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문제 정의
- Log rank statistics로 군 간의 유의성을 검증한 결과 잔대추출물에 의한 생존율 개선 효과가 관찰되었다(Table 1). 본 결과는 ATJH가 치명적인 간독성으로 인한 사망을 억제할 가능성을 제시한다.
- 본 연구에서는 민간에서 식품 또는 약용으로 섭취되고 있는 잔대를 주원료로 하는 간기능 향상 식품들의 추출물에 의한 APAP 독성 방어효능을 관찰하고, 간보호 효능의 기전을 규명하였다.
- ATJH 추출물은 xanthine/xanthine oxidase에 의한 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸모델에서 항산화 작용을 나타내었다. 본 연구에서는 잔대를 주원료로 하고 간 보호작용과 신진대사 촉진, 약성의 조화작용이 보고된 약재들의 추출물에 의한 간 독성방어 효능을 관찰함으로서 ANH추출물의 기능적인 효능을 객관적으로 도출하였다. 이러한 결과는 ATJH에 의한 해독화효소의 유도가 APAP에의해 생성된 반응중간체에 의한 간독성을 기능적으로 방어할 수 있음을 지지한다.
제안 방법
- ANH의 간보호 효능의 기전을 연구하기 위하여 간세포주인 H4UE에서 대표적인 해독화효소인 GST의 발현을 면역화학적으로 관찰하였다(Fig. 4A). ATJH는 1 mg/mL2] 용량에서 GST alpha 형인 GSTA2과 GSTA3/5의 발현을 약4배 증가시켰다(Fig.
- APAP 간 독성 동물모델에서 AIJH의 보호효과를 관찰하기 위하여 간 기능의 혈액학적 지표인 AST 및 ALT활성을 측정하였다. AST및 ALT는 간질환의 진단에 널리 사용되는 효소로서 혈청 중 간독성으로 인해 간세포의 괴사와 간조직의 파괴가 진행됨에 따라 효소가 혈중으로 유리되어 혈장 내에서 활성이 증가함으로, 이 두 효소의 활성은 간 손상의 지표로 이용된다(18).
- APAP를 투여하고 12시간에 각 실험군의 mice를 마취한 후 개복하여 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 3, 000rpm에서 15분간 원심분리하고 얻어진 상등액으로, AST 및 ALT kit를 이용하여 Reitman-Frankel의 방법(16)으로 즉정하였다.
- 고용량 APAP 투여모델에서 잔대 추출물은 lOOmg&g과 lOOO㎎/㎏S] 농도로 3 일간 경구투여 하였고, APAP를 450 mg/kg의 용량으로 투여하였다. APAP투여 후 24시간에 mouse의 생존율을 관찰하였다.
- 고농도의 APAP을 투여하여 심각한 간손상에 의한 사망을 유발한 후, ATJH에 의한 mouse의 생존율을 측정하였다. Kaplan Meier 생존율 분석법으로 분석한 결과, APAP 단독 투여군은 62% 사망률을 나타내었으나, ATJH를 100 ㎎/㎏와 1000 ㎎/㎏의 용량으로 전처치한 후 과량의 APAP를 투여한 경우 mouse의 생존율은 각각 71%와 82.
- 최종 경구투여 후 12시간 동안 절식시킨 후 APAP(350 ㎎/㎏)를 20%의 Tween 80에 현탁하여 경구투여하고 12시간 후에 채혈하고 간조직을 얻었다. 고용량 APAP 투여모델에서 잔대 추출물은 lOOmg&g과 lOOO㎎/㎏S] 농도로 3 일간 경구투여 하였고, APAP를 450 mg/kg의 용량으로 투여하였다. APAP투여 후 24시간에 mouse의 생존율을 관찰하였다.
- 상기의 추출물에 의한 간보호 효능을 관찰하기 위하여 간독성을 아세트아미노펜(APAP)(10)으로 유발하였다. APAP는 진통제 및 해열제로 사용되는 의약품으로 치료 용량에서 복용량의 85-90%는 sulfuric acid나 glucuronic acid와 포합되어 간독성 없이 배설되며, 4-10%는 cytocErome P450에 의해 N-acetyl-p-benzoquino-neimine의 독성중간산물이 생성되고, glutathione(GSH) 포합과정에의해 배설된다.
- 독성 실험에서는 각 군당 5-7마리씩 사용하였고 생존율 실험에서는 각 군당 11-32 마리의 동물로 실험하였다. 실험군은 3일(단기) 투여군과 7일(장기) 투여군으로 나누고 ATJH를 100-1000 m&kg/day의 농도로 경구투여 하였고, 대조군과 APAI처치군은 vehicle(멸균수)을 3일과 7일간 투여하였다(Fig. 1). 최종 경구투여 후 12시간 동안 절식시킨 후 APAP(350 ㎎/㎏)를 20%의 Tween 80에 현탁하여 경구투여하고 12시간 후에 채혈하고 간조직을 얻었다.
- 오가피 1kg, 잔대 3 kg, 은행 400 g, 헛개열매 400 g, 해삼 500 g, 전복 3 kg, 부추 300 g, 다슬기 3 kg, 생강 600 g, 감초 150g 잘 씻은 후 추출용기에 넣고 물 20L를 가하여 100℃에서 8시간 동안 열수 추출하였다. 얻어진 용액을 거름종이(Advantec NO.
- 본 연구에서 사용한 잔대를 주원료로 사용한 복합추출물은 상기에서 서술한 바와 같이 문헌보고에 근거하여(8) 간을 보호하는 것으로 알려진 한약재들과 민간요법에서 사용되는 생약재들로 구성된다. 잔대는 간보호 및 독성방어 효과를 나타내는 주성분으로, 오가피, 은행, 헛개열매, 해삼, 전복, 부추, 다슬기, 생강 및 감초는 간독성 방어와 함께 자양강장, 신진대사 촉진, 통증완화 및 약성 조화를 위한 부성분의 역할로 첨가하였다. 이 추출물은 간질환 예방 및 치료용 건강 기능성 식품 조성물로서 특허 등록되었다(9).
- 적출한 간 조직으로부터 H&E 염색을 통해 조직의 손상 정도를 관찰하였다. APAP 단독 투여한 군에서 80-90% 정도 간세포 괴사가.
- 조직의 광학현미경적 변화를 관찰하기 위하여 간 소엽을 절제하여 10% 포르말린에 고정시킨 후 통상적인 방법으로 탈수와 청명 과정을 거쳐 파라핀 왁스로 포매 하였다. 포매된 조직은 5㎛ 두께로 박절한 후 유리 슬라이드에 부착하고 hematoxylin-eosin (H&E)으로 염색한 다음, 광학 현미경으로 간 조직의 손상 정도를 관찰하였다.
- 포매된 조직은 5㎛ 두께로 박절한 후 유리 슬라이드에 부착하고 hematoxylin-eosin (H&E)으로 염색한 다음, 광학 현미경으로 간 조직의 손상 정도를 관찰하였다. 조직학적 검경은 각군당 조직샘플 4개를 무작위로 선택하여 이중맹검으로 평가하였다.
- 1). 최종 경구투여 후 12시간 동안 절식시킨 후 APAP(350 ㎎/㎏)를 20%의 Tween 80에 현탁하여 경구투여하고 12시간 후에 채혈하고 간조직을 얻었다. 고용량 APAP 투여모델에서 잔대 추출물은 lOOmg&g과 lOOO㎎/㎏S] 농도로 3 일간 경구투여 하였고, APAP를 450 mg/kg의 용량으로 투여하였다.
- Protein samplee -70℃에서 보관하면서 사용하였고, 면역화학적 방법을 위해 Sodium dode-cylsulfate-polyacrylamide gel(17) 전기영동장치를 이용하여 12% gel 에서 protein을 분리하고, nitrocellulose membrane에 단백질을 전이하였다. 측정하고자 하는 1차 항체를 반응시키고, HRP 포합 2차 항체를 반응한 후 ECL® chemiluminescence detection kit (Amersham Biosciences, Amersham, UK)로 현상하였다.
- 과정을 거쳐 파라핀 왁스로 포매 하였다. 포매된 조직은 5㎛ 두께로 박절한 후 유리 슬라이드에 부착하고 hematoxylin-eosin (H&E)으로 염색한 다음, 광학 현미경으로 간 조직의 손상 정도를 관찰하였다. 조직학적 검경은 각군당 조직샘플 4개를 무작위로 선택하여 이중맹검으로 평가하였다.
대상 데이터
- APAP는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 공급받았으며, 일차 항체로 anti-GSTA2, anti-GSTA3/5와 anti-GSTMl/2 항체를 Detroit R&D(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. 이차항체인 HRP (Horseradish peroxidase) conjugated된 rabbit anti-goat [gG와 goat anti-rabbit IgG를 Zymed Laboratories(San Francisco, CA, USA) 에서 구입하여 사용하였으며, 영동제약에서 aspartate aminotrans-ferase(AST) 및 alanine aminotransferase(ALT) kit(YD Diagnostics, Seoul, Korea)를 구입하였다.
- 간세포에서 기인한 H4IIE(CRL-1548)는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)사로부터 구입하여, 37℃ incubator 에서 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지에 10% fetal bovine serum과 50 μg/mL의 streptomycin과 50 unit/mL의 penicil-lin을 첨가하여 5%의 CQ를 유지하면서 배양하였다.
- 1주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 독성 실험에서는 각 군당 5-7마리씩 사용하였고 생존율 실험에서는 각 군당 11-32 마리의 동물로 실험하였다. 실험군은 3일(단기) 투여군과 7일(장기) 투여군으로 나누고 ATJH를 100-1000 m&kg/day의 농도로 경구투여 하였고, 대조군과 APAI처치군은 vehicle(멸균수)을 3일과 7일간 투여하였다(Fig.
- 화상(火傷)에 사용되는 식품이다. 본 연구에서 사용한 잔대를 주원료로 사용한 복합추출물은 상기에서 서술한 바와 같이 문헌보고에 근거하여(8) 간을 보호하는 것으로 알려진 한약재들과 민간요법에서 사용되는 생약재들로 구성된다. 잔대는 간보호 및 독성방어 효과를 나타내는 주성분으로, 오가피, 은행, 헛개열매, 해삼, 전복, 부추, 다슬기, 생강 및 감초는 간독성 방어와 함께 자양강장, 신진대사 촉진, 통증완화 및 약성 조화를 위한 부성분의 역할로 첨가하였다.
- 실험동물은 7주령 ICR(Institute of Cancer Research)계 웅성 mice를 오리엔트(Seoul, Korea)에서 구입하여 무균사육장치 내에서 1주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 독성 실험에서는 각 군당 5-7마리씩 사용하였고 생존율 실험에서는 각 군당 11-32 마리의 동물로 실험하였다.
- Louis, MO, USA)에서 공급받았으며, 일차 항체로 anti-GSTA2, anti-GSTA3/5와 anti-GSTMl/2 항체를 Detroit R&D(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. 이차항체인 HRP (Horseradish peroxidase) conjugated된 rabbit anti-goat [gG와 goat anti-rabbit IgG를 Zymed Laboratories(San Francisco, CA, USA) 에서 구입하여 사용하였으며, 영동제약에서 aspartate aminotrans-ferase(AST) 및 alanine aminotransferase(ALT) kit(YD Diagnostics, Seoul, Korea)를 구입하였다.
데이터처리
- ), and the survival percentage was monitored at 24 hr after APAP administration. Statistics were performed using Kaplan-Meier (Log-rank) test for survival rates (*p<0.05, significantly different from control; %? v 0.05, significantly different from APAP; #^<0.01, significantly different from APAP control).
- 생존율 실험은 Kaplan Meier 생존율 분석법으로 분석하였으며, log rank statistics로 유의성을 검정하였다. 실험 결과는 평균치 士 표준오차(mean 土 S.
- rank statistics로 유의성을 검정하였다. 실험 결과는 평균치 士 표준오차(mean 土 S.E.M)로 나타냈으며 , 대조군과 실험군과의 유의성은 ANOVA test로 분석하였다.
이론/모형
- 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 3, 000rpm에서 15분간 원심분리하고 얻어진 상등액으로, AST 및 ALT kit를 이용하여 Reitman-Frankel의 방법(16)으로 즉정하였다.
성능/효과
- APAP투여군은 정상동물군에 비하여 AST, ALT 활성도가 현저히 증가되었다. ATJH를 1000 ㎎/㎏의 용량으로 3일간 전투 여하였을 때 AST수치가 APAP 간독성 유발군에 비하여 약 70% 감소하였고(Fig.
- 유발되었다. ATJH 를 500㎎/㎏으로 3일간 전투여한 군에서 아성대조군의 심각한 괴사에 비하여 중등도 간괴사지표 수치를 나타내어 방어효능이 있는 것으로 관찰되었으며, 간세포 변성지표도 현저히 감소하였다(Table 2). ANH를 고용량(1000 mg/ kg, 3 days) 투여하였을 때, 간세포의 괴사 및 변성이 조직학적 검경에서 관찰되지 않았다(Table 2).
- 증가되었다. ATJH를 1000 ㎎/㎏의 용량으로 3일간 전투 여하였을 때 AST수치가 APAP 간독성 유발군에 비하여 약 70% 감소하였고(Fig. 2A), APAP 간독성 유발에 의한 ALT 증가도 80% 억제하여 간손상 지표로서 정상수치를 나타내었다(Fig. 3A). ATJH 를 500 ㎎/㎏의 용량으로 7일간 전투여 하였을 경우, 간독성 유발 군에서 증가된 AST 활성을 66% 억제하였다(Fig.
- 감초는 APAP의 대사과정에 관여하는 cytochrome P450을 감소시켜(19) APAP 반응 중간체의 생성을 억제함으로서 간독성을 낮출 수 있으며, 헛개나무는 알코올 분해효소의 활성을 증대시켜 숙취를 해소시키고, 해독 관련 효소의 활성을 유도하여 간기능을 개선시킨다(20). ATJH의 주원료로 사용한 잔대 단독추출물은 ATJH추출물보다 해독화 효소 발현을 현저하게 증가시키고, APAP동물모델에서 간독성을 현저하게 억제하였다. 이러한 결과로부터 ATJH추출물의 간독성 방어효능에서 잔대는 중요한 역할을 하는 원료로서 사려된다.
- Kaplan Meier 생존율 분석법으로 분석한 결과, APAP 단독 투여군은 62% 사망률을 나타내었으나, ATJH를 100 ㎎/㎏와 1000 ㎎/㎏의 용량으로 전처치한 후 과량의 APAP를 투여한 경우 mouse의 생존율은 각각 71%와 82.5%로 관찰되었다. Log rank statistics로 군 간의 유의성을 검증한 결과 잔대추출물에 의한 생존율 개선 효과가 관찰되었다(Table 1).
- 5%로 관찰되었다. Log rank statistics로 군 간의 유의성을 검증한 결과 잔대추출물에 의한 생존율 개선 효과가 관찰되었다(Table 1). 본 결과는 ATJH가 치명적인 간독성으로 인한 사망을 억제할 가능성을 제시한다.
- 3B). 본 결과는 ATJH를 단기간 또는 장기간 투여하였을 때 독성물질에 의한 간 손상을 현저하게 방어할 수 있음을 시사한다.
- 본 연구에서는 잔대를 주원료로 하고 간 보호작용과 신진대사 촉진, 약성의 조화작용이 보고된 약재들의 추출물에 의한 간 독성방어 효능을 관찰함으로서 ANH추출물의 기능적인 효능을 객관적으로 도출하였다. 이러한 결과는 ATJH에 의한 해독화효소의 유도가 APAP에의해 생성된 반응중간체에 의한 간독성을 기능적으로 방어할 수 있음을 지지한다.
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