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문제 정의
- 본 연구의 목적은 B-1, 3 glucan을 사료에 첨가하여 투여한 후첨가수준에 따른 넙치의 성장 및 비특이적 면역능에 미치는 영향과 병원성 균인 Edwardsiella tarda을 복강내 인위감염에 대한 저항능의 변화를 확인하고자 하였다.
- , 1996; Ogier et al, 1996). 이러한 연구는 경구적인 투여와 복강주사를 비교했을 때 어류에 있어서 B-glucan 이 다른 효과를 가진다는 것을 제시하고 있다. 이질적인 물질의 주입 또는 감염에 의해 어류 혈액의 lysozyme 농도는 증가하는 것으로 알려져 있고(Fletcher, 1973), Ogier et al.
제안 방법
- 6주간의 실험종료 후, MS222 200 ppm에 실험어를 마취하여 전체 무게 및 마曰수를 측정하고 증체율, 사료효율, 일간성장률, 단백질 전환효율, 비만도와 생존율을 계산하였다. 헤마토크리트치는 각 수조마다 3마리씩의 어류로부터 혈액을 채취하여 microhematocrit 방법 (Brown, 1980)으로 즉정을 하였다.
- 실험사료의 단백질원으로 북양어분, 젤라틴, 카제인을 사용하였으며 , 탄수화물원으로는 소맥분을 지 질원으로는 어유를 사용하였다. I시, 3 글루칸의 사료내 이용가능성을 확인하기위하여 실험사료내에 각각 0%(Control), 0.이%(Go.이), O.O25%(Go.o25), O.O5%(Goos) 및 0.1%(Gg)의 5가지 수준으로 B-1, 3 글루칸을 첨가하였다. 실험사료는 모든 원료를 혼합한 후 펠렛제조기로 압출 , 성형하였으며, 입자크기는 sieve로 고르게 진 후, 밀봉하여 -20(3에 냉동 보관하면서 사용하였다.
- 5% NaCl 이 첨 가된 trypticase soy agar (TSA)에 27 ℃에서 48시간 배양하여 준비하였다. 각 실험구당 5마리씩 3반복으로하여 어류당박테리아 부유물을 0.1 ml씩 복강 주사한 후 폐사를 기록하였다. 폐사어의 폐사원인을 확인하기 위해 매일 폐사된 어체로 부터 신장을 채취하여 TSA에 배양하여 E.
- 넙치의 치어에 있어서 13-글루칸의 생리 상태에 미치는 영향을 조사 하기 위하여, 헤모글로빈, 헤마토크리트값, GOT, GPT 의 변화를 생리적 지표로써 조사하였다. 헤마토그리트는 글루칸을 공급한 사료구에서 높은 수치를 나타내었으며 , 특히 성장이 가장 좋았던 글루칸 0.
- 보체의 용혈 능력의 변화는 각 실험구별 실험어의 미부정맥으로부터 혈청을 분리한 다음 Matsuyama et al. (1985)의 방법을 변형하여 sheep red blood cells (SRBC)애 대한 보체의 용혈능을 조사하였다. 방법은 넙치에 대한 SRBC 항혈청(1:400으로희석)과 SRBC를 30 ℃에서 30분간 반응시켜 자극 시킨 SRBC 용액을 만든다.
- 본 실험은 치어기 넙치에 잇어서 B-1, 3 글루칸을 사료내 첨가시 성장, 비특이적 면역반응 및 질병저항성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 사료내 B-1, 3 글루칸을 수준별 첨가하여 실시였다. 실험어는 평균무게 3.
- 성장실험 종료 후 각 수조에서 3 마리씩의 어류를 임의로 잡아서 MS222로 마취시켰다. 마취된 어류로부터 두신을 무균적으로 분리한 후 4 ℃로 냉장한 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 넣어 가는 망사를 이용하여 세포들을 분리해 내었다.
- 식세포에서 방출되는 Reactive oxygen intermediates (ROIs)는 automatic photoluminometer (Bio-Orbit 1251, Finland)에 의해 정량적으로 분석하였다. 즉, 각 test cuvettee 조제 한 luminol(Sigma) 0.
- 실험어는 평균무게 3.2 g인 넙치 치어를 사용하였으며, 기초사료에 B-1, 3 글루칸을 대조구, 13-1, 3 글루칸 0.01, 0.025%, 0.05% 및 0.1%를 각각 첨가하여 총 5개 실험구로 3반복배치하여 6주간 실시하였다.
- 실험사료는 모든 원료를 혼합한 후 펠렛제조기로 압출 , 성형하였으며, 입자크기는 sieve로 고르게 진 후, 밀봉하여 -20(3에 냉동 보관하면서 사용하였다. 실험은 실험사료내 glucan의 함량을 로 하여 5개의 실험구로 나누어 실시하였다.
- 각 실험수조는 유수식으로 유수량은 1~2 L/min으로 조절하여 주었으며, 충분한 산소 공급을 위해 에어스톤을 설치하였다. 전 실험기간 동안 평균 수온은 19±2로 자연수온에 의존하였으며, 일일 사료공급량은 전 실험기간 동안 1일 2회 어체중 3~4%(dry matter base) 매일(10:00, 16:00) 공급하였으며 총사육실험 기간은 6주간 실시하였다.
- 간중량 지수와 전어체 성분 분석을 위한 실험어는 -20 ℃에서 보관하였다. 전어체 성분 분석을 위한 실험어는 각 수조마다 3미■리씩 무작위로 선택하였으며, 전어체의 단백질, 수분과 회분은 Association of Official Analytical Chemists (AOAC 1995)에 따라 분석을 실시하였고, 지방은 샘플을 -80℃에서 20시간 동결건조 후 Soxtec system 1046 (Tecator AB, Sweden)을 이용하여 분석하였다.
- 1에나타내었다. 첫 폐사개체는 E. tarda를 복강내 주사한지 3일 후부터 시작하였으며, 7일째 대조구에서 전량 폐사하여 7일째 종료하였다. 4일째는 대조구보다 B니, 3 글루칸을 첨가한 실험구가유의하게 높은 값을 나타내었으며(PV0.
- 1 ml씩 복강 주사한 후 폐사를 기록하였다. 폐사어의 폐사원인을 확인하기 위해 매일 폐사된 어체로 부터 신장을 채취하여 TSA에 배양하여 E. tarda의 존재를 확인하였다.
대상 데이터
- Zymosan (Sigma)은 본 실험사료 투여에 사용하지 않은 건강한 넙치 성어로부터 분리한 혈청과 혼합하여 30 ℃에서 30분간 배양하였다. 이 과정을 통해 opsonization이 된 zymosan을 원심분리하여 분리하고, HBSS를 이용하여 3회 세척하였다.
- 독성이 있는 E. tarda 부유액(1 x 103 * * 6 cfti/ml)을 1.5% NaCl 이 첨 가된 trypticase soy agar (TSA)에 27 ℃에서 48시간 배양하여 준비하였다. 각 실험구당 5마리씩 3반복으로하여 어류당박테리아 부유물을 0.
- 실험사료의 단백질원으로 북양어분, 젤라틴, 카제인을 사용하였으며 , 탄수화물원으로는 소맥분을 지 질원으로는 어유를 사용하였다. I시, 3 글루칸의 사료내 이용가능성을 확인하기위하여 실험사료내에 각각 0%(Control), 0.
- 실험어는 경상남도 거제 부경수산에서 운반된 넙치를 부경대학교 부설 수산과학연구소로 운반하여 2톤 원형수조에서 실험환경에 적응할 수 있도록 2주간 예비사육 하였다. 예비사육후 실험어는 평균무게 3.
- 실험에 사용한 식세포의 세포수는 in vitro 1><1俨 cells/ml HBSS 조절하였다.
데이터처리
- 모든 자료는 Computer Progrem Statistix 3.1(Analytical Software, St. Paul, Mn. US A)로 분산분석 (ANOVA)을 실시하여 최소유의차검정 (LSD: Least Significant Difference)으로 평균간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.
이론/모형
- 이 혼합액을 7]끔씩 흔들어 주면서 20℃에서 90분간 배양한 후, 4℃에서 1600 g로 원심분리 하여 상층액을 분광 흡광도계의 흡광도 414 nm에서 측정하였다. ACP (ACH50) 활성은용혈의 정도에 따라 계산하였다.
- 헤마토크리트치는 각 수조마다 3마리씩의 어류로부터 혈액을 채취하여 microhematocrit 방법 (Brown, 1980)으로 즉정을 하였다. 간중량 지수와 전어체 성분 분석을 위한 실험어는 -20 ℃에서 보관하였다.
성능/효과
- tarda를 복강내 주사한지 3일 후부터 시작하였으며, 7일째 대조구에서 전량 폐사하여 7일째 종료하였다. 4일째는 대조구보다 B니, 3 글루칸을 첨가한 실험구가유의하게 높은 값을 나타내었으며(PV0.05), 5일째과 6일째 있어서 또한 3일째 결과한 같은 값을 나타내었다. 하지만 실험 종료일인 7일째에 있어서는 B-1, 3 글루칸을 0.
- CL반응에 있어서 B-1, 3 글루칸을 0.1%로 첨가한 실험구가 다른 실험구간에 있어서 유의하게 높은 값을 나타내었으며(PV0.05), 8니, 3 글루칸 0.05%를 첨가한 실험구는 대조구, 时, 3 글루칸 0.01%와 0.025%를 첨가한 실험구보다 유의하게 높은 값을 나타내었다 (P<0.05). 혈청 내의 lysozyme 활성에 있어서는 B니, 3 글루칸 0.
- 이러한 결과의 차이는 실험 체계와 어종의 차이에 기인한 것으로 여겨진다. 결론적으루 본 연구에 따르면 치어기 넙치사료 내 B-1, 3 글루칸 0.05% 이상 0.1% 미만을 첨가하여 공급할 경우 성장률, 사료효율, 비특이적 면역반응 및 질병저항성에 있어서 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것을 사료된다.
- 025%를 첨가한 실험구보다 유의하게 높은 값을 나타내었으나, 보체대체활성의 경로에 있어서는 전실험구간의 유의한 차이를 보이지 않았다. 공격 실험 결과에서는 13-1, 3 글루칸을 첨가한 실험구가 대조구에 비하여 초기폐사율이 낮음을 확인할 수 있었으며, 상기 결과를 토대로, 넙치 치어의 경우 B-1, 3 글루칸을 0.05% 이상 0.1% 미 만을 사료에 첨 가하는 것이 성장, 사료효율 증진, 항산화능 및 질병저항성에 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것을 사료된다.
- 넙치 치어에 있어서 면역증강물질인 B-1, 3 글루칸의 첨가에 따르는 성장률(WG), 사료효율(FE), 일간성장률(SGR) 및 단백질 전환효율(PER)에 있어서 B-1, 3 글루칸 0.1% 공급한 사료구는 대조구와 비교하여 유의하게 높은 값을 나타내었으나(P<0.05), 글루칸 0.025%를 공급한 사료구와 글루간 0.05%를 공급한 사료구간에는 유의한 차이가 없었다. 면역반응 조사에 있어서 두신 식세포 활성 분석, 혈청내 lysozyme의 활성 조사 및 공격 실험한 결과는 B-1, 3 글루칸을 공급한 사료구가 대조구와 비교하여 유의적으로 높은 경향을 나타내었으며, 보체 대체 경로의 활성 (ACH50)에 있어서는 글루칸을 공급한 사료구와 대조구 사이에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 05%를 공급한 사료구간에는 유의한 차이가 없었다. 면역반응 조사에 있어서 두신 식세포 활성 분석, 혈청내 lysozyme의 활성 조사 및 공격 실험한 결과는 B-1, 3 글루칸을 공급한 사료구가 대조구와 비교하여 유의적으로 높은 경향을 나타내었으며, 보체 대체 경로의 활성 (ACH50)에 있어서는 글루칸을 공급한 사료구와 대조구 사이에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. Won et al.
- 면역증강물질인 B-1, 3 글루칸의 첨가에 따르는 증체율(WG)과 일간성장률(SGR)에 있어서 13-1, 3 글루칸 0.1 %를 공급한 사료구가 대조구와 비교하여 유의하게 높은 값을 나타냈다(P<0.05). 하지만 0.
- 본 실험에서 베타글루칸을 0.05% 이상 공급한 실험구가 대조구보다 상당히 lysozyme 활성이 높은 것을 알 수 있다. 베타글루칸의 복강주사에 의해 증가된 lysozyme 활성에 대한 여러보고가 있다(Engstad et al.
- 본 연구에서 B-1, 3 글루칸을 투여한 모든 실험구와 대조구 사이에서 보체 대체 경로(ACH50) 의 활성이 유의한 차이를 나타내지 않았다. Yano et al.
- 05%구와는 유의한 차이가 없었다. 비만도에 있어서는 B-1, 3 글루칸 0.05%와 0.1 %를 첨가한구가 대조구와 첨가구보다는 유의적으로 높았다.
- 05). 비특이적 면역반응 결과에 있어서는 B-1, 3 글루칸을 0.05%와 0.1%를 첨가한 실험구가 혈청의 lysozyme 활성 및 두신 phagocyte의 chemiluminescent (CL) 반응에서 대조구, B-1, 3 글루칸 0.01%와 0.025%를 첨가한 실험구보다 유의하게 높은 값을 나타내었으나, 보체대체활성의 경로에 있어서는 전실험구간의 유의한 차이를 보이지 않았다. 공격 실험 결과에서는 13-1, 3 글루칸을 첨가한 실험구가 대조구에 비하여 초기폐사율이 낮음을 확인할 수 있었으며, 상기 결과를 토대로, 넙치 치어의 경우 B-1, 3 글루칸을 0.
- 05%를 첨가한 실험구에 있어서는 유의한 차이를 보이지 않았다. 사료효율(FE)과 단백질전환효율(PER)에 있어서도 B-1, 3 글루칸 0.1 %를 공급한 실험구가 대조구 및 6-1, 3 글루칸 0.01%, 0.025, 0.05%를 공급한 실험구와 비교하여 유의하게 높은 값을 나타내었다(P<0.05). 비만도(CF)에 있어서는 B-1, 3 글루칸 0.
- 최종적으로 분리된 세포는 HBSS로 400 g에서 5분간 2번 세척하였다. 세포의 생존유무는 trypan blue stain을 이용하여 분석하였으며, 모든 실험구에서 분리된 세포들의 생존율은 98% 이상이었다. 실험에 사용한 식세포의 세포수는 in vitro 1><1俨 cells/ml HBSS로, in w'vo에서는 2><1俨 cells/ml HBSS 조절하였다.
- 025%를 첨가한 실험구보다 유의하게 높은 값을 나타내었다. 전반적으로 B-1, 3 글루칸을 첨가한 실험구들이 대조구에 비하여 E. tardar 균에 대한 저항성 증가를 확인할 수 있었다.
- 05). 증체율과 일간성장율에 있어서는 13-1, 3 글루칸 0.1%를 공급한 사료구가 대조구, B니, 3 글루칸 0.01%, 0.025%를 첨가한 구보다 유의하게 높은 값을 나타내었지만 B-1, 3 글루칸 0.05%구와는 유의한 차이가 없었다. 비만도에 있어서는 B-1, 3 글루칸 0.
- 총 6주간의 성장 실험결과, 면역증강물질인 B니, 3 글루칸의 첨가에 따르는 사료효율과 단백질전환효율에 있어서 B-1, 3 글루칸 0.1%를 공급한 사료구가 대조구와 다른처리구에 비하여 유의하게 높은 값을 나타냈다(P<0.05). 증체율과 일간성장율에 있어서는 13-1, 3 글루칸 0.
- tarda를 복강 주사하였을때 B-1, 3 글루칸을 공급하지 않은 어류보다 초기 폐사가 매우낮음을 알 수 있다. 특히, 0.05% B-1, 3 글루칸을 매일 공급한 어류의 누적 폐사율은 대조구보다 유의적으로 낮았다. 사료를 투여할 때 원충류 또는 세균의 감염에 대하여 어류의 방어능력을 증가시키는 베타글루칸의 효과에 대해서는 이미 많이 보고되어 있다(Robertsen et al.
- 변화를 생리적 지표로써 조사하였다. 헤마토그리트는 글루칸을 공급한 사료구에서 높은 수치를 나타내었으며 , 특히 성장이 가장 좋았던 글루칸 0.05%와 0.1% 사료구에서 가장 높은값을 보였다. Sim et al.
- 헤마토크리트(Hematocrit)는 B-1, 3 글루칸 0.05%와 0.1%를 첨가한 실험구가 다른 실험구에 비하여 유의하게 높은 값을 나타내었으며 (P<0.05), B-1, 3 글루칸 0.025%를 첨가한 실험구는 대조구와 B-1, 3 글루칸 0.01% 를 첨가한 실험구보다 유의하게 높은 값을 나타내었다(P<0.05). 혈청내 GOT에 있어서는 B-1, 3 글루칸을 0.
- 헤마토크리트치는 B-1, 3 글루칸 0.05%와 0.1%첨가한 실험구가 대조구와 B-1, 3 글루칸을 0.01%와 0.025%를 첨가한 실험구에 비하여 유의하게 높은 값을 나타내었다(P<0.05). 혈청내 GOT에 있어서 B-1, 3 글루칸 0.
- 05). 혈청 내의 lysozyme 활성에 있어서는 B니, 3 글루칸 0.05%와 0.1%를 첨가한 실험구가 다른 실험구보다 유의하게높은 값을 나타내었으며, 반면 대조구, B-1, 3 글루칸 0.이%와 0.025%를 첨가한 실험구간에 있어서는 유의한 차이를 보이지않았다. 보체대체활성경로의 활성(ACH50)에 있어서는 전실험구간에 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 05). 혈청내 GOT에 있어서는 B-1, 3 글루칸을 0.05%와 0.1%를 첨가한 실험구가 대조구, B-1, 3 글루칸 0.01%와 0.025%를 첨가한 실험구보다 유의하게 낮은 값을 나타내었다(PV0.05). 반면에 헤모글로빈과 GPT에 있어서 전실험구간에 유의한 차이를 보이지 않았다.
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