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문제 정의
- B)따라서 상황버섯에 함유된 저분자 물질에 대한 약리 활성에 관한 체계적이고 학술적인 연구가 시급하다고 볼 수 있다. 본 연구에서는 상황버섯의 활성연구에 선행하여 상황버섯의 화학적 성분연구의 결과로 4종의 ergosterol 화합물을 분리, 동정하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 'H- NMR spectrum에서 6H 6.48(1H, d, J=8.8Hz), 5H 6.22(1H, d, J= 8.8 Hz), 5h 5.2O(1H, dd, 15.6, 8.0 Hz), 8H 5.11 (1H, dd, J=15.6, 7.6 Hz)의 signal로부터 총 4개의 olefinic methine proton이 관측되었고, 8H 3, 95(1H, m)의 signal에서 oxygenated methine proton 1 개를 관측하였다. 8H 2.
- 감압농축하여 3개의 분획을 얻었다. EtOAc 분획을 silica gel column chromatography와 ODS column chromatography로 정제하여 4개의 화합물 l(6.5mg), 2(6.3mg), 3(16.6mg) 및 4(10.7 mg)를 분리하였다.
- EtOAc 추출물(PLE)을 silica gel column(e 6.5 X17 cm) chromatography (C.C.XCHCl3-MeOH =15:l->10:l—>7:l-> 5 :1 -> 3 :1 -> 1:1)를 실시하여 22개의 분획물(PLE1~PLE22) 을 얻었다. 그 중 PLE2(328mg) 분획을 silica gel C.
- 기기 및 시약. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA) 으로, 비선광도 ([a]D) 는 Polarimeter P-1010 (JASCO, Japan)으로, IR 스펙트럼은 Spectrum One(Perkin- Elmer, USA) 으로, EI/MS 와 FAB/MS 는 JMS-700(JEOL, Japan)로 측정하였다. 녹는점은 Fisher-John's Melting Point Apparatus(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다.
- PLE2(328 mg)의 17개의 분획물(PLE2-1~PLE2-17) 중에서 TLC를 확인한 결과 비슷한 발색양상을 보이는 11번 분획 (PLE2-11)부터 13번 분획 (PLE2-13)을 합한 PLE2-11-13(80.7 mg)에 대하여 ODS C.C.(MeOH-H2O=12:1, O 2.4X8 cm) 로정제하여 화합물 2[PLE2-ll~13-5, 6.3 mg, ODS TLC(MeOH- H2O=12:1, Rf: 0.21)]과 화합물 3[PLE2-11-13-8, 16.6mg, ODS TLC(MeOH-H2O= 15 : 1, Rf: 0.21)]을 분리하였다.
- 분배 추출하였으며, 물층은 다시 w-butanol(H-BuOH, 1/X2) 로분배 추출하였다. 각 층을 감압농축하여 EtOAc분획 (10 g), n- BuOH(18g) 및 물분획 (10 g)을 얻었다.
- 상황버섯으로부터 얻어진 MeOH 추출물에 대하여 용매의 극성에 따라 EtOAc, h-BuOH 및 HQ로 순차 분획하고 각 분획은 감압농축하여 3개의 분획을 얻었다. EtOAc 분획을 silica gel column chromatography와 ODS column chromatography로 정제하여 4개의 화합물 l(6.
- 화합물 3(colorless crystals}& positive FAB/MS 스펙트럼으로부터 분자량을 42&로 결정하였고, IR 스펙트럼에서 수산기와 (3400cm시) 이중결합 (1459cnT)의 존재를 확인하였다. 'H- NMR spectrum에서 6H 6.
대상 데이터
- 녹는점은 Fisher-John's Melting Point Apparatus(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다. Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60(Merck, Germany)을 octadecyl silica(ODS) gele LiChroprep RP-18(Merck, Germany)을 사용하였다. TLC는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254s® 사용하였고, TLC 상의 물질 검출에는 UV lamp와 10% aq.
- TLC는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254s® 사용하였고, TLC 상의 물질 검출에는 UV lamp와 10% aq. H2SO4를 사용하였다. 시료의 추출과 분획에 사용한 유기 용매는 대정화학주식회사에서 생산한 1급 시약을 사용하였다.
- 6 Hz로 coupling 하는 것으로 보아 ring 안에 이중결합 한 쌍과 chain 상에 trans 구조를 갖는 이중결합 한 쌍이 있는 것으로 예상할 수 있었다. l3C- NMR spectruni에서 총 28개의 carbon0] 관측되었고, 5C 135.3, 8C 135.1, 8C 132.2, 8C 130.6의 signal로부터 olefinic methine carbon 4개를 확인하였다. 또한 8C 82.
- XCHCl3-MeOH =15:l->10:l—>7:l-> 5 :1 -> 3 :1 -> 1:1)를 실시하여 22개의 분획물(PLE1~PLE22) 을 얻었다. 그 중 PLE2(328mg) 분획을 silica gel C.C.(〃- hexane-EtOAc = 4 :1 —> 1 :1, 0 3.7X13 cm)를 이용하여 17개의 분획물(PLE2-1~PLE2-17)을 얻었다.
- 또한 EtOAc 추출물(PLE)의 22개 분획물(PLE1 ~PLE22) 중 PLE4(312mg) 분획을 silica gel C.C.(n-hexane-EtOAc = 2 :1, O 3.7X13 cm)를 이용하여 22개의 분획물(PLE4-1 ~PLE4-22)을얻었다.
- H2SO4를 사용하였다. 시료의 추출과 분획에 사용한 유기 용매는 대정화학주식회사에서 생산한 1급 시약을 사용하였다.
- 식물시료 본 실험에서 사용한 상황버섯은 한국식품연구원에서 제공한 것으로 원료시료인 상황버섯은 linteus 재배 농가(경남 진주상황버섯 영농조합법인 머쉬가이)에서 2005년 5월에 구입한 순수국산시료로, 우석대학교 약학대학 생약학실의 김대근 교수가 동정하였으며, 표본시료(KHU-05012)는 경희대학교 생명공학원 천연물화학실험실에 보관되어 있다.
이론/모형
- NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA) 으로, 비선광도 ([a]D) 는 Polarimeter P-1010 (JASCO, Japan)으로, IR 스펙트럼은 Spectrum One(Perkin- Elmer, USA) 으로, EI/MS 와 FAB/MS 는 JMS-700(JEOL, Japan)로 측정하였다. 녹는점은 Fisher-John's Melting Point Apparatus(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다. Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60(Merck, Germany)을 octadecyl silica(ODS) gele LiChroprep RP-18(Merck, Germany)을 사용하였다.
성능/효과
- 따라서 이 화합물은 2개의 이중결합, 2개의 hydroxy, 1개의 methoxy를 가지고 있는 sterol로 추측되었다. 13C-NMR spectrum에서는 총 29개의 carbon이 관측되었고, 8 144.34 signal의 olefinic quaternary carboir을 비롯하여, 3개의 olefine mehtine carbon signal(8c 136.9, 133.1, 115.9)을 확인하였다. 또한 & 83.
- I3C-NMR spectrum 에서 총 28개의 carbon이 관측되어 이 화합물이 ergostane 골격을 갖는 것으로 추정되었다. 8C 142.4의 signal의 olefinic quaternary carbon을 비롯하여, 5개의 olefinic mehtine carbon signal(8c 135.4, 135.0, 132.3, 130.7, 119.7)을 확인할 수 있었으며, & 82.7과 8 78.3의 signal에서 oxygenated quaternary carbon 2개와 8C 663의 signal에서 oxygenated methine carbon이 관측되었다. 그리고 8C 13.
- 따라서 이 화합물은 쌍의 이중결합을 갖는 sterol로 추측되었다. I3C-NMR spectrum 에서 총 28개의 carbon이 관측되어 이 화합물이 ergostane 골격을 갖는 것으로 추정되었다. 8C 142.
- 이와 같은 chemical shift값과 'H- 및 i3c.NMR을 종합하여 분석하여 본 결과, chain 구조상에서 trans 배향(J =15.2, 6.0Hz)을 갖는 이중결합 한 쌍과 ring 안의 quaternary carbon과 연결된 이중결합 한 쌍이 있음을 알 수 있었고, 3개의 hydroxy기 중 하나에 methyl group이결합되어 있으며, methyl group0] 6개인 화합물로, methoxy 기의 탄소를 제외하면 28개의 탄소로 이루어진 ergoster이 화합물임을 추정할 수 있었다. 이를 종합하고 문헌⑺과 비교 조사해본 결과, 화합물 4는 ergosterol의 C-3에 β배향의 수산기와 C- 5에。배향의 수산기를 갖고, C-6에 a배향의 methoxy group0] 있으며, C-7(C-8) 및 C・22(C・23)에 2쌍의 이중결합을 가진 3β, 5a-dihydroxy-6y9-methoxyergosta-7, 22-diene(6-O- methylcerevisterol)로 동정 하였다.
- 따라서 이 화합물은 1개의 exometylene을 포함한 2개의 이중결합과 1개의 oxygenated methine을 가진 sterol로 추측되었다. l3C-NMR spectrum에서 총 28개의 carbon 이 관측되어 이 화합물이 ergostane 골격을 갖는 것으로 추정되었다. 또한 & 156.
- l3C-NMR spectrum에서 총 28개의 carbon 이 관측되어 이 화합물이 ergostane 골격을 갖는 것으로 추정되었다. 또한 & 156.7와 8C 139, 5의 signal로부터 olefinic quaternary carbon 2개와 8C 1174의 signal로부터 olefinic methine carbon 1 개를 확인하였으며, 8C 105, 9 에서는 exomehtylene carbon을 확인하여 이중결합이 2개 있음을 알 수 있었다. 8C 71.
- 얻어진 분획들에 대하여 TLC를 확인한 결과 13번 분획 (PLE4.13)부터 16번 분획 (PLE4-16)까지 비슷한 발색양상을 보여, 이 분획들을 합한 PLE4-13~16(61.3mge] 대하여 ODS C.C.(MeOH-H2O=10:1, <D 2.4X7 cm)로 정제하여 화합물 4[PLE4・13~16・6, 10.7 mg, ODS TLC(MeOH-H2O = 15 : 1, Rf: 0.19)]를 분리하였다.
- 얻어진 분획들에 대하여 TLC를 확인한 결과 5번 분획 (PLE2- 5)과 6번 분획 (PLE2-6)이 비슷한 발색양상을 보여, 두 분획을 합한 PLE2-5+6(45 mg)에 대하여 ODS C.C.(acetone-CH3CN = 1:3, <|> 2.4X7 cm)로 정제하여 화합물 l[PLE2-5+6-10, 6.5 mg, ODS TLC(acetone-CH3CN= 1:3, Rf: 0.26)]를 분리하였다.
- 이와 같은 chemical shift값을 보아 이 화합물은 ring안의 이중결합 한 쌍과 아lain 내에 exomethylene 이중결합 한 쌍을 포함하여 1개의 수산기를 가진 ergosterol 화합물임을 추정할 수 있었다. 이 결과를 종합하고 문헌(4)과 비교 조사해본 결과 이 화합물을 ergosta-7, 24(28)-dien-3^-ol(episterol) 로 동정하였다.
- 9)이 관측되었다. 이러한 H- 및 13C-NMR 을 종합하여 분석하여 본 결과, trans 배향(丿= 15.2, 8.0 Hz)을갖는 chain 상의 이중결합과 ring 안의 이중 결합(J= 8.8 Hz)을비롯하여 산소가 결합한 3개의 탄소 및 methyl기 6개를 갖는 탄소수 28개의 eiEosterol 화합물임을 추정할 수 있었다. 이를 종합하고 문헌6)과 비교 조사해본 결과, 화합물 3은 ergosterol 의 C.
- 8 Hz)을비롯하여 산소가 결합한 3개의 탄소 및 methyl기 6개를 갖는 탄소수 28개의 eiEosterol 화합물임을 추정할 수 있었다. 이를 종합하고 문헌6)과 비교 조사해본 결과, 화합물 3은 ergosterol 의 C.5와 C-8 사이에 a 배향의 peroxide와 C3에 0배향의 수산기를 갖고, C-6(C-7) 및 022(023)에 2쌍의 이중결합을 가진 5a, 8cc-epidioxyergosta-6, 22-dien-3p-ol(eieosterol peroxide) 로동정하였다.
- 0)이 관측되었다. 이와 같은 chemical shift값과 'H- 및 13C- NMR을 종합하여 분석하여 본 결과, chain 구조상에서 trans 배향(丿= 15.2 Hz)을 갖는 이중결합과, ring 구조 안에 2개의 이중결합(丿 =8.8 Hz)을 비롯하여 산소가 결합한 3개의 탄소를 가지며, methyl기 6개를 가진 탄소수 28개의 ergosterol 화합물임을 추정할 수 있었다. 이를 문헌5)과 비교 조사해본 결과, 화합물 2는 ergoster이의 C-5와 C-8 사이에 a배향의 peroxide와 C-3 에 a배향의 수산기를 가지고, C-6(C-7), C-9(C-11) 및 022(023) 에 3쌍의 이중결합을 가진 5 tz, 8(7-epidioxyergosta-6, 9(l 1 ), 22- trien-3^-ol(dehydroperoxyergosterol)5.
- 9)이 관측되었다. 이와 같은 chemical shift값을 보아 이 화합물은 ring안의 이중결합 한 쌍과 아lain 내에 exomethylene 이중결합 한 쌍을 포함하여 1개의 수산기를 가진 ergosterol 화합물임을 추정할 수 있었다. 이 결과를 종합하고 문헌(4)과 비교 조사해본 결과 이 화합물을 ergosta-7, 24(28)-dien-3^-ol(episterol) 로 동정하였다.
- 따라서 이 화합물은 2개의 이중결합과 1개의 oxygenated methine을 가진 ster이로 추측되었다. 특히 저자장 영역에서 두 개의 olefinic methine proton0] 8.8Hz로 coupling하고, 또 다른 두 개의 olefinic methine protone 각각 15.6 Hz로 coupling 하는 것으로 보아 ring 안에 이중결합 한 쌍과 chain 상에 trans 구조를 갖는 이중결합 한 쌍이 있는 것으로 예상할 수 있었다. l3C- NMR spectruni에서 총 28개의 carbon0] 관측되었고, 5C 135.
- 화합물 l(white powder)은 EI/MS에서 분자이온 피크가 m/z 426에서 관측되었고, IR(KBr, v) 스펙트럼에서 수산기(3370, 1040, 1030 cm시)와 이중결합(1450 cm-1)이 존재함을 확인하였다. 1H-NMR spectrum에서 SH 5.
후속연구
- 있다. B)따라서 상황버섯에 함유된 저분자 물질에 대한 약리 활성에 관한 체계적이고 학술적인 연구가 시급하다고 볼 수 있다. 본 연구에서는 상황버섯의 활성연구에 선행하여 상황버섯의 화학적 성분연구의 결과로 4종의 ergosterol 화합물을 분리, 동정하였기에 보고하고자 한다.
- 현재 상황버섯의 면역과 항암활성에 대한 연구는 eglucan성 다당류 등의 고분자 물질에 집중되어 있으나, 자실체에 다량으로 함유된 저분자 물질 약리 활성을 배제할 수 없다. 앞으로 이들 화합물들에 대한 다양한 생리적 및 약리적 활성을 검토함으로써 기능성 식품 또는 의약품의 소재로서의 충분한 가치가 있다고 여겨지며, 추후 이의 활용과 관련된 연구가 활발히 추진될 것으로 기대된다.
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