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문제 정의
- 본 연구는 유전자 발현 수준에서 멜라닌 색소 생합성을 조절하는 물질을 탐색하고자 티로시나아제 효소 활성 저해 효과가 있는 것으로 알려진 정향 {Eugenia caryophyllata) 으로부터 유용성 물질을 추출.분획하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 티로시나아제 유전자의 발현능 및 세포독성에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- B16 mouse melanoma cell 내에 티로시나아제 프로모터가 삽입된 유전자를 도입하기 위해 LipofectAMINE(Life Technologies Inc.)을 이용한 다음과 같은 방법으로 stable transfection을 실시하였다.
- B16 mouse melanoma cell 을 RPMI Medium 1640 평판배지에 세포 수가 3-4 X IT이 되도록 접종한 후 24 시간 배양한 다음, 배양액 1 mL에 6 iiL LipofectAMINE과 2 ug의 total plasmid DNA/를 5 시간 처리함으로써 형질전환을 실시하였다.
- Plasmid DNA 는 luciferase gene 을지닌 pGL2-basic vector(Promega)의 Sami site에 1.5 Kb의 neomycin 저항성 유전자를 삽입한 다음 1 Kb의 사람 티로시나아제 프로모터를 EcoRI/Kpnl site에 클로닝을 하였다.
- 동안 배양하였다. 그 후 각각의 well에 정향 메탄올 추출물과 용매 분획물들을 1 /zg/mL, 10 /zg/mL, 100 jtzg/mL, 500 *g/mL의 농도로 6 시간 동안 처리한 다음 luciferase 활성도를 측정하여 티로시나아제 유전자 발현에 미치는 효과를 조사하였다.
- 2 X 104 되게 접종한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 정향 메탄올 추출물을 각각의 well에 1 /zg/mL, 10 “g/mL, 100 ug/mL, 그리고 500 ug/mL 의 농도로 6 시간 동안 처리한 다음 Mosmanrjm의 방법에 따라 ELISA(Bio-Tek Inc.) 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다.
- 물질을 추출.분획하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 티로시나아제 유전자의 발현능 및 세포독성에 미치는 영향을 조사하였다.
- 세포내 유전자 도입을 통해 얻은 B16 mouse melanoma cell의 형질전환 유무를 확인하기 위하여 luciferase 활성도를 측정하였다. 형질전환을 통하여 얻은 콜로니들을 Trypsin-EDTA를 처리하여 떼어낸 후 24 well plate에 세포 수가 well당 6X104되게 분주하여 24 시간 동안 배양하였다.
- 시료의 추출은 건조된 생약을 세절하여 0.1 kg씩을 취한 다음 메탄올을 첨가하여 실온에서 1 주일 동안 정치시킨 후 3 회 추출.여과 하였다.
- 건조시킨 후 분말 형태로 제조하였다. 용매분획은 농축된 메탄올 추출물을 증류수로 현탁한 다음, 극성 도가 다른 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물을 이용하여 4 개의 층으로 분획하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 농축하였다. 그 후, 이농축물들은 동결.
- 8 의 25 mM Tris-Phosphate 완충용액으로 용해하였다. 용해된 세포들을 취하여 원심분리한 다음 얻어진 상등액에 대해 Luminometer(Lumat LB 9507, Berthold)를 이용하여 luciferase 활성도를 측정하였으며, luciferase 활성 도가 가장 높게 나타난 B16 mouse melanoma cell을 선별하여 이용하였다.
- 유전자 발현조절 수준에서 멜라닌 색소의 생합성에 관여하는 천연물질을 탐색하고자 티로시나아제 효소의 활성을 저해는 효과가 있는 것으로 알려진 정향으로부터 유용성 물질을 추출.분획하여 티로시나아제 프로모터가 도입된 B16 mouse melanoma cell에 처리한 결과 정향메탄올 추출물을 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도로 처리하였을 때의 티로시나아제 유전자 발현 능은 각각 약 138%와 245%로 대조군 세포에 비해 매우 높게 증가되었으나 500 /zg/mL 의 농도에서는 매우 심한 세포독성을 일으켰다.
대상 데이터
- B16 mouse melanoma celKATCC CRL 6323) 은 10%(w/v) 의 Fetal Bovine Serum(FBS, GibcoBRL), l%(w/v) Antibiotic(Gibco BRL), 그리고 2 mM 의 L-Glutamine 이 포함된 RPMI Medium 1640(Gibco BRL)에서 CO2 분압을 5%로 조절하여 37℃에서 배양하였으며, 세포는 36-48 시간 주기로 계대 배양하여 유지하였다.
- analogue1?] Geneticin 418(600 mg/mL)이 들어있는 선택배지에서 배양한 후 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell을 선별하였다.
- 본 실험에 사용한 정향은 광주 시내 건재상에서 구입하여 감정한 후 사용하였으며, 표준품은 동강대학 향장품 연구실에 보관하였다.
이론/모형
- Then, the cells were solubilized with lysis buffer and centrifuged at 13,000×g for 2 - 3 min. The supernatants were used for luciferase assay. Values are the means of results from triplicate experiments.
성능/효과
- 4가지 용매 중에서 극성도 가장 낮은 methylene chloride 용매 분획물을 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도로 처리하였을 때 티로시나아제 유전자의 발현능은 각각 약 162%와 221%로 대조군 세포에 비해 크게 증가되었지만, 500 ug/mL의 농도에서는 세포가 고사될정도로 독성 이심하여 luciferase 활성도의 측정이 불가능하였다. 이 결과는 정향 메탄올 추출물을 형질 전환된 세포에 처리했을 때와 매우 유사한 경향을 나타내었다.
- B16 mouse melanoma cell에 정향 메탄올 추출물을 처리한 다음 MTT assay를 실시하여 세포독성을 측정한 결과, 추출물의 처리농도에 따라 다른 결과를 보여주었다(Fig. 2). 즉, 정향 메탄올 추출물은 처리농도의 증가에 따라 세포의 활성능이 증가하다 감소하는 경향을 나타내었다.
- 티로시나아제 유전자 발현능이 약 118%로 약간증가되는 효과를 보여 주었다. 그러나 100 ug/mlX 500 농도에서는 티로시나아제 유전자의 발현능이 각각 약 51%와 24%로 대조군 세포보다 오히려 낮게 나타났으나 현미 경상에서 세포가 고사되는 현상이 육안으로 관찰되었다. 한편, Park 등에 의해서 티로시니아제활성저해 효과가 있다고 알려진 butyl alcohol 과 물 용매 분획물을 10 ug/mL와 100 ug/mL 농도로 처리하였을 때 티로시나아제 유전자의 발현 능은 대조군 세포와 거의 차이가 없었다.
- 한편, Park 등에 의해서 티로시니아제활성저해 효과가 있다고 알려진 butyl alcohol 과 물 용매 분획물을 10 ug/mL와 100 ug/mL 농도로 처리하였을 때 티로시나아제 유전자의 발현 능은 대조군 세포와 거의 차이가 없었다. 그러나 500 ug/mL의 고농도로 처리하였을 때의 티로시나아제 유전자의 발현능은 각각 약 38% 와 78%로 억제하는 효과를 보여 주었으며, methylene chloride나 ethyl acetate 용매 분획물들을 처리하였을 때와는 달리 세포 고사 현상이 발견되지 않았다. 이 결과를 통해서 티로시나아제 유전자자 발현능은 정향의 용매 분획물에 따라 달라진다는 것이 입증되었으며, 특히 butyl alcohol과 물 용매 분획물 내에는 티로시나아제 효소의 활성 저해 효과와.
- 물질을 추출.분획하여 티로시나아제 프로모터가 도입된 B16 mouse melanoma cell에 처리한 결과 정향메탄올 추출물을 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도로 처리하였을 때의 티로시나아제 유전자 발현 능은 각각 약 138%와 245%로 대조군 세포에 비해 매우 높게 증가되었으나 500 /zg/mL 의 농도에서는 매우 심한 세포독성을 일으켰다. 그리고 methylene chloride 용매 분획물은 메탄올 추출물을 처리하였을 때와 유사한 결과를 보여 주었다.
- 정향 메탄올 추출물을 B16 mouse melanoma cell에 처리하였을 때 나타난 세포 활성능은 이 추출물을 형질 전환된 B16 mouse melanoma cell에 처리하였을 때 나타난 티로시나아제 유전자 발현능증가에 비해 낮게 나타났지만 서로 유사한 경향을 보여주었다. 이 결과로 보아 정향 메탄올 추출물을 형질전환 된 세포에 처리하였을 때의 티로시나아제 유전자 발현 능은 세포의 활성능과 밀접한 관련이 있는 것으로 보여진다. 즉 정향 메탄올 추출물을 세포에 처리하였을 때 세포 활성능이 증가함으로서 티로시나아제 발현능도 증가한 것으로 추측된다.
- 그러나 500 ug/mL의 고농도로 처리하였을 때의 티로시나아제 유전자의 발현능은 각각 약 38% 와 78%로 억제하는 효과를 보여 주었으며, methylene chloride나 ethyl acetate 용매 분획물들을 처리하였을 때와는 달리 세포 고사 현상이 발견되지 않았다. 이 결과를 통해서 티로시나아제 유전자자 발현능은 정향의 용매 분획물에 따라 달라진다는 것이 입증되었으며, 특히 butyl alcohol과 물 용매 분획물 내에는 티로시나아제 효소의 활성 저해 효과와. 티로시나아제유전자의 발현을 억제하는 효과를 지닌 구성성분들이 함유되어 있는 것으로 추측되어진다.
- 정향의 메탄올 추출물을 감압농축하여 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물 등의 4가지 용매를 이용하여 분획한 다음 이들을 티로시나아제 프로모터 유전자가 도입된 된 세포에 처리한 결과, 그 효과는 용매 분획물에 따라, 또는 분획물의 처리농도에 따라 다른 결과를 보여 주었다(Table 1). 4가지 용매 중에서 극성도 가장 낮은 methylene chloride 용매 분획물을 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도로 처리하였을 때 티로시나아제 유전자의 발현능은 각각 약 162%와 221%로 대조군 세포에 비해 크게 증가되었지만, 500 ug/mL의 농도에서는 세포가 고사될정도로 독성 이심하여 luciferase 활성도의 측정이 불가능하였다.
- 정향의 메탄올 추출물을 티로시나아제 프로모터 유전자가 도입 된 B16 mouse melanoma cell에 처리한 결과 티로시나아제 유전자의 발현 능은 추출물의 처리 농도에 따라 다르게 나타났다(Fig. 1). 즉 티로시나아제 유전자의 발현 능은 정향 메탄을 추출물을 1 ug/mL의 농도로 처리하였을 때에는 약간 증가하였으나 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도에서 그의 발현 능은 각각 약 138%와 245%로 대조군 세포에 비해 크게 증가하였다.
- 이 결과로 보아 정향 메탄올 추출물을 형질전환 된 세포에 처리하였을 때의 티로시나아제 유전자 발현 능은 세포의 활성능과 밀접한 관련이 있는 것으로 보여진다. 즉 정향 메탄올 추출물을 세포에 처리하였을 때 세포 활성능이 증가함으로서 티로시나아제 발현능도 증가한 것으로 추측된다. 따라서 정향을 메탄올 추출물 형태로 멜라닌 색소의 생합성에 관여하는 티로시나아제 유전자 발현조절 물질로 이용하기 위해서는 보다 많은 연구가 필요하다.
- 1). 즉 티로시나아제 유전자의 발현 능은 정향 메탄을 추출물을 1 ug/mL의 농도로 처리하였을 때에는 약간 증가하였으나 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도에서 그의 발현 능은 각각 약 138%와 245%로 대조군 세포에 비해 크게 증가하였다. 그러나 500 ug/mL의 고농도에서는 광학 현미경상에서 세포가 심하게 분해되어 그 잔여물이 확인될 정도로 세포독성이 심하여 티로시나아제 유전자 발현율은 약 2%로 매우 낮게 나타났다.
- 2). 즉, 정향 메탄올 추출물은 처리농도의 증가에 따라 세포의 활성능이 증가하다 감소하는 경향을 나타내었다. 정향 메탄올 추출물을 1 ug/mL의 농도로 처리하였을 때에는 세포 활성능이 102%로 대조 군세 포와 유사하였으나 10 ug/mL와 100 ng /mL의 농도로 세포에 처리하였을 때에는 세포 활성능이 각각 약 128%와 187%로 대조군 세포에 비해 크게 증가되었으나 500 ug/mL의 농도로 처리하였을 때에는 세포 활성능이 6%로 오히려 현저하게 감소하여 세포독성을 정확하게 평가하는 것이 어려웠다.
- Ethyl acetate 용매 분획물은 10 ug/ml의농도로 세포에 처리하였을 때에는. 티로시나아제 유전자 발현능이 약 118%로 약간증가되는 효과를 보여 주었다. 그러나 100 ug/mlX 500 농도에서는 티로시나아제 유전자의 발현능이 각각 약 51%와 24%로 대조군 세포보다 오히려 낮게 나타났으나 현미 경상에서 세포가 고사되는 현상이 육안으로 관찰되었다.
- 그러나 butyl alcohol과 물 용매 분획물을 500 ug/mL의 고농도로 처리했을 때에는 티로시나아제 유전자의 발현능이 각각 약 38%와 78%로 대조군 세포에 비해 오히려 감소하는 결과를 보여주었다. 한편, MTT assay를 실시한 결과 정향 메탄올 추출물의 세포 활성능은 10 ug/mL와 100 ug/mL의 농도에서 크게 증가하였으며, 이는 티로시나아제 유전자의 발현 능의 증가와 밀접한 관련이 있는 것으로 추측된다. 따라서 정향을 멜라닌 색소의 생합성을 조절하는 목적으로 응용하기 위해서는 메탄올 추출물 형태로 이용하기 보다는 다음 용매 분획하여 얻은 butyl alcohol 이나 물 분획물을 이용하는 것이 보다 효과적이라 판단된다.
후속연구
- 본 연구에서 정향 메탄올 추출물이 기존의 연구들과 약간 다른 결과를 보여주는 것은 실험 방법 및 조건의 차이, 즉 기존에 연구들은 주로 티로시나아제 효소의 활성을 저해하는 수준에서 이루어진 것에 반하여 본 연구는 세포내에 도입된 유전자의 발현을 조절흐'!는 수준에서 이루어진 점을 대표적인 예로 들 수 있다. 그러나 앞으로 보다 연구를 통하여 티로시나아제 효소의 활성을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려진 정향 메탄올 추출물이 형질전환 된 세포에 처리하였을 때 티로시나아제 유전자의 발현능이 증가하는 원인 및 그의 기작 등에 대한 규명이 필요하다.
- 즉 정향 메탄올 추출물을 세포에 처리하였을 때 세포 활성능이 증가함으로서 티로시나아제 발현능도 증가한 것으로 추측된다. 따라서 정향을 메탄올 추출물 형태로 멜라닌 색소의 생합성에 관여하는 티로시나아제 유전자 발현조절 물질로 이용하기 위해서는 보다 많은 연구가 필요하다.
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