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문제 정의
- 본 연구는 유용생리활성 물질 추출상의 이점을 가진 초음파병행 추출법 (Kim et al., 2005) 을 이용하여 기존의 연구에서 밝혀진 Spirulina platensis의 항암효과와 이를 이용하여 기능성 식품에 관련된 분야에 바탕 자료로서 영양학적 가치를 지니게 하기 위해 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 추출 방법으로는 증류수를 이용하여 추출온도는 60 ℃ 와 100℃ , 에탄올을 이용하여 추출온도는 60℃ 에서 수직 환류냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 각각 10배의 용매를 이용하여 12시간 동안 2회 반복 추출하였다. 다시 초음파 주줄기 (Asia Industry, Korea.
- 추출하였다. 다시 초음파 주줄기 (Asia Industry, Korea.)를 통하여 각각의 온도인 60, 100℃ 에서 40 KHz의 초음파로 30분간 초음파추출을 병행하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조한 뒤에 각각의 수율을 계산하였다.
- )를 통하여 각각의 온도인 60, 100℃ 에서 40 KHz의 초음파로 30분간 초음파추출을 병행하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조한 뒤에 각각의 수율을 계산하였다.
- 항암에 관한 물질의 분리 동정을 위한 선결 작업으로 이전연구로 활성이 알려진 S. platensis의 색소 단백 물질의 영향의 유무를 확인하기 위하여 단백질의 변성 온도를 기준으로 60 ℃ 와 100℃ 를 선정하였다.
- SRB (sulforhodamine B) assay는 Kim et al. (2005)를 참고하였으며 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험에 사용된 세포주로는 인간 정상 신장세포인 HEK293를 이용하여 세포독성을 측정하였고, 인간 폐암세포인 A549와 인간 위암세포인 AGS, 인간 간암세포인 Hep3B와 인간 유방암세포인 MCF7를 이용하여 함암 활성을 측정하였다. 실험 대상 세포의 농도를 4-5×104cells/mL으로 96 well plate의 각 well에 100μL씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.
- (2005)를 참고하였으며 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험에 사용된 세포주로는 인간 정상 신장세포인 HEK293를 이용하여 세포독성을 측정하였고, 인간 폐암세포인 A549와 인간 위암세포인 AGS, 인간 간암세포인 Hep3B와 인간 유방암세포인 MCF7를 이용하여 함암 활성을 측정하였다. 실험 대상 세포의 농도를 4-5×104cells/mL으로 96 well plate의 각 well에 100μL씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 g/L로 100μL씩 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid) 100μL를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 증류수로 4-5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.
- Selectivity 측정은 SRB assay를 이용하여 정상세포 (HEK-293)에 대한 각 sample 농도에서 세포독성을 측정하고, SRB assay를 이용하여 각 암세포주의 생육 억제 활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다.
- 위한 세포질성 단백질을 분리하였다. 일단 플라스크에 있는 배지를 제거하고 cold PBS를 첨가한 후 scraper로 세포를 수집하였다. 10초간 원심분리하여 상등액을 버린 후 400 μL의 cold buffer A (10 mM Hepes-KOH[pH7.
- 전기영동이 끝난 gel을 분리하여 Western blotting 장치에 설치한 후 여기에 transter buffer를 채우고, 50V로 2시간 전이하고 membrane을 분리하여 30분간 blocking solution으로 blocking한 후 BclXL 혹은 Mcl-1에 대한 1차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. Membrane을 blocking solution으로 잘 soaking 한 후 여기에 horseradish peroxidase 또는 alkaline phosphatase가 중합되어 있는 anti-mouse immunoglobulin G 항체 또는 anti-rabbit immmunogolbulin G 항체를 첨가하여 30분간 반응하였다. 위에서와 같이 PZBS, PBST를 바꾸어 가면서 membrane을 세척한 다음 membrane에 ECL 발색 시약을 첨가하여 반응시킨후 X-선 필름에 적정 시간 동안 노출시켰다.
- 위에서와 같이 PZBS, PBST를 바꾸어 가면서 membrane을 세척한 다음 membrane에 ECL 발색 시약을 첨가하여 반응시킨후 X-선 필름에 적정 시간 동안 노출시켰다. 이 감광된 필름의 수치적 데이터를 위하여 densitometer로 측정 하였다 (Lee et al., 2002).
- 암세포 생육 저해 효과는 인감 폐암세포와 위암세포, 유방암 세포와 간암세포 (Hep3B)를 이용하여 SRB 방법을 이용하여 암세포 억제 활성을 측정하였다.
- 이로서 인간 정상 신장 세포인 HEK293을 이용하여 각 시료에 대한 Bcl-2의 발현에 미치는 영향을 검토하였으며 Bcl-2의 발현 양을 나타나게 하기 위해 Densitometer를 이용하여 IOD 값을 측정하여 발현양을 비교하였다.
- l×106 정도의 세포를 사용하여 cytochrome c의 Western blotting을 위한 세포질성 단백질을 분리하였다. 일단 플라스크에 있는 배지를 제거하고 cold PBS를 첨가한 후 scraper로 세포를 수집하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 해수배양 Spirulina platensis는 artificial seawater를 이용하여 염도는 35%, pH는 9.08로 맞추어 옥외광합성 배양법으로 배양하여 사용하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 DMEM F12는 Gibco (USA)로부터 구입하였고, 혈청은 Hyclone (USA)사의 fetal bovine serum을 이용하였다. Hepes buffer, gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였고, 세포염색을 위해서 필요한 sulforth odamine B (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- bovine serum을 이용하였다. Hepes buffer, gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였고, 세포염색을 위해서 필요한 sulforth odamine B (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 세포 분화도를 측정하기 위한 시약인 Triton X-100, 4-nitrophenyl phosphate는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 이용된 세포주는 암세포로 인간 폐암세포인 A549(Lung carcinoma, human, ATTC #CCL-185, USA), 인간 위 암세포 인 AGS(Stomach adenocarcinoma, human, ATTC #CRL-1739, USA), 인간 간암세포인 Hep3B (Hepatocillular carcinima, human, ATCC #HB-8064, USA), 인간 유방암세포인 MCF7 (Breast adenocarcinoma, human, ATCC #HTB-22, USA)를 사용하였고, 시료 자체의 세포 독성을 알아보기 위한 정상세포로는 인간 신장세포인 HEK293 (Kidney nomal, human, ATTC #CRL-1573, USA)를 사용하였다. 그리고 세포 분화도를 측정하기 위해서 인간 전과립 세포 (human promyelocytes; HL60, ATCC #CRL-1964, USA)를 사용하였다.
- USA)를 사용하였다. 그리고 세포 분화도를 측정하기 위해서 인간 전과립 세포 (human promyelocytes; HL60, ATCC #CRL-1964, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 암세포는 RPMI 164(배지 (A549, AGS)와 DMEM F12배지 (Hep3B, MCF7)를 정상세포는 DMEM배지에 10% heat-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였다.
- 그리고 세포 분화도를 측정하기 위해서 인간 전과립 세포 (human promyelocytes; HL60, ATCC #CRL-1964, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 암세포는 RPMI 164(배지 (A549, AGS)와 DMEM F12배지 (Hep3B, MCF7)를 정상세포는 DMEM배지에 10% heat-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였다.
- 세포 분화 측정에 사용된 세포주는 인간 전과립 세포(human promyelocytes; HL60)를 사용하였고 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하였으며 RPMI 1640배지에 10% heat-inactivated FBS (fetal bovin serum)으로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포분화의 정량적인 수치를 측정하기 위해 세포의 농도가 4-5×104cells/mL로 포함된 배지를 24 well plate에 900 씩 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
- Hepes buffer, gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였고, 세포염색을 위해서 필요한 sulforth odamine B (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 세포 분화도를 측정하기 위한 시약인 Triton X-100, 4-nitrophenyl phosphate는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 data는 평균 ±표준오차 (Mean ± standard error)로 나타내었으며, ANOVA로 통계검정한 뒤 Newman-Keuls 방법을 사용하여 사후 분석하였다.
성능/효과
- plantensis와의 추출 수율은 Table 1과 같다. Table 1에서 확인할 수 있듯이 해수의 추출방법에 따른 수율을 비교했을 때, 초음파를 병행 물 60℃ 추출물이 33.46% 로 가장 높았다.
- 2005). 이런 상승작용으로 인하여 기존의 물 추출보다 낮은 온도에서 더 효율적인 추줄이 이루어져 초음파 병행 주줄물의 수율이 높게 나타나는 것으로 보이며 이는 초음파를 병행한 추출물에 더 많은 활성성분을 함유하고 있는 것으로 판단된다.
- S. platensis 추출물의 인간 신장 정상세포에 대한 세포독성을 sulforhodamine B assay를 사용하여 즉정한 결과 모든 추줄물에서 세포독성은 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 최고 투여농도인 L0mg/mL에서 100℃ 물 추출물이 22.2%로 가장 높은 독성을 보였다. 가장 낮은 세포 독성 효과를 나타낸 것은 60℃ 초음파 병행 물 추출물에서 19.
- 5 이상일 때 암세포에 대한 선택성이 있어 선택적으로 정상세포보다 암세포의 생육을 억제한다고 할 수 있다. 각 농도에서 정상 세포에 대한 암세포의 생육억제 활성의 비를 나타내는 선택적 사멸도를 구한 결과 인간 폐암세포와 인간 위암세포의 경우 모든 농도에서 1.5에서 4 사이의 높은 선택적 사멸도를 나타냈으며 (Fig. 2-5) 인간 유방암세포, 인간 간암세포의 경우도 추출물에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타냈으며 1.5 이상의 높은 선택적 사멸도를 보였다 (Table 2).
- 이 결과를 바탕으로 S. platensis는 인체에 큰 독성을 나타내지 않는 것으로 사료되어지며 이미 생리 활성이 알려진 S. platens is 의 색소 단백 계열 물질은 60 ℃ 에서 변성이 일어나지 않고 초음파의 공동현성을 이용한 증류수 추출방법에서 가장 많이 추출되는 것으로 사료되어 진다.
- 먼저 인간 폐암세포에 대한 생육 억제 활성을 측정한 결과억제활성의 경우 대부분의 시료에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 대체적으로 초음파 병행 S. platensis가 더 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 그 중 가장 좋은
- 4%의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 그리고 모든 가장 낮은 억제효과를 나타낸 60 ℃에탄올 추출물의 1.0mg/mL의 농도에서 71.8%를 나타내어 모든 추출물에서 높은 항암활성 효과를 나타내 었다 (Fig. 2).
- 인간 위암세포에 대한 암세포 생육억제 활성을 측정한 결과 대부분의 추출물에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 농도가 1.0mg/mL일 때 가장 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 이 세포주에 대해서도 초음파 병행 추출물이 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내었으며, 60℃ 물 초음파병행 추출물의 1.
- 0mg/mL일 때 가장 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 이 세포주에 대해서도 초음파 병행 추출물이 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내었으며, 60℃ 물 초음파병행 추출물의 1.0mg/mL의 농도에서 85.9%로 가장 높은 암세포 억 제 활성을 나타내 었다 (Fig. 3).
- 인간 유방암 세포인 MCF-7을 이용하여 생육억제 활성을 측정한 결과 모든 시료에 대해 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 초음파 병행 주줄물 모두 1.0mg/mL의 농도에서 78% 이상의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 여기서도 알 수 있듯이 초음파 병행 추출물과 일반 추출물을 비교했을 때 초음파를 병행하여 얻은 추출물이 더 높은 암세포 억제 활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
- 0mg/mL의 농도에서 78% 이상의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 여기서도 알 수 있듯이 초음파 병행 추출물과 일반 추출물을 비교했을 때 초음파를 병행하여 얻은 추출물이 더 높은 암세포 억제 활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 그 중 가장
- 그리고 이 암세포주에 대해서도 60℃ 초음파 병행 추출물이 높은 암세포 억제활성을 나타내었다. 초음파 병행 60 ℃ 물 추출물과 100 ℃ 물 추출물의 암세포 억제 활성은 1.0mg/mL의 농도에서 각각 90.6%, 85.4%로 높은 억제 활성을 나타내었고, 이와 비교하여 초음파를 병행하지 않은 60℃물 추출물과 100℃ 물 추출물도 각각 84.4%, 82.6%로 높은 억제활성을 보였다.
- 이 결과 추출물이 4가지 암세포 주에 대해 생육 억제 활성이 높은 것을 확인할 수 있었고, 그 중 초음파 병행한 추출물에서 가장 높은 항암 효과를 나타내 었다 (Table. 2).
- 0mg/mL의 농도로 투여한 후, 5일 동안 세포의 분화도를 관찰한 결과이다. 모든 시료에서 시간의존적으로 분화도가 증가하는 경향을 나타내었고, 일반추출물보다 초음파 병행 추출물이 더 높은 세포 분화 활성을 나타냈다. 그 중 60℃, 증류수 초음파 병행 주줄물에서 5일째 172.
- 모든 시료에서 시간의존적으로 분화도가 증가하는 경향을 나타내었고, 일반추출물보다 초음파 병행 추출물이 더 높은 세포 분화 활성을 나타냈다. 그 중 60℃, 증류수 초음파 병행 주줄물에서 5일째 172.4%로 가장 높게 나타났고, 이와 비교해 초음파를 제외한 동일 조건의 S. platensis 추출물이 158.4%를 나타내어 모두 비교적 높은 세포 분화도를 나타내었다. 이는 앞선 연구결과에서 암세포 생육 억제 활성이 가장 높게 나타낸 것과 같은 이유라고 사료되어진다.
- 5에서 나타내었다. 일반추출물과 초음파 병행 추출물을 비교한 결과 초음파 추출물에서 더 낮은 IOD값을 나타내었다. 그 중 60℃ 물 초음파 병행 추출물에서 67.
- 4%의 효과를 나타내었다. 대체적으로 초음파를 병행한 추출물에서 비교적 낮은 세포 독성을 나타내었고, 22.2% 이하의 세포 독성을 나타내어 비교적 정상세포에 대한 세포 독성이 적은 것으로 나타났다 (Fig. 1).
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