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문제 정의
- 보고되었다. 본 연구에서는 새로운 고소득 한약재로 예상되는 한국산 복령과 후박의 이용성 확대를 위하여 각각 추출물의 ABTS와 DPPH라디칼의 소거능, 환원력의 항산화능 효과 및 인체암 세포주(Hela, HepG2, HT-29, MCF-7)의 항암 활성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 한국산 복령과 후박의 이용성 확대를 위하여 각각 추출물의 ABTS와 DPPH라디칼의 소거능, 환원력의 항산화 능 효과 및 인체암 세포주의 항암활성에 대하여 조사하였다. 복령과 후박을 버섯균사체로 발효시킨 한약 추출액의 항산화 활성 (ABTS와 DPPH 라디칼소거, 환원력)은 시료 추출물의 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하였으며, DPPH 라디칼 소거활성은 ABTS보다 비교적 높게 나타났고, 원료 후박 추출물(21.
- 실온까지 냉각하였다. PDA(potato dextrose agar) 평판배지에서 7~15일간 배양시킨 각각의 버섯균 사체 를 직경 5 mm의 cork borer를 이용하여 일 정 하게 균사체를 절취하여 접종한 다음, 25~27oC에서 25~30일간 배양하였다. 버섯균사체로 발효가 종료된 복령과 후박은 동결건조한 후 실험용 시료로 사용하였다.
- 버섯균사체로 발효시킨 복령 및 후박 추출물의 ABTS [2, 2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] 라디칼 소거 활성을 BHA 및 vitamin C와 비교하여 측정하였다 (34). ABTS 라디 칼을 7 mM ABTS와 2.
- 96-well plate 당 10 uL의 시료를 넣고 희석된 ABTS 용액 190 uL를 가하여 7분간 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 의하여 라디칼이 소거되는 만큼의 흡광도가 감소되는 정도를 측정하였다.
- 전자공여작용은 버섯균사체로 발효시킨 복령 및 후박 추출물의 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 에 대한 전자공여 효과를 측정하였다(35). 즉 96-well 플레이트에에 탄올에 녹인 1.
- 5x10 4 M DPPH 용액 90 uL와 시료 10 UL 를 첨가한 후 10분 간 반응을 시킨 다음 microplate reader로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 아래의 식에 따라 계산하였으며, DPPH 용액 대신 에탄올을 첨가한 시료의 흡광도를 blank로 하였으며, 에탄올을 넣은 것을 대조구로 하였다. DPPH 라디칼 소거활성(%) = (1 — 10분 후 측정한 시료의 흡광도 변화) x 100/대조구의 흡광도
- 5 mL를 첨가하고, 10분 동안 5,000 rpm 으로 원심분리를 시켰다. 상징액 5 mL에 0.1% ferric chloride 1 mL를 가한 후, spectrophotometer(CE2021, CECIL, England) 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조 구로 비타민 C 를 표준 환원제로 사용하여 측정하였다 (36).
대상 데이터
- 버섯균사체 배양에 의한 발효한약의 제조를 위해 시판 중인 한국산 복령 (Poria cocos)과 후박(Machilus thun- bergii)을 한약 재료 판매점에서 구입하여 사용하였다. 복령과 후박의 발효를 위한 버섯 균사체 발효균주로는 팽이버섯 (Flammulina velutipes), 큰 느타리버섯(Pleurotus eryngii), 동중하초(Paecilomyces japonica)를 경 남농업 기술원으로부터 분양받아 사용하였다.
- 복령과 후박의 발효를 위한 버섯 균사체 발효균주로는 팽이버섯 (Flammulina velutipes), 큰 느타리버섯(Pleurotus eryngii), 동중하초(Paecilomyces japonica)를 경 남농업 기술원으로부터 분양받아 사용하였다.
- PDA(potato dextrose agar) 평판배지에서 7~15일간 배양시킨 각각의 버섯균 사체 를 직경 5 mm의 cork borer를 이용하여 일 정 하게 균사체를 절취하여 접종한 다음, 25~27oC에서 25~30일간 배양하였다. 버섯균사체로 발효가 종료된 복령과 후박은 동결건조한 후 실험용 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용한 암세포는 인체의 자궁경부암 HeLa cell, 간암 HepG2 cell, 대장암 HT-29 cell과 유방암 MCF-7 cell 을 사용하였으며, 각각 5% FBS(fetal bovine serum, Hyclone, USA) 및 항생제 혼합액을 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO, NY, USA) 배양액을 사용하였다. 암세포에 대한 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 실시하였다(37).
이론/모형
- 배양액을 사용하였다. 암세포에 대한 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 실시하였다(37). 암세포를 96 well plate에 1 x 105 cells/well이 되게 300 uL씩 분주하여 24시간 후 시료를 일정한 농도로 제조하여 10 uL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배 양기에서 72시간 배양하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 각 시료 추출물의 농도가 20~100 ug/assay로 증가할수록 ABTS 라디칼 소거능은 대체로 비례적으로 증가하였다. 그리고합성항산화제 BHA와 비타민 C는 50 ug/assay에서 각각 17.
- 거활성에 차이가 크게 나타내었다. 복령은 원료에 비하여 버섯 균사체 발효처리에서 그 소거활성이 대체로 40~50% 정도로 낮게 나타났는데, 100 ug/assay에서 큰 느타리로 발효시킨 복령이 8.18%로서 높았지만 원료 13.79%에 비해서는 낮은 소거능을 나타내었다. 후박의 소거활성은 원료추출물의 경우는 그 농도(20, 50, 100 ug/assay)에 따라 44.
- 의 농도 증가에 따른 비례적으로 증가하였으며, 그 소거 활성이 ABTS 라디칼 소거능보다 비교적 높게 나타났다. 각 농도별 후박은 원료 추출물 21.
- 각 농도별 후박은 원료 추출물 21.16~24.68%에서 복령의 원료 추출물 45.46 ~49.63%에 비하여 약 2배 이상 높은 수치를 나타내었으며, 발효후박에서 동충하초와 큰 느타리버섯발효 물은 팽이버섯 균사체 발효에 비하여 약 6% 이상의증가된 소거활성을 나타내었다.
- 대조구로 사용한 합성항산화제 BHA 와 비타민 C 는 20, 50, 100 ug/assay에서 각각 35.5~57.4%, 36.84~39.64% 범위의 소거활성으로 서로 비슷하였으며 (data 미제시), 이에 비하여 버섯균사체 팽이, 큰 느타리 및 동충하초로 배양시킨 발효복령과 발효후박 시료는 시험 농도별의 활성에서 각각 18.23~20.04%, 20.36~28.96% 범위로서 시료 처리에 따른 소거활성에 차이가 ABTS 보다는 비교적 작게 나타났다. 특히 원료후박의 추출물의 소거능은 3가지 발효 후박의 추출물에 비하여 ABTS 와 마찬가지로 차이가 많이 나타났다.
- 96% 범위로서 시료 처리에 따른 소거활성에 차이가 ABTS 보다는 비교적 작게 나타났다. 특히 원료후박의 추출물의 소거능은 3가지 발효 후박의 추출물에 비하여 ABTS 와 마찬가지로 차이가 많이 나타났다. 이상에서 복령과 후박의 버섯균사체 종류별과 발효 추출액 농도별에 따른 발효복령과 발효후박의 DPPH 소거 능은 큰 차이가 나타나지 않았다.
- 특히 원료후박의 추출물의 소거능은 3가지 발효 후박의 추출물에 비하여 ABTS 와 마찬가지로 차이가 많이 나타났다. 이상에서 복령과 후박의 버섯균사체 종류별과 발효 추출액 농도별에 따른 발효복령과 발효후박의 DPPH 소거 능은 큰 차이가 나타나지 않았다.
- 내는데, 추출물의 농도 증가에 따른 환원력도 대체로 완만한 비율로 높아지는 경향을 나타내었다. 그리고 복령 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 복령 (0.
- 비율로 높아지는 경향을 나타내었다. 그리고 복령 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 복령 (0.55~0.63) 에비하여 동충하초, 팽이버섯 및 큰 느타리 균사체로 발효시킨 시료 (0.50~0.62) 의 흡광도로 서로 비슷한 증가를 나타내었고, 후박 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 후박 추출물 (0.98~1.06) 이 3가지의 버섯 균사체 발효 후박 추출물 (0.76~1.01) 에 비하여 약간 높았다.
- 비율로 높아지는 경향을 나타내었다. 그리고 복령 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 복령 (0.55~0.63) 에비하여 동충하초, 팽이버섯 및 큰 느타리 균사체로 발효시킨 시료 (0.50~0.62) 의 흡광도로 서로 비슷한 증가를 나타내었고, 후박 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 후박 추출물 (0.98~1.06) 이 3가지의 버섯 균사체 발효 후박 추출물 (0.76~1.01) 에 비하여 약간 높았다.
- 자궁경부암 HeLa 세포(Fig. 4)는 각 추출물 농도별로 원료 복령은 31.46~ 57.79%로 3가지 버섯 균사체 발효 복령 추출물보다 다소 높은 저해활성(팽이버섯 30.49~49.76%, 큰 느타리 12.10~55.42%, 동충하초 25.07~26.38%)을 나타내었다. 그리고 발효후박의 추출물은 발효복령에 비하여 상대적으로 저해활성이 약간 낮았는데, 동충하초 13.
- 38%)을 나타내었다. 그리고 발효후박의 추출물은 발효복령에 비하여 상대적으로 저해활성이 약간 낮았는데, 동충하초 13.79~ 33.06%, 팽이버섯 13.17~27.44%, 큰 느타리 4.99~24.49% 순이었고, 원료후박의 추출물 8.03~18.01%에 비하여 높은 저해 활성을 나타내었으며, 그 중에서 동충하초의 발효 물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다.
- 간암 HepG2 세포(Fig. 5)는 발효복령의 추출물은 그 저해 활성이 팽이버섯 25.50~53.55%, 큰 느타리버섯 27.01~ 51.99%, 동충하초 26.65~39.81%로서 원료복령 11.70~ 29.89%에 비하여 높은 저해활성을 나타내었다. 그리고 200 Ug/assay 농도에서는 팽이버섯 균사체 발효복령의 추출물이 가장 높았는데, 원료복령과 동충하초 및 큰 느타리에 비하여 각각 1.
- 89%에 비하여 높은 저해활성을 나타내었다. 그리고 200 Ug/assay 농도에서는 팽이버섯 균사체 발효복령의 추출물이 가장 높았는데, 원료복령과 동충하초 및 큰 느타리에 비하여 각각 1.79, 1.35, 1.03배 높은 저해활성을 나타내었다. 그리고 큰 느타리를 제외한 발효후박의 추출물은 각 농도별로 팽이버섯과 동충하초 균사체를 배양한 발효 복령에서 각각 11.
- 9.72~24.45%에 비하여 200 μg/assay 농도에서는 각각 2.21 배, 2.05배 높은 저해활성을 나타내었다.
- 대장암 HT-29 세포(Fig. 6)는 복령의 원료 추출물에서 각 농도별로 63.22~78.86%를 나타내어 발효복령의 추출물에 비하여 높았으며, 그 발효한약은 200 μg/assay 농도에서 큰 느타리버섯 균사체로 복령발효시킨 경우(58.66%) 와 팽이버섯 균사체 발효시킨 것(57.97%)이 높은 저해 활성을 나타내는 경향이었다. 후박도 복령과 유사하게 원료 추출물 (44.
- 24%에 비하여 팽이버섯은 높은 저해 활성을 나타내었지만, 그 외 버섯균사체 발효복령은 약간 낮은 경향을 나타내었다. 또한 발효후박의 추출물도 팽이버섯 균사체 배양 추출물을 제외하고는 큰 느타리 32.17~63.72% 와 동충하초 균사체 배양물 40.37~62.93%로서 원료 후박 추출물 39.91~52.84%에 비하여 200 ug/assay 농도에서 각각 1.21 배, 1.19 배 높은 저해활성의 증진효과를 나타내었다. 이상에서 복령과 후박 추출물에 대한 항암활성 효과는 대체로 대장암>유방암>자궁경부암>간암 세포주 순으로 나타났으며, 복령이 후박 한약재보다 대체로 시험대상
- 또한 버섯균사체의 발효과정을 통하여 인체암 세포주의 저해 활성 증진은 간암세포에서 가장 뚜렷하게 나타났다.
- 조사하였다. 복령과 후박을 버섯균사체로 발효시킨 한약 추출액의 항산화 활성 (ABTS와 DPPH 라디칼소거, 환원력)은 시료 추출물의 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하였으며, DPPH 라디칼 소거활성은 ABTS보다 비교적 높게 나타났고, 원료 후박 추출물(21.16~24.68%)은 원료복령 추출물(45.4 6~49.63%)에 비하여 약 2배 이상 높았다. 복령 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 복령 (0.
- 이 높았다. 간암세포(HepG2)는 200 yg/assay 농도에서 팽이버섯 균사체 발효복령의 추출물이 가장 높았는데, 원료 복령과 동충하초 및 큰 느타리에 비하여 각각 1.79, 1.35, 1.03배 높은 저해활성을 나타내었다. 그리고 팽이버섯과 동충하초 균사체를 배양한 발효후박에서 각각 11.
- 03배 높은 저해활성을 나타내었다. 그리고 팽이버섯과 동충하초 균사체를 배양한 발효후박에서 각각 11.39~53.92%, 10.71~50.21% 범위였으며, 원료후박에 비하여 200 yg/as- say 농도에서 각각 2.21 배, 2.05배 높은 저해활성을 나타내었다. 유방암세포(MCF-7)는 발효복령 추출물의 저해 활성이 팽이버섯 균사체 (58.
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