국내산 콩 품종 3종과 미국산 콩 2종(non-GMO 및 GMO glyphosate-tolerant HS2906)에 대하여 단백질함량과 분포의 차이를 아미노산 분석, 총 질소량, PAGE/densitometry법에 의 해 분석하였다. 아미노산 구성과 총 질소량에서 품종간 유의적인 차이는 없었다. 한편 단백질 추출에서 SDS/buffer 추출법이 더 효과적이었다. 총 단백질함량(380.2-423.9 mg/g)과 단백질 분포는 품종간 유사하였으나. 상세 PACE(12.5% normal gel) 결과 재래종 콩(WS82)에 비해 제초제 저항성 GMO콩(HS2906)에서 beta conglycinin(55kDa) 양이 낮게 나타났으며, 25 kDa 단백질의 경우 미국산 콩에서는 관찰되지 못한 반면에 국내산 콩 품종에서는 뚜렷하게 관찰되었으며, ${\beta}$-conglycinin은 미국산 제초제 저항성 GMO콩과 국내산 황금콩에서 상대적으로 낮은 것으로 관찰되었다. 이와 같은 결과는 normal PAGE/densitometry 분석법은 콩시료 분석에 유용하게 활용될 수 있음을 보여주었다.
국내산 콩 품종 3종과 미국산 콩 2종(non-GMO 및 GMO glyphosate-tolerant HS2906)에 대하여 단백질함량과 분포의 차이를 아미노산 분석, 총 질소량, PAGE/densitometry법에 의 해 분석하였다. 아미노산 구성과 총 질소량에서 품종간 유의적인 차이는 없었다. 한편 단백질 추출에서 SDS/buffer 추출법이 더 효과적이었다. 총 단백질함량(380.2-423.9 mg/g)과 단백질 분포는 품종간 유사하였으나. 상세 PACE(12.5% normal gel) 결과 재래종 콩(WS82)에 비해 제초제 저항성 GMO콩(HS2906)에서 beta conglycinin(55kDa) 양이 낮게 나타났으며, 25 kDa 단백질의 경우 미국산 콩에서는 관찰되지 못한 반면에 국내산 콩 품종에서는 뚜렷하게 관찰되었으며, ${\beta}$-conglycinin은 미국산 제초제 저항성 GMO콩과 국내산 황금콩에서 상대적으로 낮은 것으로 관찰되었다. 이와 같은 결과는 normal PAGE/densitometry 분석법은 콩시료 분석에 유용하게 활용될 수 있음을 보여주었다.
In order to elucidate the differences of protein profiles among soybean cultivars, the protein composition of three conventional domestic soybean cultivars and two imported ones including glyphosate-tolerant HS2906 was analyzed by total nitrogen measurement, amino acid analysis and PAGE/densitometry...
In order to elucidate the differences of protein profiles among soybean cultivars, the protein composition of three conventional domestic soybean cultivars and two imported ones including glyphosate-tolerant HS2906 was analyzed by total nitrogen measurement, amino acid analysis and PAGE/densitometry. There were no statistically significant differences in the levels of any amino acid, including aromatic amino acids, between glyphosale-tolerant soybean and the conventional soybean WS82. In the extraction of protein, the SDS/buffer system was more efficient than the defatting/water system. The SDS-PAGE/densitometry analysis showed that there was a similar profile of proteins among cultivars, although the amount of total protein ranged from 380.2 mg/g to 423.9 mg/g. In addition, there was no discernable difference of protein profile between glyphosate- tolerant soybean (total protein amount, 380.2 mg/g) and the conventional soybean WS82 (390.2 mg/g), although the amount of ${\beta}$-conglycinin (55 kDa) was lower in glyphosate-tolerant soybean. Meanwhile, the amount of 25 kDa protein was greater in domestic soybean cultivars than imported ones. Thus, normal PAGE/ densitometry method would be useful to analyze the difference in protein profiles of soybean proteins, and furthermore Evaluate the protein profile of proteins between GMO and conventional soybean.
In order to elucidate the differences of protein profiles among soybean cultivars, the protein composition of three conventional domestic soybean cultivars and two imported ones including glyphosate-tolerant HS2906 was analyzed by total nitrogen measurement, amino acid analysis and PAGE/densitometry. There were no statistically significant differences in the levels of any amino acid, including aromatic amino acids, between glyphosale-tolerant soybean and the conventional soybean WS82. In the extraction of protein, the SDS/buffer system was more efficient than the defatting/water system. The SDS-PAGE/densitometry analysis showed that there was a similar profile of proteins among cultivars, although the amount of total protein ranged from 380.2 mg/g to 423.9 mg/g. In addition, there was no discernable difference of protein profile between glyphosate- tolerant soybean (total protein amount, 380.2 mg/g) and the conventional soybean WS82 (390.2 mg/g), although the amount of ${\beta}$-conglycinin (55 kDa) was lower in glyphosate-tolerant soybean. Meanwhile, the amount of 25 kDa protein was greater in domestic soybean cultivars than imported ones. Thus, normal PAGE/ densitometry method would be useful to analyze the difference in protein profiles of soybean proteins, and furthermore Evaluate the protein profile of proteins between GMO and conventional soybean.
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문제 정의
유전자변형 식품과 자연식품의 영양적인 면에서 실질적 동등성의 평가는 수입 GMO 및 국내 개발 GMO의 안전성 평가 시 기 본단계 이 므로 매우 중요하다. 본 연구에서는 자연콩과 유전자변형 콩의 주요 영 양성 분 중 단백질의 함량 및 특성을 비교 분석하였다.
가설 설정
2) Data are expressed as mean ± standard deviation and are the mean of three replications.
3)Means in the same row with different letters are significantly different (p<0.05).
제안 방법
Normal gel PAGE 조건은 4%(w/v) stacking gel과 12.5%(w/v) separating gel로 구성된 1.5 mm~thick PAGE gel을 사용하였고, running buffer(pH &3)는 192 mM glycine, 0.1% SDS 및 25 mM tri s(hydroxymethy 1) amino-methane으로 구성되 었으며, 일 차적으로 80''/에서 20~30분간, 이어서 120 V에서 60~70분간 전기영동을 진행하였다.
PAGE gebe Coomasie blued g/L)로 염색하였고 이어서 탈색시 킨 후에 각 단백질 밴드의 양을 Scanning densitometer(UMAX PowerLookllOO, Tai wan)와 TotalLab software(Phloretix International LTD., England)에 의해 단백질의 분포를 평가하였다.
아미노산 분석 은 PITC labeling한 후에 automated amino acid analyzer(Waters Pico Tag HPLC system, Milford, MA, USA)에 의해 수행되었다. 즉 분말시료 11.
17 M SDS +6 M urea) 을 넣고 ultra-sonicator water bath내에서 상온에서 1 시간동안 단백질을 추출하였다. 이 어서 원심분리(13, 000 rpm, 20 min)를 실시하고 oil이 유입 되 지 않도록 상징액을 조심 스럽 게 취 한 후에 4℃에서 보관하면서 비탈지 단백양을 분석하였다. 시료의 단백질 정량은 탈지 및 비탈지 추출 후 Biuret법 에 의하여 분석하였다 (12).
USA)에 의해 수행되었다. 즉 분말시료 11.87 mg을 취하여 PICO-Tag방법에 의 거 PITC labeling된 시료 400 UL 중에서 5.0 UL를 취 하여 HPLC로 아미노산의 종류와 함량을 분석하였다. 기기는 한국기초과학지원연구원에 있는 Waters 510 HPLC(Waters Co.
8 mL)를 넣고 ultrasonicator water bath 내에서 1 시간 동안 단백질을 추출한 후 원심분리(13, 000 rpm, 20 min)하고, 상징액을 탈지 단백질 분석 시료용으로 사용하였다. 콩 분말시료 일정량(25 mg)에 1.8 mL의 추출용액(50 mM Tris-HCl, pH 6.8 + 0.17 M SDS +6 M urea) 을 넣고 ultra-sonicator water bath내에서 상온에서 1 시간동안 단백질을 추출하였다. 이 어서 원심분리(13, 000 rpm, 20 min)를 실시하고 oil이 유입 되 지 않도록 상징액을 조심 스럽 게 취 한 후에 4℃에서 보관하면서 비탈지 단백양을 분석하였다.
탈지 콩시료의 제조를 위해 콩 분말시료 일정량에 10배의 n-hexane을 넣고 4시간 동안 상온에서 stirring한 후에 고형물을 분리하고 ventilation hood 안에서 묻어 있는 hexane을 제거하여 시료분말을 제조하였다. 이어서 분말(25 mg)에 증류수(1.
대상 데이터
0 UL를 취 하여 HPLC로 아미노산의 종류와 함량을 분석하였다. 기기는 한국기초과학지원연구원에 있는 Waters 510 HPLC(Waters Co., Milford, MA, USA), Waters gradient controller, Waters 717 Automatic sampler로 구성된 HPLC 와 Waters PICO-tag column(3.9x300 mm, 4 Um)를 사용하였으며 피크는 Waters 996 photodiode(PDA)로 254 nm에서 검출하였다. 이 동상은 6% acetonitrile을 함유한 140 mM sodium acetate(A)와 60% acetonitrile(B)를 용매구배 시켰다.
본 연구에 사용된 국내산 콩 3종(황금콩, 풍산콩, 두유콩)은 유전자변형 콩이 아닌 자연콩으로 우리 식생활에서 두부나 메주용, 콩나물용, 두유용으로 각각 다르게 많이 이용되는 주요 품종을 유진종묘(대전, 한국)로부터 제공받았다. 수입 콩은 미 국산 2종으로 HS2906은 제 초제 내 성 콩으로 CP4-EPSPS가 들어있는 glyphosate계 제초제 저 항성 콩이다.
수입 콩은 미 국산 2종으로 HS2906은 제 초제 내 성 콩으로 CP4-EPSPS가 들어있는 glyphosate계 제초제 저 항성 콩이다. 또다른 한 종(WS82)은 미국 내에서 많이 생산 재배되는 품종으로 주로 식용유 제조에 많이 이용된다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였으며 SPSS program중에서 분산분석 (ANOVA)을 하였고 유의성이 있는 경우 Duncan의 다중범위 검정 하여 각 평균값에 대한 유의차를 조사하였다. 유의수준은 5%이내로 하였으며, 각 실험치의 평균값과 표준오차로 표시하였다.
이론/모형
Laemmli 법 (13)에 의 거 normal gel PAGE와 gradient gel PAGE 조건하에 전기 영 동장치 (Heofer Lab Co., LTD, Sanfrancisco, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.
이 어서 원심분리(13, 000 rpm, 20 min)를 실시하고 oil이 유입 되 지 않도록 상징액을 조심 스럽 게 취 한 후에 4℃에서 보관하면서 비탈지 단백양을 분석하였다. 시료의 단백질 정량은 탈지 및 비탈지 추출 후 Biuret법 에 의하여 분석하였다 (12).
시료의 조단백질은 AOAC를 참고하여 Kjeldahl법에 의하여 분석하였다(11).
성능/효과
다음으로 상기 normal PAGE 분석 결과를 토대로 각 단백질의 구성 차이를 파악하기 위해 품종별로 주요 단백질( a a P-conglycinin 및 glycinin A&B) 의 구성비를 densitometry법에 의해 분석하였을 때 Fig. 2에서와 같이 나타났으며, 이러한 결과에서 Fig. 1에서 관찰된 결과와 일치하였다.
2 mg/g의 범위를 함유하는 것으로 관찰되었다. 두 가지 추출법 에 따른 단백 질함량을 비교시 비탈지 추출법이 탈지 추출법보다 더 효과적인 것으로 사료되나, 총 질소량에 근거 한 조단백 함량은 329.3 - 356.4 mg/g weight의 범위로 나타난바 탈지 추출법이 더 정확한 것으로 파악된다. 한편 비탈지 추출법에서 함량이 더 높게 측정된 이유로는 추출시 사용된 SDS 및 urea 등의 시료가 biuret법에 의한 단백질함량의 측정값을 증대시켰기 때문으로 사료된다.
이와 같이 conglycinin의 subunite 품종간에 변화가있는 것으로 파악된 바, 이러한 결과는 기보고(19, 21, 22)에서와 같이 저 장단백질 인 conglycinin의 subunite 환경에 따라서 변화되는 것으로 사료된다. 따라서 본 실험에 사용된 normal gel PAGE/densitometry법은 콩 품종간의 단백질 구성 및 분포의 비교를 위해 유용하게 활용될 수 있음을 보여주었다.
미국산 재래종 콩(WS82)에 비해 제초제 저항성 GMO콩(HS2906)에서 beta conglicinin(55 kDa) 양이 다소 적은 것으로 나타났는데 이러 한 현상은 재현성 있게 관찰되었다. 또한 25 kDa 단백질의 경우 미국산 콩 시료에서는 관찰되지 못한 반면에 국산콩시료에서는 뚜렷하게 관찰되었는데, 이러한 결과는 normal PAGE(Fig. 1A)와 gradient PAGE(Fig. IB)에서 공통적으로 나타났다. 이외에 국내산 황금콩은 다른 cultivar에 비해 단백질함량이 더 큰 것으로 파악되었는데, 이러한 결과는 총 단백질함량의 결과와 일치하는 것이다.
전체적으로 전기영동상에서 콩 품종간에 각 단백질, 즉 a, a ', P-conglicinin, acidic 및 basic glycinin의 함량의 차이가 현저 하지 않았으나, 특별히 구별되는 점은 다음과 같다. 미국산 재래종 콩(WS82)에 비해 제초제 저항성 GMO콩(HS2906)에서 beta conglicinin(55 kDa) 양이 다소 적은 것으로 나타났는데 이러 한 현상은 재현성 있게 관찰되었다. 또한 25 kDa 단백질의 경우 미국산 콩 시료에서는 관찰되지 못한 반면에 국산콩시료에서는 뚜렷하게 관찰되었는데, 이러한 결과는 normal PAGE(Fig.
아미노산 조성은 국내산 및 수입산 콩 품종 간에 유의적인 차이가 있었다(p<0.01). 국내에서 재배된 non-GMO콩의 아미노산 조성은 기 보고된 범위에 속하였으며(17), 품종간의 아미노산 조성 비 는 tryptophan과 prolamin을 제외하고는 유의적인 차이가 없는 것으로 보아, 국내지질 환경에서는 콩 품종간 아미노산의 생합성과정의 큰 차이는 없는 것으로 사료된다.
그 외에 표준 단백질의 경우도 normal gel이 gradient gel보다 분리도면에서 더 우수하였다. 이와 같이 콩 단백질의 분리에서 12.5% normal PAGE 분석은 작은 분자량의 단백질의 분리에 더 유리한 반면에 4-20% gradient PAGE 분석 은 큰 분자량의 단백질의 분리에 더 적합한 것으로 사료된다. 전체적으로 전기영동상에서 콩 품종간에 각 단백질, 즉 a, a ', P-conglicinin, acidic 및 basic glycinin의 함량의 차이가 현저 하지 않았으나, 특별히 구별되는 점은 다음과 같다.
산출하여 비교한 결과는 Table 3과 같다. 주요 단백질(conglycinin과 glycinin)함량의 비율은 품종간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, subunit의 경우 a a P-conglycinin의 각 함량은 품종간에 유의적인 차이가 있었다. 특히 conglycinine 제초제 저항성 GMO콩(HS2906)과 국산품종 풍산콩에서 상대적으로 낮은 것으로 관찰되었다.
탈지 추출법 에 의한 분석 에서 콩 시료의 단백질함량은 341.6-364.8 mg/g의 범위를 나타내는 것으로 관찰된 반면에, 비탈지 추출법에 의한 분석에서 단백질함량은 406.1-453.2 mg/g의 범위를 함유하는 것으로 관찰되었다. 두 가지 추출법 에 따른 단백 질함량을 비교시 비탈지 추출법이 탈지 추출법보다 더 효과적인 것으로 사료되나, 총 질소량에 근거 한 조단백 함량은 329.
6% 범위에 속한다는 보고(17, 18)와 비교하였을 때, 본 실험에서 관찰된 품종간의 단백질함량의 차이는 거의 없는 것으로 파악되었다. 특히, 미국산 재래종 콩(WS82)과 제초제 저항성 콩(HS2906)간에 총 단백질량의 차이가 유의적이지 않았으므로 제초제 저항성 GMO콩은 단백질의 총 함량에 영향을 주지 않는 것으로 생각되었다.
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