA)사의 것을 사용하였고, tumor necrosis factor-a(TNF-a) 및 interleukin-la (IL~lct) 분석을 위한 antibodies와 streptavidin-HRP는 Pierce (USA)사의 제품을 사용하였다. Washing buffer로는 phosphate buffered saline(PBST: 0.
- 혈전용해 활성과 면역세포 활성능이 우수한 청국장을 제조 하기 위하여 청국장에서 분리된 220개의 세균으로부터 단백질 분해능과 점질물질 생성능이 우수한 13개의 Bacillus 균주를 선 별하였다. 이들 13개 Bacillus 균주들의 fibrin plate 방법을 이용한 혈전용해 활성과 RAW 264.
데이터처리
- 모든 실험결과와 통계분석은 Statistics Analysis System(SAS) 프로그램을 이용하였고, 결과는 평균치 (mean)와 표준편차(standard deviation, S.D.)로 표시하였다. 유의성 여부는 General Linear Model(19)을 사용하여 one-way ANOVA(analysis of vaiianoe)에 의하여 확인하였으며, 각 처리구별 평균값 사이의 차이는 Duncan's multiple range test에 의해 유의수준을 검증하였다.
- )로 표시하였다. 유의성 여부는 General Linear Model(19)을 사용하여 one-way ANOVA(analysis of vaiianoe)에 의하여 확인하였으며, 각 처리구별 평균값 사이의 차이는 Duncan's multiple range test에 의해 유의수준을 검증하였다.
이론/모형
- RAW 264.7 cell의 배양 상둥액 중의 nitric oxide 생성 농도를 microplate assay를 이용하여 정량함으로써 측정하였다(17). 즉, 96 well plate(Nunc MaxisoipTM 446612, Denmark) 에 시료 및 RAW 264.
성능/효과
- 1)Other carbon sources which were not assimilated by all three strains were: D-Arabinose, L-Xylose, D-Adonitol, Methyl-PD-xylopyranoside, L-Sorbose, Dulcitol, Methyl-aD-Mannopyranoside, Inuline, D- Melezitose, Xylitol, D-Lyxose, D-Fucose, L-Fucose, D-Arabitol, L- Arabitol, potassium 2-Keto-Gluconate, potassium 5-Keto-Gluconate.
- 1)Values are means±S.D. and means within the same column bearing different superscripts are different (p<0.05).
- 1)Values are means±S.D. and means within the same column bearing different superscripts are different (p<0.05).
- 2)Other carbon sources which were assimilated by all three strains were: D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, D-Mannitol, N-Acetyl- Glucosamine, Arbutin, Esculin, Salicin, D-Cellobiose, D-Maltose, D- Saccharose, D-Trehalose, Amidon, Glycogen, D-Turanose.
- Table 2에서는 혈전용해능 조사결과를 SAS program의 multiful range test를 이용한 유의성 검증 결과를 보여주고 있다. Table 2에서 볼 수 있는 것과 같이 두 처리 군(TSB 배지 및 청국장) 간의 혈전용해능은 많은 균주들(CHKJ 1339, CHKJ 1326, CHKJ 1227, CHKJ 1332, CHKJ 1329, CHKJ 1248, CHKJ 1348, CHKJ 1307)에 있어서 유의적인 차이를 나타내었다0<0.05). 그렇지만 TSB 배지에 접종하였을 때와 콩에 접종하여 제조한 청국장군 간의 상관관계는 0.
- Table 4에서 볼 수 있는 것과 같이 선별한 3종의 균주로 제 조한 청국장 시료를 RAW 264.7 macrophage에 처리한 결과 청 국장 시료 농도(1배와 3배 희석)에 따라 NO 생성량의 증가추 세가 나타냄으로써 NO 생성 촉진능이 있음을 보여주었다. 1배 의 농도로 처리한 선발된 3종의 균주의 경우에는 대조군인 soybcan 시료(0.
- 05). 그렇지만 TSB 배지에 접종하였을 때와 콩에 접종하여 제조한 청국장군 간의 상관관계는 0.81 0VO.O5)로 높은 유의적인 상관관계를 나타내어, 분리균으로 청국장을 제조하여 혈전분해능을 측정하지 않고도 TSB 배지 에 배양하여 혈전용해능이 우수한 균주선발을 할 수 있을 것으로 사료되어진다. 혈전용해능의 높은 값을 보여준 KFRI 170 균주와 CHKJ 1339, 1326 균주의 혈전용해능 실험에 대한 사 진 그림은 Fig.
- 05). 그렇지만 청국장 분리균을 TSB 배지에 키운 처리군과 콩에 접종하여 청국장을 제조한 처리군 사이의 NO 생성능의 상관관계를 조사한 결과, 0.76으로 매우 높게 나타났다. CHKJ1339(0.
- 05 로 6배의 많은 NO 생성 촉진능을 나타내었다. 또한, 양성 대 조군으로 사용한 KFRI 0183(Bacilius subtilis) 보다는 3배, KFRI 0170(Bacillus natto)보다는 1.7배의 NO 생성능을 보였다. 이러한 실험 결과로부터 본 연구에서 제조된 3종의 균주가 macrophage의 NO 생성을 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
- 7 cell line을 이용한 cytokine 생성능력 (NO 생성능, Interlukin-la, TNF-a) 검정에 의한 면역 세포 활성능 측정실험을 수행하였는데, Bacillus 균주들을 TSB (Trypticase soy broth)에 키운 시료와 콩에 접종하여 제조한 청 국장시료와 같은 두 가지 상이한 시료를 이용하여 혈전용해능 과 면역세포 활성능을 측정한 결과, 혈전용해능과 면역세포 활 성능이 가장 우수한 세 균주가 최종 선발되었다. 선발된 세균주의 동정결과 두 균주(CHKJ 1249, CHKJ 1326)는 Bacillus iichmtformis로 그리고 CHKJ 1339 균주는 Bacillus wbtilis로 동정되었다.
- 01 μg/mL 미약한 생성 량을 나타내었다. 선별한 3종의 균주는 7.52±0.06 μg/mL의 TNF-a 생성값을 보여 양성대조군으로 사용한 Bacillus subtilis (8.8O± 0,09 μg/mL)와 Bacillus natto(8.47±0.05μg/mL)보다는 다소 미약한 효과가 관찰되었다. Han 등(21)이 보고한 영지의 pglucan성 다당류에 의해 활성화된 흰쥐 간내 Kuffer 세포에서 2.
- 혈전용해 활성과 면역세포 활성능이 우수한 청국장을 제조 하기 위하여 청국장에서 분리된 220개의 세균으로부터 단백질 분해능과 점질물질 생성능이 우수한 13개의 Bacillus 균주를 선 별하였다. 이들 13개 Bacillus 균주들의 fibrin plate 방법을 이용한 혈전용해 활성과 RAW 264.7 cell line을 이용한 cytokine 생성능력 (NO 생성능, Interlukin-la, TNF-a) 검정에 의한 면역 세포 활성능 측정실험을 수행하였는데, Bacillus 균주들을 TSB (Trypticase soy broth)에 키운 시료와 콩에 접종하여 제조한 청 국장시료와 같은 두 가지 상이한 시료를 이용하여 혈전용해능 과 면역세포 활성능을 측정한 결과, 혈전용해능과 면역세포 활 성능이 가장 우수한 세 균주가 최종 선발되었다. 선발된 세균주의 동정결과 두 균주(CHKJ 1249, CHKJ 1326)는 Bacillus iichmtformis로 그리고 CHKJ 1339 균주는 Bacillus wbtilis로 동정되었다.
- 7배의 NO 생성능을 보였다. 이러한 실험 결과로부터 본 연구에서 제조된 3종의 균주가 macrophage의 NO 생성을 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
- 31 pg/mL 생성량과 거의 비슷한 수준이었다. 이상과 같은 세 가지 선별균주의 면역활성 검정결과 세 가지 균주들은 모두 높은 수준으로 면역세포를 활성화시켰음을 알 수 있었고, 선별된 균주로 제조한 청국장은 노화 및 질병에 수반되는 면 역력 감소를 방지하는 기능성식품 재료로의 사용가능성을 보여주고 있다.
- 이상의 결과로부터 최종 선별된 3종의 균주들은 API 동정 kit로 동정을 한 결과 두 균주(CHKJ 1249, CHKJ 1326)는 Bacillus licheniformis로 그리고 CHKJ 1339 균주는 Bacillus subtilis로 동정되었다(Table 5).
후속연구
- 01) TNF-a를 생성시킨 보고에 비하면, 본 연구 에 선별한 3종의 균주로 제조한 청국장의 TNF-a 생성능이 약 3배 높은 결과를 보여주고 있다. 이들 균주들을 이용하여 제조 한 청국장의 상등액이 macrophage를 직접 자극하여 TNF-a 등을 생성하게 되고, 나아가 tumor cell-killing의 기능을 할 수 있도록 자극할 것이라고 예측할 수 있으며, 추후 in vivo에서의 실험이 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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