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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 연안에 자생하는 대황GEYse- nia bicyclis, 大荒)에서 라미나란을 추출, 정저), 분획하여 화학적 특성을 검토하였다.
제안 방법
- 13C-NMR 분석은 정제 라미나란을 DMSO-dH 용해하여 300 MHz NMR spectrometer(Bruker AMX 500, Ger many )> 이용하여 50℃에서 측정하였으며, 핵자기공명 흡수 위치-화학적 이동가 (chemical shift value)는 tetrameth - ylsilane(TMS)를 0.0 ppm으로 환산하여 나타내었다.
- 그리고 다시 교반한 후 dichloromethane 층을 -20℃에서 저장해두고 GC-MSD(HP-5973, Hewlett Packard, USA)로 분석하였다. Partially Omethylated alditol acetate의 동정은 GC-MSD fragment와 retention time을 비교하여 확인하였다. 그리고 분석용 칼럼은 SP- 2330으로 160℃에서 210℃까지 2℃/min, 210℃에서 240℃까지 5℃/min로 승온 분석 후 240℃에서 10분 동안 등온 분석하였다.
- , Japan)를 사용하여 측정하였다. Ul trahydrogel 1000 칼럼(300X7.8 mm I.D., Waters, USA)에 0.25%로 녹인 정제 라미나란을 20 此를 주입한 후 증류수(0.8 mL/min) 로 용리하였고, refractive index (RD detector (930 RI, Jasco Co., Japan)로 측정하였다. 분자량 측정용 표준시약은 dextran(Sigma Co.
- 2 Pm, Supelco, USA)을 사용하였고, 230℃에서 등온 분석하였다. 구성당의 확인은 표준시약의 크로마토그램과 retention time을 비교하여 확인하였으며, 정량은 내부표준물질(myo-ino sitol)과 표준당(rhamnose, fucose, ribose, arabinose, xy lose, mannose, galactose, glucose)을 시료와 동일하게 acetylation시켜 검량 곡선을 작성하여 환산하였다.
- 국내 울릉도 연안에서 자생하는 대황에서 라미나란을 분리, 정제 분획하여 구조적 특성을 비교하였다. 분쇄한 대황을 0.
- 0 mL를 가하였다. 그리고 다시 교반한 후 dichloromethane 층을 -20℃에서 저장해두고 GC-MSD(HP-5973, Hewlett Packard, USA)로 분석하였다. Partially Omethylated alditol acetate의 동정은 GC-MSD fragment와 retention time을 비교하여 확인하였다.
- , USA)을 사용하였고, 표준 dextran의 평균 분자량은 A70은 71, 900, T-40은 39, 200, T-10은 9, 300 dalton이었으며, 이들로부터 분자량 검량선을 작성하고 정제 라미 나란의 평균 분자량을 측정하였다. 그리고 분획 다당의 a, P-configuration 확인은 시료 1 mg을 동량의 KBr 분말과 혼합하여 pellet 형태로 성형하고 FT-IR spectrometer(FTIR-300E spectrometer, Jasco, Japan)을 이용하여 적외선 흡수 spectrum을 측정하였다.
- 3%로 증가하여 CPC를 사용하여 라미나란을 간단히 정제할 수 있었다. 라미나란의 분자량 및 당 구조 분석을 위하여 부분정제 라미나란을 Sephacryl S-300 HR 칼럼으로 정제하였으며, 이 정제물의 평균 분자량은 12,500 dalton이 었다. 그리고 총당의 함량이 89.
- 라미나란의 분자량 측정 및 당 결합 구조를 밝히기 위해서 Sephacryl S-300 HIL칼럼으로 분획하여 정제 라미나란 분획물을 얻었으며 (Fig. 3), 이 분획물의 화학적 조성을 분석 하였다(Table 3).
- 라미나란의 정제는 Sephacryl S-300 High Resolution column(2.6 x 60 cm, Amersham Pharmacia, Sweden)을 사용하여 정제하였다. 부분정제 라미나란을 Tris-HCl buffer (pH 7.
- , Japan)로 측정하였다. 분자량 측정용 표준시약은 dextran(Sigma Co., USA)을 사용하였고, 표준 dextran의 평균 분자량은 A70은 71, 900, T-40은 39, 200, T-10은 9, 300 dalton이었으며, 이들로부터 분자량 검량선을 작성하고 정제 라미 나란의 평균 분자량을 측정하였다. 그리고 분획 다당의 a, P-configuration 확인은 시료 1 mg을 동량의 KBr 분말과 혼합하여 pellet 형태로 성형하고 FT-IR spectrometer(FTIR-300E spectrometer, Jasco, Japan)을 이용하여 적외선 흡수 spectrum을 측정하였다.
- 3 mL/min로 용출하였다. 용출액은 fraction collector로 6 mL씩 모은 후 페놀-황산법(21) 으로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 라미나란 분획물을 얻었으며, 분획은 모아서 증류수에 24시간 투석, 농축한 후 동결건조하여 라미나란 정제 물(purified laminaran)을 얻었다.
- 정제 라미나란의 당쇄 결합 양식을 분석하기 위하여 FT- IR, methylation 및 %-NMR 분석을 행하였다. 정제 라미 나 란을 FT-IR로 분석한 결과(Fig.
- 정제 라미나란의 분자량을 측정하기 위해서 HPLC(908 pump, 930; Jasco Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. Ul trahydrogel 1000 칼럼(300X7.
- 조 라미나란(crude laminaran)의 추출은 Zvyagintseva 등(19)의 방법을 수정하여 추출하였다. 즉 대황 분말 시료에 20배 량의 0.
- 조 라미나란(crude laminaran)의 추출은 Zvyagintseva 등(19)의 방법을 수정하여 추출하였다. 즉 대황 분말 시료에 20배 량의 0.09 N HC1 을 가한 후 실온에서 2시간 교반 추출한 후 3겹의 가아제와 여과지 (Whatman No. 4)로 여과하였다. 잔사는 동일하게 한번 더 추출 여과한 후 여액을 취하였다.
- , USA) 를 사용하여 CPC에 침전되는 산성 다당을 제거하여 부분정제 라미나란(partially purified laminaran, PPL)을 분리하였다. 즉, l%(w/v) 조 라미나란 용액에 일정량의 무수 황산나트륨을 가한 다음 5% CPC를 첨가하여, 37℃에서 4시간 교 반하여 침전물인 산성 다당과 상층액인 중성 다당으로 나누었다. 이 분획물은 원심분리한 후 상층액을 3배량의 에탄올에 침전시키고 원심분리 후 투석, 동결 건조하여 부분 정제된 라미나란을 얻었다.
- 여액은 3배의 에탄올을 가하여 수용성 다당을 침전시켰다. 침전된 수용성 다당은 원심분리(4, 000xg, 15 min)한 후 증류수로 24시간 투석(MWC0 3, 500, MEMBRANE FIL TRATION Inc., USA)한 후 동결건조하여 조 라미나란(crude laminaran)을 얻었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 대황(E. bicyclis, 大荒)은 2002년 8월 울릉도 연안에서 채취한 생시료를 담수로 2〜3회 수세한 후 50℃ 열풍건조기로 24시간 건조하였다. 그리고 분쇄기로 분쇄한 후 -20℃에 밀봉 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 그리고 분쇄기로 분쇄한 후 -20℃에 밀봉 보관하면서 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 시약들 중에서 cetylpyridinium chloride (CPC), bovine serum albumin(BSA), myo-inositol, rhamnose, fucose, ribose, arabinose, xylose, mannose, galactose, glucose, dimethylsulfoxide(DMSO), 2.5 M butyllithium so- lution(in hexane), iodomethane, chloroform, methanol, tri- fluoroacetic acid(TFA), sodium borodeuteride, acetic acid, acetic anhydride, pyridine, dichloromethane, DMSD-cZg 등은 Sigma사 제품을 사용하였고, 그 외의 시약들은 특급시약을 사용하였다.
이론/모형
- 대황의 일반성분은 AO AC 법(18)에 따라 수분함량은 상압건조법, 조지방은 Soxhelt 추출법, 조단백질은 Kjeldahl법, 조회분은 건식 회화법으로 분석하였다. 그리고 탄수화물은 무수물로 환산하여 조단백질, 조지방, 조회분을 뺀 나머지 값으로 환산하였다.
- 정제 라미나란의 methylation은 Harris 등(25)과 Carpita와 Shea(26)의 방법에 의하여 분석하였다. 즉, 시료 5 mg을 뚜껑이 있는 pyrex tube에 취하고 DMSO 1 mL를 가해서 50℃에서 시료를 녹였다.
- 조 라미나란으로부터 라미나란의 정제는 Scott(20)의 방법에 따라 cetylpyridinium chloride(CPC, Sigma Co., USA) 를 사용하여 CPC에 침전되는 산성 다당을 제거하여 부분정제 라미나란(partially purified laminaran, PPL)을 분리하였다. 즉, l%(w/v) 조 라미나란 용액에 일정량의 무수 황산나트륨을 가한 다음 5% CPC를 첨가하여, 37℃에서 4시간 교 반하여 침전물인 산성 다당과 상층액인 중성 다당으로 나누었다.
- 추출한 다당의 총당 함량은 페놀-황산법으로, 단백질의 함량은 Lowry 법 (22) 으로, 황산기의 함량은 Dodgson과 Price(23)의 방법으로 측정하였고, 구성당 조성 분석은 Fur- neaux 등(24)의 방법에 따라 gas chromatography(HP- 6890, Hewlett Packard, USA)로 분석하였다. 칼럼으로 SP-2330 칼럼(0.
성능/효과
- 3%였다. 그리고 FTTR 분석 결과 glucose는 대부분 6-결합(888 cm")의 형태로 존재하는 것을 확인하였다. 그리고 13C NMR 분석 및 methylation 분석을 해본 결과 라미나란은 주로 P-1,3 결합에 P-1,6 분지를 갖는 glucan 임을 확인하였다.
- 2는 CPC를 사용하여 부분 정제 한 라미나란과 산성 다당의 크로마토그램을 나타낸 것이다. CPC를 사용하여 부분 정제한 라미나란의 조성은 총당, 단백질 및 황산기의 함량이 각각 74.7, 3.8, 3.2%로 조 라미나란에 비하여 총당의 함량이 증가(68.2%—74.7%)하였고, 단백질(8.4%t3.8%) 및 황산기의 함량(7.6%—3.2%)이 감소하였다. 그리고 구성당의 glu cose 함량이 55.
- L. czdzo厂ioides에서 정제한 라미나란은 정제도가 증가할수록 glucose 함량은 98 〜99%까지 증가하며, 이때 분자량은 3~5 kDa이었고, L. guytmouae에서 정제한 라미나란은 5〜50 kDa, F. euanescens^^ 정제한 라미나란은 5 kDa이 라고 보고하여(10), 본 실험의 결과 대황에서 분획한 라미나란은 L. guytmouae에서 정제한 라미나란과는 유사한 경향을 나타내었고, 그 외 갈조류에서 정제한 라미나란에 비해 The column (7.8 x 300 mm) of ultrahydrogel 1000 was eluted with distilled water at flow rate of 0.8 mL/min and T-70, T-40 and T-10 are-standard dextrans- of 7b;900, 39, 200 and 9, 300 dalton. 다소 높은 분자임을 확인하였으며, 이는 갈조류 종류 및 정제 방법에 따른 차이로 보여진다.
- 그리고 FTTR 분석 결과 glucose는 대부분 6-결합(888 cm")의 형태로 존재하는 것을 확인하였다. 그리고 13C NMR 분석 및 methylation 분석을 해본 결과 라미나란은 주로 P-1,3 결합에 P-1,6 분지를 갖는 glucan 임을 확인하였다.
- 라미나란의 분자량 및 당 구조 분석을 위하여 부분정제 라미나란을 Sephacryl S-300 HR 칼럼으로 정제하였으며, 이 정제물의 평균 분자량은 12,500 dalton이 었다. 그리고 총당의 함량이 89.9%, 단백질 함량은 1.1%, 그리고 황산기 함량 0.8%이었으며, 주요 구성당인 glucose의 함량이 98.3%였다. 그리고 FTTR 분석 결과 glucose는 대부분 6-결합(888 cm")의 형태로 존재하는 것을 확인하였다.
- 8 mL/min and T-70, T-40 and T-10 are-standard dextrans- of 7b;900, 39, 200 and 9, 300 dalton. 다소 높은 분자임을 확인하였으며, 이는 갈조류 종류 및 정제 방법에 따른 차이로 보여진다.
- 5%이었다. 대황에서 추출한 다당은 다른 갈조류에서 추출되는 다당보다 산성도가 적은 중성 다당으로 glucose가 주요성분인 glucan 임을 알 수 있었다.
- 대황을 Zvyagintseva 등(19)의 방법에 따라서 추출한 조 라미나란과 CPC를 사용하여 정제한 라미나란의 화학적 조성은 Table 2에 나타내었다. 대황을 분말화한 후 0.09 N HC1 로 실온에서 2시간 2회 반복 추출한 조 라미나란의 수율은 14.5%였으며, 그 화학적 조성을 살펴보면 총당의 함량이 68.2%로 주요 성분이었으며, 그 외에 단백질이 8.4% 그리고 황산기의 함량이 7.6%이었다. 주요 구성당의 조성을 살펴보면 glucose의 함량이 55.
- 따라서 위의 FT-IR, methylation 분석 및 NMR 분석을 토대로 검토해 볼 때, 라미나란 정제물은 주로 P-1, 3 결합에 0-1, 6분지를 갖는 glucan 임을 확인하였다.
- 라미나란 정제물의 총당, 단백질 및 황산기의 함량은 각각 89.9, 1.1 및 0.8%이었으며, glucose의 함량이 구성당의 98.3 %로 분획된 다당은 glucan 임을 알 수 있었으며, 라미나란 분획물의 평균 분자량은 12, 500 kDa이었다(Fig. 4).
- 국내 울릉도 연안에서 자생하는 대황에서 라미나란을 분리, 정제 분획하여 구조적 특성을 비교하였다. 분쇄한 대황을 0.09 N HC1로 추출한 조 라미나란과 이를 CPC로 정제한 부분 정제 라미나란의 수율은 각각 14.5%, 6.5%였으며, 그 화학적 조성을 비교해 보면, 총당의 함량이 68.2%에서 74.7%로 증가하였고, 단백질의 함량(8.4%t3.8%) 및 황산기의 함량(7.6%—3.2%)로 감소하였으며, 주요 구성당인 glucose의 함량이 55.0%에서 83.3%로 증가하여 CPC를 사용하여 라미나란을 간단히 정제할 수 있었다. 라미나란의 분자량 및 당 구조 분석을 위하여 부분정제 라미나란을 Sephacryl S-300 HR 칼럼으로 정제하였으며, 이 정제물의 평균 분자량은 12,500 dalton이 었다.
- 4 ppm(C4)의 peak는 동정되지 않았다. 위 결과는 Dilip 등(31)이 분석한 P-(l-3)- glucan 결합의 data, CK103.4 ppm), C2(73.2 ppm), C3(86.6 ppm), C4(68.8 ppm), C5(76.7 ppm) 그리고 C6(61.2 ppm)와 비교해볼 때, 0.3~0.4 ppm°] upfield 쪽으로 이동하였으며, 이 값을 더해주면 본 실험한 data와 잘 일치하였다. 그리고 다당은 동일한 구성성분이라도 chemical shift 값이 약간 차이가 나는데 이는 분석온도, 용매, reference compound오]" 그 자성의 균질성, 분석 방법의 차이 때문에 일어나는 것으로 생각된다(32).
- 본 실험에 사용한 대황의 일반 성분 조성은 Table 1과 같다. 주요 갈조류의 건물당 탄수화물의 함량은 75.4%로 주성분이었으며, 회분 함량이 14.0%였으며, 다음으로 단백질 9.4%, 조지방 1.2%의 순으로 함량이 높았다. Koo 등(27)은 국내산 주요 갈조류인 미역 포자엽, 다시마, 톳, 모자반의 일반성분을 측정하였는데 주요 성분은 탄수화물로 50.
- 6%이었다. 주요 구성당의 조성을 살펴보면 glucose의 함량이 55.0%이었으며 , 기타 fucose, man nose, galactose가 각각 28.6, 7.9, 8.5%이었다. 대황에서 추출한 다당은 다른 갈조류에서 추출되는 다당보다 산성도가 적은 중성 다당으로 glucose가 주요성분인 glucan 임을 알 수 있었다.
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