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문제 정의
- 25)민간에서는 과즙을 다려서 복용하면 위장장애, 천식 동맥경화 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 이러한 활성 및 그 기전에 대한 보고는 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 제주에서 재배되는 당유자 미숙과 추출물에 대하여 RAW264.7 세포 및 HaCaT 세포에서 염증성 인자로 알려진 IL-6, iNOS, COX-2, TARC 및 MDC의 생성 및 활성 억제를 조사하여 기능성을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- Plate를 lOOOipm에서 10분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma) 150 μg를 가하여 MTT의환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.
- HaCaT 세포 (5.0 x 105 cells/m/)를 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 시험 약물과 IFN-y (10ng/m/)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 배양 배지를 얻어 3, 000rpm에서 5분 원심분리 하였다..
- . LDH 활성을 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (promega, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 μl와 reconstituted substrate mix를 50 B를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 μl의 stop solution을 넣어 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- LDH 활성을 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (promega, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 μl와 reconstituted substrate mix를 50 B를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 μl의 stop solution을 넣어 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- - RAW264.7 세 포 (1.5 x 106 cells/m/)를 18 시간 전 배양하고 시험 약물과 LPS (1 pg/mZ) 를 동시 처리하여 24시간 배양하고, HaCaT 세포 (5.0x 105 cells/m/)를 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 시험 약물과 IFN-y (10ng/mZ)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 total RNA 추출은 TRI-reagent (MRC)를 이용하여 분리하였으며, 모든 실험은 RNase-fieee한 조건 하에서 이루어졌다.
- cDNA 합성을 Improm-II™ cDNA kit (Promega)를 이용하여, 1 μg의 total RNA를 oligo(dT)18 primer, dNTP (0.5 )1M), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase (2 U)로 70℃ 5 min, 25℃ 5 min, 37℃ 60 min, 그리고 70℃에서 15 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction (PCR) 을 2 \il cDNA, 4 jiM 의 5'과 3' primer, lOx buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.
- 5 )1M), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase (2 U)로 70℃ 5 min, 25℃ 5 min, 37℃ 60 min, 그리고 70℃에서 15 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction (PCR) 을 2 \il cDNA, 4 jiM 의 5'과 3' primer, lOx buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250(iM dNTP, 25 mM MgCl2, 1 unit Taq polymerase (Promega, USA)를 섞고 distilled water로 최종 25 mM로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal C* yclei 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94/45초, 55~58/45초, 72/60초 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물을 1.
- 1% Triton X-100), 250(iM dNTP, 25 mM MgCl2, 1 unit Taq polymerase (Promega, USA)를 섞고 distilled water로 최종 25 mM로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal C* yclei 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94/45초, 55~58/45초, 72/60초 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물을 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band를 확인하였다.
- - 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide (NO) 생성에 대한 당유자 미숙과 추출물의 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO?「의 형태로 측정하였다.
- RAW264.7 세포에 LPS (1 |_ig/mZ)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 당유자 미숙과에 의한 mRNA expression 저해정도를 RT-PCR을 통해 알아보았다. LPS에 의해 iNOS 는 현저히 증가하였으며, 당유자 분획물을 처리한 결과 hexane 분획물과 chloroform 분획물이 INOS의 mRNA 발현을 강하게 억제하였다 (Fig.
- 1-b). 또한, LPS (1 μg/ml) 및 INF-y (5OU/m7)를 사용하여 단백질 발현에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 알아보았다. 그 결과 단백질 수준에서도 hexane 및 chloroform 분획물이 LPS 및 IFN-y 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다 (Fig.
- 생성된다. RAW264.7 세포에 LPS (1 μg/m/)과 당유자 추출물을 처리하여 IL-6 생성에 대한 억제 효과를 조사하였다. 당유자 추출물을 처리한 결과 hexane 분획물과 chloroform 분획물에서 강한 억제 효과를 보였다 (Fig.
대상 데이터
- - 제주도에서 재배되고 있는 당유자 미숙과를 8월에 채집하여 동결건조 한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료 (84.
- 채집하여 동결건조 한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료 (84.98 g)를 80% methanol (MeOH)로 2회 교반 추출 후 여과하여 감압 농축하여 용매를 증발시켰다. 여기에서 얻은 MeOH 추출물 (34.
- 98 g)를 80% methanol (MeOH)로 2회 교반 추출 후 여과하여 감압 농축하여 용매를 증발시켰다. 여기에서 얻은 MeOH 추출물 (34.47 g)을 계통적 추출 방법에 의하여 hexane 분획 (0.46 g), chlorofiatm 분획 (0.88 g), ethylacetate (EtOAc) 분획 (2.30 g), butanol (n-BuOH) 분획 (15.17 g), H2O 분획 (15.57 g)을 얻어 실험시료로 사용하였다 (Scheme 1).
- - Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포를 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 배양하였고, Dr. M. J. Cho (Cheju National University, Korea)로부터 변형된 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 분양 받아 100units/m/ penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3-4일에 한번씩계대 배양을 시행하였다. Lipopoly-saccharide (LPS, E.
- Cho (Cheju National University, Korea)로부터 변형된 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 분양 받아 100units/m/ penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3-4일에 한번씩계대 배양을 시행하였다. Lipopoly-saccharide (LPS, E. coli serotype 0111:B4)< Sigma로부터 구입하여 사용하였으며, interferon-y (mlFN-y, recombinant E. coli)와 human interferon-y (hlFN-y, recombinant E. coli)를 Roche로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
- - RAW264.7 세포 (1.5 xlO6 cells/m/)에 시험 약물과 LPS (1 μg/m/)를 동시 처리하여 24 시간 배양한 후, MTT assay 방법을 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과, 모든 분획물에서 독성이 나타나지 않았다(Fig. 1-a).
- 존재하는 효소로서 pyruvic acid와 lactic acid 간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다. 변형된 인간 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에 IFN-y (lOng/m/)로 케모카인을 유도하고, 당유자 미숙과 주줄물을 처리한 결과, 모든 분획물에서 대조군 흡광도와 대비하여 30% 이하로 독성을 나타내지는 않았다 (Fig. 5).
- 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO?「의 형태로 측정하였다. 실험결과 hexane 분획물 및 chloroform 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리 군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다 (Fig. 1-a).
- 7 세포에 LPS (1 |_ig/mZ)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 당유자 미숙과에 의한 mRNA expression 저해정도를 RT-PCR을 통해 알아보았다. LPS에 의해 iNOS 는 현저히 증가하였으며, 당유자 분획물을 처리한 결과 hexane 분획물과 chloroform 분획물이 INOS의 mRNA 발현을 강하게 억제하였다 (Fig. 1-b). 또한, LPS (1 μg/ml) 및 INF-y (5OU/m7)를 사용하여 단백질 발현에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 알아보았다.
- 또한, LPS (1 μg/ml) 및 INF-y (5OU/m7)를 사용하여 단백질 발현에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 알아보았다. 그 결과 단백질 수준에서도 hexane 및 chloroform 분획물이 LPS 및 IFN-y 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다 (Fig. 1-c). 이러한 결과는 NO의 생성 억제가 iNOS 발현 억제를 통한 것으로 여겨진다.
- 29-30) 따라서 COX-2에 의한 prostagladin의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다. RAW264.7 세포에 LPS (1)ig/mZ)로 자극을 주고 당유자 추출물을 처리하여 확인한 결과, hexane 분획물에서 강한 억제 효과를 보였으며 , chloroform 분획물에서는 약한 억제 활성을 보였다 (Fig. 2).
- 7 세포에 LPS (1 μg/m/)과 당유자 추출물을 처리하여 IL-6 생성에 대한 억제 효과를 조사하였다. 당유자 추출물을 처리한 결과 hexane 분획물과 chloroform 분획물에서 강한 억제 효과를 보였다 (Fig. 3).
- 3D 이러한 반응은 T 림프구에서 분비하는 IFN-Y 등의 염증성 사이토카인에 의해서 활성화되며, 최근 ITN-y가 각질 형성 세포에서 면역활성 인자로 알려진 TARC 및 MDC 발현을 증가시키는 것으로 보고되었다.32-33)변형된 각질형성 세포인 HaCaT 세포에 IFN-y (10ng/mZ)로 케모카인을 유도하고, 당유자 미숙과 추출물을 처리한 결과, EtOAc 분획물에서 TARC 발현을 현저히 억제시켰으며 (Fig. 4-a), MDC 발현에도 강한 억제 활성을 보였다 (Fig. 4-b).
- 위의 결과에서 조 추출물 (MeOH ext.)에서 염증성 인자에 대한 억제 활성은 없었으나, 조 추출물로부터 얻은 hexane, chloroform 분획물에서 IL-6, iNOS 그리고 COX-2에 대한 활성을 나타내었으며 , EtOAc 분획물에서는 TARC 및 MDC 에 활성을 나타내어 활성이 특정 분획으로 집중됨을 확인하였다.
- 7 세포에 LPS로 자극을 주고 당유자 미숙과 추출물을 처리하여 확인해 본 결과, hexane 분획물과 chloroform 분획물에서 IL-6, iNOS 그리고 COX-2 발현을 억제함을 확인하였다. 그리고 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포에 IFN-γ로 자극을 주고, 당유자 미숙과 추출물을 처리한 결과 EtOAc 분획물에서 TARC 및 MDC 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 당유자 미숙과 추출물을 처리하여 확인해 본 결과, hexane 분획물과 chloroform 분획물에서 IL-6, iNOS 그리고 COX-2 발현을 억제함을 확인하였다. 그리고 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포에 IFN-γ로 자극을 주고, 당유자 미숙과 추출물을 처리한 결과 EtOAc 분획물에서 TARC 및 MDC 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이러한 결과는 당유자 미숙과로부터 염증을 억제하거나 치료할 수 있는 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다. 또한 당유자 미숙과로부터 염증 억제 성분을 도출하고자 활성분획인 hexane, chloroform 및 EtOAc 분획에 대하여 분리를 진행 중에 있다.
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