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문제 정의
- 등이 보고된 정도이며 그 밖의 효능검증 및 성분에 관한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 약용식물로부터 천연활성소재 개발을 목표로 하여 약 300여 종의 천연소재로부터 생리활성을 지표로 한 체계화된 효능평가 시스템을 이용한 스크리닝을 수행한 결과, 쑥부쟁이의 메탄올 추출물에서 강한 AChE 및 항산화 활성을 확인하였으므로 그 결과를 보고하는 바이다.
가설 설정
- a : Data expressed in g equivalent tannic acid to 100g of extract. b : Results are expressed as mean ±SEM of triple experiments.
- 01(Students' t test). b : Positive control.
- 01 (Students' t test). c : Positive control. d : Not determined.
제안 방법
- Re의 방법을 변형하여 7 mM ABTS (in water)와 2.45 mM K2O8S2 동량을 혼합한 후, 실온, 암소에서 16시간 방치하여 라디칼의 생성을 유도한 후, ABTS+ 라디칼 소거능을 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 것처럼 쑥부쟁이 MeOH 추출물의 62.
- 9 g)을 각각 얻었다. 각 가용분획에 대하여 정량적으로 acetylcholinesterase (AChE), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 및 ABTS+ 라디칼에 대한 활성을 농도별로 측정 및 평가하였다.
- 즉 메탄올 추출물을 감압 농축하여 메탄올을 제거하고 물에 현탁된 추출시료를 저극성용매인 n-hexane으로 먼저 추출한 후 물층을 다시 ethyl acetate (EtOAc), n-butyl alcohol (n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획을 감압농축하여 건조 시킨 후 n-Hexane 가용분획(40.0 g), EtOAc 가용분획(3.4 g), n-BuOH 가용분획(15.1 g), H2O 가용분획 (27.9 g)을 각각 얻었다. 각 가용분획에 대하여 정량적으로 acetylcholinesterase (AChE), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 및 ABTS+ 라디칼에 대한 활성을 농도별로 측정 및 평가하였다.
- 신선한 쑥부쟁이 전초 1.0 kg을 분쇄기로 잘게 마쇄한 후, 실온에서 methyl alcohol (MeOH) 8 L로 24시간, 3회 반복 추출한 후 유기용매를 사용하여 극성에 따른 분획을 실시하였다. 즉 메탄올 추출물을 감압 농축하여 메탄올을 제거하고 물에 현탁된 추출시료를 저극성용매인 n-hexane으로 먼저 추출한 후 물층을 다시 ethyl acetate (EtOAc), n-butyl alcohol (n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다.
- 쑥부쟁이 MeOH 추출물의 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid (ABTS) radical 소거능을 Re10)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- 쑥부쟁이 메탄올 추출물의 항산화 및 항치매 효능을 확인할 목적으로 항산화능은 DPPH, ABTS+ 라디칼 소거능, 항치매 효능은 acetylcholinesterase (AChE) 저해활성 측정 방법으로 평가하였으며 그 결과는 다음과 같다.
- 쑥부쟁이 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 생쥐의 뇌로부터 추출 정제된 AChE에 대한 in vitro 저해효과를 acetylcholine iodide를 기질로 사용하여 평가하였다. 그 결과, 쑥부쟁이의 MeOH 추출물은 31.
- 저해 활성 측정은 Ellman법11)을 변형하여 수행하였다. 효소는 일정량씩 분주하여 80℃ 이하에서 보관하였으며, 최종 농도는 0.
- 0 kg을 분쇄기로 잘게 마쇄한 후, 실온에서 methyl alcohol (MeOH) 8 L로 24시간, 3회 반복 추출한 후 유기용매를 사용하여 극성에 따른 분획을 실시하였다. 즉 메탄올 추출물을 감압 농축하여 메탄올을 제거하고 물에 현탁된 추출시료를 저극성용매인 n-hexane으로 먼저 추출한 후 물층을 다시 ethyl acetate (EtOAc), n-butyl alcohol (n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획을 감압농축하여 건조 시킨 후 n-Hexane 가용분획(40.
- 효소는 일정량씩 분주하여 80℃ 이하에서 보관하였으며, 최종 농도는 0.03 unit의 농도로 사용하였으며, 기질은 0.1 M의 odium phosphate buffer (pH 8.0)에 녹인 1,000 μM의 acetylcholine iodide를 사용하였으며, 발색 시약은 39.6 mg의 5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)와 15 mg의 sodium bicarbonate를 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 7.0) 10 ml에 녹여 제조하였다.
- 효소저해 실험에 사용한 acetylcholinesterase 효소원으로는 생쥐의 뇌로부터 추출정제된 것을 이용하였으며 효소반응의 기질로 사용한 acetylthiocholine iodide (ACh), 효소활성 대조약물로 사용한 Tacrine, coupling agent로 사용한 5,5-dithiobis [2-nitrobenzoic acid] (DTNB), 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)는 Sigma Co (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 기타시약은 시중에서 구입 가능한 최상급 시약을 사용하여 실험하였다. 흡광도 측정은 multiplate spectrophotometer (Infinite F-200, Tecan, Swiss)로 각 흡수대에 따른 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 쑥부쟁이는 2008년 7월에 경북 칠곡 지역에서 채집하였으며, 대구한의대학교 한약재약리학과 김용한 교수에 의해 동정 및 확인하였다. 표본시료는 대구한의대학교 한약재약리학과 천연물화학실험실의 표본실에 보관하고 있다(No.
- 효소저해 실험에 사용한 acetylcholinesterase 효소원으로는 생쥐의 뇌로부터 추출정제된 것을 이용하였으며 효소반응의 기질로 사용한 acetylthiocholine iodide (ACh), 효소활성 대조약물로 사용한 Tacrine, coupling agent로 사용한 5,5-dithiobis [2-nitrobenzoic acid] (DTNB), 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)는 Sigma Co (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 기타시약은 시중에서 구입 가능한 최상급 시약을 사용하여 실험하였다.
데이터처리
- 각 실험은 최소 3번 이상 검정하였고, 실험 결과는 평균±표준오차로 표시하였고, non-paired Student’s t-test로 검정하여 p값이 5% 미만일 때 통계적으로 유의 한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 전자공여능은 Blois 방법9)에 따라 측정하였다. 각 시료용액에 2 mL에 0.
- 총 페놀화합물은 Folin-Denis 방법12)으로 측정하였으며, 시료 1 ml에 95% ethanol 1 ml와 증류수 5 ml을 첨가하고 1N Folin-ciocalteu reagent 0.5 ml를 가한 후, 흡광도 725 ml에서 1시간 이내에 측정하여 tannic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
성능/효과
- 1. 쑥부쟁이의 ethyl acetate (EtOAc) 가용부의 DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과, 62.5 mg/ml의 실험 농도에서 89.5±0.7%의 우수한 소거능을 나타내었으며, 이는 대조군인 (+)-catechin의 효능과 거의 동등한 활성이었다.
- 2. ABTS+ 라디칼 소거능을 평가한 결과 쑥부쟁이의 EtOAc 가용부의 62.5 mg/ml의 실험농도에서 82.8± 0.6%의 저해능을 나타내었고, 이는 대조군인 (+)-catechin과 비교하여도 우수한 소거능이었으며, 이들 라디칼 소거능은페놀성 화합물의 존재에 기인한다고 판단된다.
- 3. AChE 저해능을 측정한 결과, 15.7 mg/ml의 저 농도에서 80.1±0.3%의 강한 효소 저해능을 나타내었으며, 효소활성은 농도 의존적으로 저해함을 알 수 있었다.
- Table 1에서 나타낸 것처럼 쑥부쟁이의 MeOH 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 라디칼 소거능을 평가한 결과, 125 mg/ml의 농도에서 MeOH 추출물이 49.0±0.5%의 라디칼 소거능을 나타내었으며, 특히 EtOAc 가용부의 62.5 mg/ml의 농도에서는 89.5±0.7%의 매우 우수한 라디칼 소거능을 나타내었다.
- n-BuOH 가용부의 125 mg/ml의 농도에서 75.0±0.5%, 62.5 mg/ml의 농도에서 38.7±0.4%의 라디칼 소거능을 나타내었고, 다음으로 H2O 및 n-Hexane 가용부에서 비교적 약한 라디칼 소거능을 확인하였다.
- 그 결과 Table 2에서 보는 것처럼 쑥부쟁이 MeOH 추출물의 62.5 mg/ml 농도에서는 62.1±0.6%의 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타냄을 알 수 있었으며, 각 분획물 중에서도 특히 EtOAc 가용부의 62.5 mg/ml의 농도에서 82.8±0.6%의 매우 우수한 라디칼 소거능을 나타내었으며, positive control인 (+)-catechin과 동등한 효능을 나타내었다.
- 그 결과, 쑥부쟁이의 MeOH 추출물은 31.3 mg/ml 농도에서 60% 이상의 저해효능을 나타내었으며, 쑥부쟁이 분획물 중에서 EtOAc 가용부의 경우 15.7 mg/ml의 저 농도에서 80.1±0.3%의 매우 우수한 AChE 저해능을 나타내었으며, 이 활성은 positive control인 tacrine과 비교하여도 동등한 효능임 알 수 있었다.
- 또한 15.7 mg/ml의 실험농도에서 n-BuOH층에서 52.2±0.9%의 저해능을 나타내었으며, H2O 및 n-Hexane가용부에서도 약 50%의 저해효능을 나타내었다(Table 3).
- 이들 활성이 추출물 상태임에도 불구하고 단일 화합물인 (+)-catechin과 거의 동등한 활성을 나타내었으며 쑥부쟁이의 추출물 속에 강한 항산화 활성을 가지는 활성물질의 존재를 시사하였다. 또한 이들 활성과 총 페놀성 화합물의 함량의 상관관계를 평가한 결과, DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거능은 페놀함량과 밀접한 관계가 있다는 보고27)에 근거하여 쑥부쟁이의 항산화 활성과 페놀성 화합물의 연관성을 평가한 결과, Table 1에서 나타낸 것처럼, DPPH, ABTS+ 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 많은 EtOAc층에 집중됨을 확인하였고, 이는 쑥부쟁이의 항산화 활성이 쑥부쟁이 추출물에 존재하는 페놀성 화합물이 관여함을 시사하였다. 본 연구와 더불어 쑥부쟁이의 성분중 chlorogenic acid, quercetin, kaempferol 등의 존재가 알려져 있으며 이들 성분을 포함한 강력한 항산화 성분이 풍부하게 EtOAc 가용부에 존재할 가능성이 크다고 사료된다.
- 또한 페놀성 화합물 함량이 높은 EtOAc 가용부에서도 80.1±0.3%의 매우 우수한 AChE 저해능을 나타내었으며, positive control인 tacrine과 동등한 효능을 나타내었다.
- . 쑥부쟁이 MeOH 추출물에 대해서 녹차의 항산화 성분으로서도 잘 알려져 있는 천연 항산화제인 (+)-catechin을 대조군으로 하여 DPPH, ABTS+ 라디칼 소거법에 의한 항산화활성을 평가한 결과, 항산화 활성은 시료의 처리농도에 비례하게 효능을 나타내는 것으로 확인되었으며 그중에서도 EtOAc 가용부에서 가장 강한 활성을 나타내었다. 이들 활성이 추출물 상태임에도 불구하고 단일 화합물인 (+)-catechin과 거의 동등한 활성을 나타내었으며 쑥부쟁이의 추출물 속에 강한 항산화 활성을 가지는 활성물질의 존재를 시사하였다.
- 7%의 매우 우수한 라디칼 소거능을 나타내었다. 이는 positive control로서 녹차의 항산화성분으로 잘 알려져 있는 (+)-catechin과 같은 농도에서 비교하여도 거의 동등한 효능임을 알 수 있었다. n-BuOH 가용부의 125 mg/ml의 농도에서 75.
- 4%의 라디칼 소거능을 나타내었고, 다음으로 H2O 및 n-Hexane 가용부에서 비교적 약한 라디칼 소거능을 확인하였다. 이들 추출물과 분획의 DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과 총페놀성 화합물의 함량과 라디칼 소거능 사이에는 강한 상관관계가 있는 것을 알 수 있었다.
- 쑥부쟁이 MeOH 추출물에 대해서 녹차의 항산화 성분으로서도 잘 알려져 있는 천연 항산화제인 (+)-catechin을 대조군으로 하여 DPPH, ABTS+ 라디칼 소거법에 의한 항산화활성을 평가한 결과, 항산화 활성은 시료의 처리농도에 비례하게 효능을 나타내는 것으로 확인되었으며 그중에서도 EtOAc 가용부에서 가장 강한 활성을 나타내었다. 이들 활성이 추출물 상태임에도 불구하고 단일 화합물인 (+)-catechin과 거의 동등한 활성을 나타내었으며 쑥부쟁이의 추출물 속에 강한 항산화 활성을 가지는 활성물질의 존재를 시사하였다. 또한 이들 활성과 총 페놀성 화합물의 함량의 상관관계를 평가한 결과, DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거능은 페놀함량과 밀접한 관계가 있다는 보고27)에 근거하여 쑥부쟁이의 항산화 활성과 페놀성 화합물의 연관성을 평가한 결과, Table 1에서 나타낸 것처럼, DPPH, ABTS+ 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 많은 EtOAc층에 집중됨을 확인하였고, 이는 쑥부쟁이의 항산화 활성이 쑥부쟁이 추출물에 존재하는 페놀성 화합물이 관여함을 시사하였다.
- 이상의 결과로 보터 쑥부쟁이의 EtOAc 가용부에는 우수한 항산화능과 아세틸콜린에스테라제 저해능이 있음을 알 수 있었다.
- 5%의 라디칼 소거능을 나타내었고, 다음으로 H2O 및 n-Hexane 가용부에서 약한 효능을 나타내었다. 이상의 결과로부터 ABTS+ 라디칼 소거능 또한 DPPH 라디칼 소거능과 동일하게 총페놀성 화합물의 함량과 라디칼 소거능 사이에는 강한 상관관계가 있음을 시사하였다.
후속연구
- 본 연구에서 얻어진 강한 항산화능 및 AChE 저해능 등의 자료를 기초로 한 성분연구를 통하여 새로운 acetylcholine성 약물(cholinergic drug) 후보물질을 탐색하고 이들 효소 저해제의 치매 치료제로서의 가능성을 확인하기 위한 작용기전 연구는 항치매 천연소재 개발에 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다. 또한 쑥부쟁이의 효능으로 알려져 있는 천식, 해열, 염증에 관한 전무한 과학적 근거에 대해서도 본 연구에서 결과 및 향후 연구를 통하여 위에서 언급한 쑥부쟁이의 효능과의 상관관계에 대해서도 과학적으로 검증할 필요성 있다고 사료된다.
- 본 연구에서 얻어진 강한 항산화능 및 AChE 저해능 등의 자료를 기초로 한 성분연구를 통하여 새로운 acetylcholine성 약물(cholinergic drug) 후보물질을 탐색하고 이들 효소 저해제의 치매 치료제로서의 가능성을 확인하기 위한 작용기전 연구는 항치매 천연소재 개발에 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다. 또한 쑥부쟁이의 효능으로 알려져 있는 천식, 해열, 염증에 관한 전무한 과학적 근거에 대해서도 본 연구에서 결과 및 향후 연구를 통하여 위에서 언급한 쑥부쟁이의 효능과의 상관관계에 대해서도 과학적으로 검증할 필요성 있다고 사료된다.
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