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문제 정의
- 활성과 총 페놀 함량간의 상관관계를 분석하였다. 또한 가시오가피 주줄물 처리가 조골세포 증식률과 alkaline phosphatase 활성에 미치는 영향을 분석하여 가시오가피의 골다공증 예방 가능성을 규명하고자 하였다.
- 이 결과는 가시오가피의 가공법을 선정하는데 고려되어야 할 중요한 사항으로 사료된다. 본 연구를 통하여 가시오가피의 항산화 활성과 조골세포 증식 효과가 제시되었다. 한국산 가시오가피를 건강 기능 식품 소재로 개발하기 위해서는 동물 실험과 인체 시험을 통한 심도 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
- 따라서 오가피를 이용하여 우수한 골다공증 예방용 건강기능식품의 개발이 가능할 것이라고 생각된다. 이에 본 연구에서는 가시오가피 추출물의 추출 용매, 추출 부위(잎 , 줄기) 및 산 가수분해 전처리에 따른 가시오가피 추출물의 항산화 활성을 알아보고, 각각의 가시오가피 추출물이 MG-63 조골세포 생존력과 증식률 및 alkaline phosphatase(ALP)활성을 측정하여 가시오가피 추출물이 조골세포 활성에 미치는 영향을 분석하였다. 이와 같은 연구를 통하여 오가피 추출물의 항산화 활성과 조골세포 증식 효능을 검증하여 골다공증 개선 가능성을 확인하고자 한다.
- 이에 본 연구에서는 가시오가피 추출물의 추출 용매, 추출 부위(잎 , 줄기) 및 산 가수분해 전처리에 따른 가시오가피 추출물의 항산화 활성을 알아보고, 각각의 가시오가피 추출물이 MG-63 조골세포 생존력과 증식률 및 alkaline phosphatase(ALP)활성을 측정하여 가시오가피 추출물이 조골세포 활성에 미치는 영향을 분석하였다. 이와 같은 연구를 통하여 오가피 추출물의 항산화 활성과 조골세포 증식 효능을 검증하여 골다공증 개선 가능성을 확인하고자 한다.
제안 방법
- 96-well plate에 2x10, cells/well의 농도로 분주하고 24시간 후에 가시오가피 추출물을 농도별(0, 5, 10, 15, 20, 25 ㎍/mL)로 투여하여 3일간 배양하였다. 3일째 되는 날 MTT(20 |iL/well) 시 약을 첨가하고 2시간 동안 37-C에서 배양한 후 MTT가 formazan 으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 각각의 처리 군을 6 well씩 준비하고 6회 반복실험을 하였으며, 각 오가피 추출물에 대한 세포 증식효과는 6번 반복 실험의 평균값을 취한 후 아무것도 처리하지 않은 DMEM 용액에 배양한 대조군에 대한 백분율로 표시하였다(26).
- Promega)을 사용하여 측정하였다. 96-well plate에 2x10, cells/well의 농도로 분주하고 24시간 후에 가시오가피 추출물을 농도별(0, 5, 10, 15, 20, 25 ㎍/mL)로 투여하여 3일간 배양하였다. 3일째 되는 날 MTT(20 |iL/well) 시 약을 첨가하고 2시간 동안 37-C에서 배양한 후 MTT가 formazan 으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
- FRAP(ferric reducing ability of plasma) assay: FRAP 분석은 Benizie와 Strain(25)의 방법을 응용하여 가시오가피 시료 내항 산화력을 측정하였다. 이 방법은 colored ferrous tripyridyl triazine complex에 의해 ferric ion0] fferrous로 전환되어지는 과정을 분석함으로써 시료 내의 총 항산화력을 측정하는 방법이다.
- MG-63 human osteoblast 세포를 세포 배양 접시에 부칙 시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% antibacterial- antifungal solution(Gibco, Grand Island, NY, USA)과 10% FBS (Gibco)를 첨가한 Phenol-red free DMEM(Gibco)을 사용흐}여 배양하였다. 배양액은 2-3일에 한번 씩 교체하며, 1:1로 희석한 Tryphan blue 용액과 반응하여 염색되지 않은 살아 있는 세포를 계수하였다.
- 3일째 되는 날 MTT(20 |iL/well) 시 약을 첨가하고 2시간 동안 37-C에서 배양한 후 MTT가 formazan 으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 각각의 처리 군을 6 well씩 준비하고 6회 반복실험을 하였으며, 각 오가피 추출물에 대한 세포 증식효과는 6번 반복 실험의 평균값을 취한 후 아무것도 처리하지 않은 DMEM 용액에 배양한 대조군에 대한 백분율로 표시하였다(26).
- 건조 후 오가피의 줄기와 잎의 중량은 각각 처음 중량의 1/2, 1/4 정도가 감소하였으며, 수분은 약 4% 정도였다. 건조된 가시오가피의 줄기 50 g과 잎 30 g에 각각 13배의 증류수 혹은 50% 에탄올을 첨가하여 90℃에서 8시간 동안 추출하였다. 추출물을 원심분리 하여 상등액을 취하고 filter(l pm pore size)로 여과한 후 얻어진 여액을 동결건조하여 시료로 사용하였다.
- 때 그 활성이 증가한다. 그러므로 조골세포 활성을 알아보는 biomarker로서 MG-63 조골세포에서의 ALP 활성을 측정함으로써 , 가시오가피 추출물이 조골세포의 활성에 미치는 형향을 알아보았다. ALP활성은 아무런 시료도 처리하지 않은 배양액만 넣어준 control군에 대한 비율로 나타내었으며 그 결과는 Fig.
- MG-63 human osteoblast 세포를 세포 배양 접시에 부칙 시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% antibacterial- antifungal solution(Gibco, Grand Island, NY, USA)과 10% FBS (Gibco)를 첨가한 Phenol-red free DMEM(Gibco)을 사용흐}여 배양하였다. 배양액은 2-3일에 한번 씩 교체하며, 1:1로 희석한 Tryphan blue 용액과 반응하여 염색되지 않은 살아 있는 세포를 계수하였다. 배양 시 습도는 95%, 온도는 37℃를 유지하면서 5% CQ를 계속 공급하였다.
- 본 실험에서는 MG-63 조골세포를 6-well plate에 1 x 105 celV well 농도로 분주하고 밀생 단일층이 형성될 때까지 배양한 다음, 10% FBS, 1% antibiotics와 가시오가피 추출물이 적정 농도별(0, 5, 10, 15 ㎍/mL)로 함유된 배지로 교환한 후, 48시간 동안 배양하였다. 이후 각각의 well에서 배양액을 제거하고 0.
- 가지는 것으로 알려져 있다(31, 32). 본 실험에서는 가시오가피 추출물의 총 페놀 함량을 구하기 위하여 gallic acid를 페놀 표준물질로 하여 함량을 계산하였다.
- 본 연구에서는 가시오가피 추출물의 부위, 추출 용매, 산 가수분해 전처리에 따른 항산화 활성을 알아보고자 FRAP assay를 실시하였으며, 총 페놀 함량을 측정하고, 가시오가피 추출물의 항산화 활성과 총 페놀 함량간의 상관관계를 분석하였다. 또한 가시오가피 주줄물 처리가 조골세포 증식률과 alkaline phosphatase 활성에 미치는 영향을 분석하여 가시오가피의 골다공증 예방 가능성을 규명하고자 하였다.
- 사용하여 측정하였다. 실험은 5번 반복시행 하였으며 각 실험에서 얻어진 ALP 활성도는 단백질 양으로 보정하여 대조군의 ALP 활성에 대한 시료 첨가 군의 ALP비를 %로 계산하였다(27).
- 여러 차례 시행한 예비실험 결과에 의해 세포 독성이 나타나기 시작하는 고농도를 제외하고 시료 처리 농도(0, 5, 10, 15, 20, 25 ㎍/mL)를 선택하였으며, 조골 세포 생존율 및 증식률은 아무런 시료도 처리하지 않은 배양액만 넣어준 control군에 대한 비율로 나타내었으며 그 결과는 Fig. 4와 같다.
- Louis, MO, USA)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 것을 이용하여, 가수분해 반응의 산물인 />nitrophenol의 양을 측정함으로써 ALP의 농도를 간접적으로 산출하는 것이다. 이때 세포 수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 총 단백질양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포 수 당 ALP 활성도를 계산한다.
- 이 혼합 용액을 23℃에서 2시간 동안 방치시킨 후 760nm에서 absorbance 를 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 표준 곡선을 이용하여 검량선을 작성하여 총 페놀 함량을 계산하였다.
- 한의학 전통문헌과 임상경험을 바탕으로 효과적인 골다공증 예방 후보 한약을 검색하여 오가피를 찾을 수 있었다. 또한, Yang 등 (24)은 가시오가피가 함유된 성장 촉진용 조성물의 골성장 효과연구의 결과 오가피가 골무기질 밀도를 증가시키는 효과를 가지며 성장 촉진 및 골 강화에 응용할 수 있는 소재로 개발 가능성이 있음을 제시하였다.
- 항산화 활성: FRAP assay에 의한 가시오가피 추출물의 항산화 활성도를 측정하여 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity) 법으로 항산화 효과를 비교하여 Fig. 1와 Table 1에 나타내었다.
대상 데이터
- 강원도 양구의 농장에서 구입한 생지 가시오가피의 줄기와 잎을 분리하여 8(TC에서 15시간 동안 열풍 건조하였다. 농가의 경우는 60℃에서 36시간 동안 건조하였다.
- Louis, MO, USA)를 이용한 fucose 정량을 통해 가수분해가 잘 되었는지 확인 후 본 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용한 Trolox((+/-)-6-hydroxy-2, 5, 6, 8-tetrarrnethylchromane-2- carboxylic acid), gallic aicd, MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5- diphenyltetrazolium bromide)와 glucose assay kit는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
- 조골세포 배양(monolayer culture): 본 실험에 사용한 human osteoblast-like MG63 세포는 한국 세포주 은행(서울대학교 의과대학, Seoul, Korea)에서 분양받아 본 연구실에서 계대 배양하여 사용하였다. MG-63 human osteoblast 세포를 세포 배양 접시에 부칙 시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% antibacterial- antifungal solution(Gibco, Grand Island, NY, USA)과 10% FBS (Gibco)를 첨가한 Phenol-red free DMEM(Gibco)을 사용흐}여 배양하였다.
데이터처리
- 2)Values with different superscript within in a column are significant difference (F = 233083.0, /?<0.01) by Duncan's multiple range test.
- 2)Values with different superscript within in a column are significant difference (F = 591.790, p < 0.01 by Duncan's multiple range test.
- 모든 연속형 변수의 평균과 표준편차를 구하였으며, 군별 차이는 One-way ANOVA의 Scheflb와 Duncan 법을 이용하여 분석하였다. 가시오가피 추출물의 용매, 부위, 전처리에 따른 변화 차이는 paired t-test를 이용하여 분석하였다.
- 1 for Windows) program을 이용하여 통계분석을 시행하였다. 모든 연속형 변수의 평균과 표준편차를 구하였으며, 군별 차이는 One-way ANOVA의 Scheflb와 Duncan 법을 이용하여 분석하였다. 가시오가피 추출물의 용매, 부위, 전처리에 따른 변화 차이는 paired t-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 가시오가피 추출물 처리 후 세포 생존력 및 증식률: 조골세포의 증식 즉정은 단시간에 대량 검색이 가능한 MTT colorimetric assay 방법 (Cell titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation assay:, Promega)을 사용하여 측정하였다. 96-well plate에 2x10, cells/well의 농도로 분주하고 24시간 후에 가시오가피 추출물을 농도별(0, 5, 10, 15, 20, 25 ㎍/mL)로 투여하여 3일간 배양하였다.
- 단백질 농도는 표준시료로서 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)을 이용한 Bradford법을.사용하여 측정하였다.
- 조골세포 생존율 및 증식률에 미치는 영향 분석: 부위, 용매 및 전처리에 따른 가시오가피 추출물이 조골세포 생존 및 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 여러 차례 시행한 예비실험 결과에 의해 세포 독성이 나타나기 시작하는 고농도를 제외하고 시료 처리 농도(0, 5, 10, 15, 20, 25 ㎍/mL)를 선택하였으며, 조골 세포 생존율 및 증식률은 아무런 시료도 처리하지 않은 배양액만 넣어준 control군에 대한 비율로 나타내었으며 그 결과는 Fig.
- 총 페놀 함량(Total polyphenol content) 측정: 가시오가피 주출물의 총 페놀 함량을 측정하기 위하여 Folin-Denis방법을 이용하였다. 가시오가피 추출 시료 용액 20 μL에 3차 증류수 1, 200 piL을 첨가한 수 Folin & Ciocalteau's phenol reagent 100μL을넣고 잘 섞은 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다.
성능/효과
- ALP 활성에 미치는 영향 분석: ALP는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. 그러므로 조골세포 활성을 알아보는 biomarker로서 MG-63 조골세포에서의 ALP 활성을 측정함으로써 , 가시오가피 추출물이 조골세포의 활성에 미치는 형향을 알아보았다.
- IN HC1 처리에 따른 가시오가피 시료들의 총 페놀 함량 변화를 평가해 보았을 때, 모든 시료에서 HC1 가수분해에 의해 총 페놀 함량이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(p<0.001)(Fig. 2). 따라서 가시오가피 추출물에 함유되어 있는 페놀성분들은 산가수분해에 의해 영향을 받으며, 높은 항산화 효능을 위해서는 산 가수분해 전처리를 시행하지 않은 오가피 추출물을 이용하는 것이 바람직하다고 사료된다.
- IN HC1 처리에 따른 가시오가피 추출물의 항산화 효능을 평가해 보았을 때, 줄기의 경우에는 에탄올 추출물과 물 추출물 모두 유의적인 차이가 없었으나, 잎 추출물의 경우에는 에탄올 추출물0<0.01)과 물 추출물(p<0.05) 모두 IN HC1 가수분해에 의해 항산화 활성이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 1). 따라서 본 연구에서는 가시오가피 추출물의 성분에 관한 연구는 수행하지 않았으나, 가시오가피 추출물에는 항산화 활성을 가지는 성분이 다량 함유되어 있으며, 잎 추출물에 포함되어 있는 항산화 성분은 산에 의해 영향을 받는다고 사료된다.
- TEAC 값으로 표현된 가시오가피 추출물의 항산화 활성과 총 페놀 함량은 강한 양의 상관성을 보였다0< 0.001). 그러므로 가시오가피 추출물의 높은 항산화 활성은 추출물에 함유되어 있는 다량의 페놀 화합물에 기인한 것이라고 할 수 있다.
- 55 gM Trolox equivalents. 가장 높았고, 산 가수분해 처리한 줄기 에탄올 추출물(SE-HC1)의 TEAC value도 759.24 ±20.73 pM Trolox equivalents. 높은 항산화 활성을 나타내어 줄기의 에탄올 추출물이 줄기의 물 추출물이나 잎 추출물들보다 항산화 효능이 뛰어난 것으로 나타났다.
- 각 오가피 시료를 농도별(0, 5, 10, 15pig/mL)로 처리한 결과, 줄기의 물 추출물(SW) 15 ng/mL< 처리한 경우(p<0.05)를 제외하고는 염기성 인산 분해 효소 활성을 증가시키는 효과를 나타내지 않았다.
- 농가의 경우는 60℃에서 36시간 동안 건조하였다. 건조 후 오가피의 줄기와 잎의 중량은 각각 처음 중량의 1/2, 1/4 정도가 감소하였으며, 수분은 약 4% 정도였다. 건조된 가시오가피의 줄기 50 g과 잎 30 g에 각각 13배의 증류수 혹은 50% 에탄올을 첨가하여 90℃에서 8시간 동안 추출하였다.
- 73 pM Trolox equivalents. 높은 항산화 활성을 나타내어 줄기의 에탄올 추출물이 줄기의 물 추출물이나 잎 추출물들보다 항산화 효능이 뛰어난 것으로 나타났다. 이는 항산화능이 높다고 알려진 곰취의 경우보다 약 70, 000배 정도 높은 수치로서, 가시오가피 줄기의 에탄올 추출물이 갖는 항산화능이 매우 뛰어나다고 할 수 있다.
- 1). 따라서 본 연구에서는 가시오가피 추출물의 성분에 관한 연구는 수행하지 않았으나, 가시오가피 추출물에는 항산화 활성을 가지는 성분이 다량 함유되어 있으며, 잎 추출물에 포함되어 있는 항산화 성분은 산에 의해 영향을 받는다고 사료된다.
- 그러나 가시오가피에 함유된 폴리페놀 함량과 항산화 활성은 가시오가피의 부위와 추출 용매 및 산 처리 여부에 따라 차이가 나는 것으로 나타났다. 또한 가시오가피의 에탄올 추출물이 물 추출물에 비하여 조골세포 증식을 유의적으로 증가시켜주는 것으로 나타났다. 가시오가피의 물 추출물은 조골세포에서 염기성 인산 분해 효소의 활성을 유의적으로 증가 시켰다.
- 본 실험에서는 조골세포 증식에 큰 효과를 보였던 줄기의 에탄올 추출물의 처리가 조골세포의 ALP 활성을 유의적으로 증가시키지 못하고, 오히려 잎 추출물에서 유의적으로 증가시키는 것으로 나타났는데, 이는 가시오가피의 부위별로 존재하는 활성 성분의 종류와 함량이 다르기 때문이라고 사료된다. 따라서 활성 성분의 규명과 추출 조건을 최적화하는 공정 개발에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.
- 부위별 총 페놀 함량을 비교해 보았을 때, 에탄올 추출물에서는 잎(LE)보다는 줄기(SE)에서 총 페놀 함량이 유의적으로 높은 것으로 나타났으나0 <0.001), 물 추출물에서는 줄기(SW)보다 잎 (LW)에서 총 페놀 함량이 유의적으로 높았다0< 0.001).
- 산 가수분해 전처리 여부가 조골세포 증식에 미치는 영향을 분석해 보았을 때, 잎의 에탄올 추출물 5㎍/mL와 10|ig/mL를 처리한 군을 제외한 모든 군에서 IN HC1 로 가수분해 한 시료 처리에 의한 조골세포 증식률의 차이는 나타나지 않았다. 이는 산 가수분해에 의해 glycoside형태의 비활성 물질이 aglycone의 활성형으로 전환되었다하더라도 페놀 화합물과 같은 다른 활성 성분들에도 영향을 미쳤을 가능성이 있다.
- 연구결과 가시오가피에 함유된 총 페놀 함량과 FRAP 법으로 측정된 항산화 활성 간에 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났으므로, 가시오가피의 항산화 활성은 함유된 폴리페놀에 의해 나타나는 것으로 풀이된다. 그러나 가시오가피에 함유된 폴리페놀 함량과 항산화 활성은 가시오가피의 부위와 추출 용매 및 산 처리 여부에 따라 차이가 나는 것으로 나타났다.
- 줄기의 물 추출물(SWe 경우, 10ug/mL와 15 ng/mL< 처리해 준 군에서만 유의적으로 세포가 증식하는 것을 보였으며0< 0.05), 잎의 물 추출물(LW)을 처리한 세포군에서는 control 군에 비해 세포 증식효과를 보였으나 유의적인 차이는 보이지 않았다.
- 추출 용매에 따른 가시오가피 시료의 조골세포 증식 효과를 비교해 보았을 때, 에탄올 추출물이 물 추출물 보다 유의적으로 높은 조골세포 증식 효과를 나타내었으며0< 0.05), 추출 부위별로 비교해 본 결과, 잎 추출물 보다는 줄기 추출물이 효과적으로 조골세포를 증식시키는 것으로 나타났다(?<0.05). Kim 등(30)에 의하면 약콩은 0.
- 추출 용매에 따른 오가피의 부위별 항산화 활성을 비교해 보았을 때, 에탄올을 추출 용매로 사용한 경우 잎(LE)보다는 줄기 (SE)의 에탄올 추출물이 유의적으로 높은 항산화 활성을 보였으나 3 <0.001), 물 추출물에서는 줄기(SW)보다 잎(LW)이 유의적으로 높은 항산화 활성을 보였다0< 0.01).
- 추출용매가 가시오가피 추출물의 총 페놀 함량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 용매별로 비교해본 결과, 줄기(p<0.001)와잎0 <0.001) 모두 에탄올 추출물에서 유의적으로 높은 페놀 함량을 나타내었다.
- 추출용매가 가시오가피 추출물의 항산화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 용매별 비교를 해 보았을 때, 줄기0<0.01) 와 잎0<0.05) 모두 에탄올 추출물에서 유의적으로 높은 항산화 활성을 나타내었다.
- 05). 특히 줄기의 에탄올 추출물(SE) 20pg/mL를 처리한 군과 IN HC1 로가수분해 한 줄기 에탄올 추출물(SE-HC1) 10|ig/mL와 25 ㎍/mL 를 처리한 군에서 유의적으로 높은 증식효과를 보였다3<0.01).
후속연구
- 또한, Yang 등 (24)은 가시오가피가 함유된 성장 촉진용 조성물의 골성장 효과연구의 결과 오가피가 골무기질 밀도를 증가시키는 효과를 가지며 성장 촉진 및 골 강화에 응용할 수 있는 소재로 개발 가능성이 있음을 제시하였다. 따라서 오가피를 이용하여 우수한 골다공증 예방용 건강기능식품의 개발이 가능할 것이라고 생각된다. 이에 본 연구에서는 가시오가피 추출물의 추출 용매, 추출 부위(잎 , 줄기) 및 산 가수분해 전처리에 따른 가시오가피 추출물의 항산화 활성을 알아보고, 각각의 가시오가피 추출물이 MG-63 조골세포 생존력과 증식률 및 alkaline phosphatase(ALP)활성을 측정하여 가시오가피 추출물이 조골세포 활성에 미치는 영향을 분석하였다.
- 종류와 함량이 다르기 때문이라고 사료된다. 따라서 활성 성분의 규명과 추출 조건을 최적화하는 공정 개발에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.
- 이는 산 가수분해에 의해 glycoside형태의 비활성 물질이 aglycone의 활성형으로 전환되었다하더라도 페놀 화합물과 같은 다른 활성 성분들에도 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 이는 추후 연구를 통하여 산 가수분해에 따른 오가피 추출물의 성분 분석을 통하여 검증해야 할 것이라고 사료된다.
- 본 연구를 통하여 가시오가피의 항산화 활성과 조골세포 증식 효과가 제시되었다. 한국산 가시오가피를 건강 기능 식품 소재로 개발하기 위해서는 동물 실험과 인체 시험을 통한 심도 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
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