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문제 정의
- 본 연구에서는 지리산 적송잎의 용매별 추출물에 대한 항산화 활성을 측정하여 제품의 가공법에 따른 활성의 차이를 검증하여 좀 더 나은 가공법 개발에 적용할 수 있도록 하고자 한다.
제안 방법
- Yoo 등[2이은 솔잎 수용액 추출물의 총 폴리페놀성 성분의 함량을 측정하였고 추출시료의 항산화 활성을 측정한 결과 높은 항산화 활성을 나타낸다는 사실을 확인하였다. 본 연구에서는 다양한 용매를 이용한 추출방법에 따른 솔잎 추출 시료에 포함된 총 폴리페놀성 성분 및 proanthocyanidin의 함량을 비교하였고 이들 시료의 항산화 활성 차이를 비교하였다. 그 결과, Choi 등의 연구와는 달리 솔잎으로부터 열수를 이용한 추출물이 에탄올 추출물보다 추출수율 및 항산화 활성이 더 높았다.
- 에탄올 및 헥산 추출물은 각각 적송잎 분말 250 g에 95% 에탄올 및 헥산을 각각 1, 500 ml 씩 첨가하여 상온에서 24시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 아임계(Sub- supercritical) 추출물은 적송잎 분말 232 g에 60 kgf/cm, 의 C6 가스를 이용하여 separator 1은 120°C로, separator 2는 80°C로 설정하여 210분간 추출을 행한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다.
- 열수 추출물은 적송잎 분말 743 g에 물 4, 500 ml을 첨가하여 121°C에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 에탄올 및 헥산 추출물은 각각 적송잎 분말 250 g에 95% 에탄올 및 헥산을 각각 1, 500 ml 씩 첨가하여 상온에서 24시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 아임계(Sub- supercritical) 추출물은 적송잎 분말 232 g에 60 kgf/cm, 의 C6 가스를 이용하여 separator 1은 120°C로, separator 2는 80°C로 설정하여 210분간 추출을 행한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다.
- (DPPH, Sigma)을 사용하여 측정하였다[18]. 여러 농도의 적송잎 추출물(최종농도: 500, 250, 100, 50, 10 gg/ml) 50 μl에 DPPH (200 nM/ml in ethanol) 150 μl를 혼합한 후 10 분간 vortexing을 행하였다. 실온의 차광한 상태에서 30분간 반응시킨 후 528 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 방법으로 추출을 행하였다. 열수 추출물은 적송잎 분말 743 g에 물 4, 500 ml을 첨가하여 121°C에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 에탄올 및 헥산 추출물은 각각 적송잎 분말 250 g에 95% 에탄올 및 헥산을 각각 1, 500 ml 씩 첨가하여 상온에서 24시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다.
- 항산화제의 검색에 널리 이용되고 있다. 적송잎 용매별 추출물에 대한 DPPH를 이용한 전자 공여능을 분광광도계분석에 의해 측정하였다. 표준물질인 BHT의 경우는 농도에 의존한 전자 공여능을 나타냈으며 500 μg/ml의 농도에서 약 80%의 높은 전자 공여능을 나타냈다(Fig.
- 0)를 만들어 이것을 stock solution 으로 사용하였다. 적송잎 추출물 0.2 ml과 linoleic acid 0.2 ml을 시험관에 넣고 혼합한 후 phosphate buffer 0.4 ml와 증류수 0.2 ml를 가하여 40°C에서 incubation하면서 일정 간격으로 활성을 측정하였다. 활성 측정방법은 혼합용액에서 0.
- 적송잎 추출물 1 ml와 linoleic acid (25 mg/ml in EtOH) 1 ml를 시험관에 넣고 혼합한 후 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0) 2 ml와 증류수 1 ml를 가하여 40°C에서 incubation 하면서 일정 간격으로 활성을 측정하였다. 활성측정방법은시료액 0.
- 적송잎 추출물의 전자 공여 능은 2, 2-diphenyl-l-picryl- hydrayl (DPPH, Sigma)을 사용하여 측정하였다[18]. 여러 농도의 적송잎 추출물(최종농도: 500, 250, 100, 50, 10 gg/ml) 50 μl에 DPPH (200 nM/ml in ethanol) 150 μl를 혼합한 후 10 분간 vortexing을 행하였다.
- 이들 중 특히 proanthocyanidin 은 심장혈관 보호작용과 항산화 활성에 크게 기여하고 있다. 지리산 적송잎으로부터 열수, 에탄올, 헥산 및 아임계 장치를 이용하여 추출물을 제조하여 총 폴리페놀성 물질 중에 포함된 proanthocyanidin의 함량을 측정하였다. 그 결과, 총 폴리 페놀성 물질 및 proanthocyanidin의 농도가 열수 추출물의 경우 가장 높게 나타났으며, 에탄올 추출물, 헥산 추출물, 아임계 추출물 순으로 낮아졌다.
- 반응액에 대해 원심분리 Q4, 000x g, 5분)를 행하여 불용성 성분을 제거한 상층 액을 새 tube에 넣고 이를 5% HC1 butanol (v/v)로 10배 희석시킨 후, 550 nm에서 즉시 홉광도를 측정하였다. 표준물질로 96% proanthocyanidin (Grape seed extract, Naturex, Avignon, France)을 사용하여 농도를 계산하였다.
- 475 ml 첨가하고 실온에서 60분간 반응시 킨 후 724 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 catechin (Sigma)을사용하여 농도를 계산하였다.
- 2 ml를 가하여 40°C에서 incubation하면서 일정 간격으로 활성을 측정하였다. 활성 측정방법은 혼합용액에서 0.1 ml을 취하여 시험관에 넣고 70% ethanol 3 ml, ammo nium thiocyanate 용액 0.1 ml, ferrous chloride 용액 0.1 ml 를 혼합한 후 정확히 3분 후에 흡광도(500 nm)를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 BHT 및 96% proanthocyanidin 을 표준물질로 사용하였다.
- 0) 2 ml와 증류수 1 ml를 가하여 40°C에서 incubation 하면서 일정 간격으로 활성을 측정하였다. 활성측정방법은시료액 0.5 ml를 원심분리관에 넣고 35% trichloroacetic acid 0.25 ml와 0.75% aqueous TBA (Sigma) 0.5 ml를 가하여 혼합한 후 boiling water bath에서 가끔 흔들면서 15분간 처 리 하고 흐르는 물에 냉각시킨 후 70% trichloroacetic acid 0.5 ml를 가한 다음 20분 후 15분간 원심분리(3, 000x g)를 행하여 상층액에 대한 흡광도(532 nm)를 측정하였다[17]. 이때 활성 비교를 위하여 BHT 및 96% proanthocyaWdin을 표준물질로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 적송잎은 2007년 7월경 지리산에서 채취하여 60°C에서 열풍건조한 후 믹서로 분말화시켜 다음의 4가지 방법으로 추출을 행하였다. 열수 추출물은 적송잎 분말 743 g에 물 4, 500 ml을 첨가하여 121°C에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다.
- 5 ml를 가한 다음 20분 후 15분간 원심분리(3, 000x g)를 행하여 상층액에 대한 흡광도(532 nm)를 측정하였다[17]. 이때 활성 비교를 위하여 BHT 및 96% proanthocyaWdin을 표준물질로 사용하였다.
- 1 ml 를 혼합한 후 정확히 3분 후에 흡광도(500 nm)를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 BHT 및 96% proanthocyanidin 을 표준물질로 사용하였다.
- 이에 따른 항산화 활성은 ICso으로 나타내었다. 표준물질로 butylated hydroxytoluene (BHT, Sigma) 과 96% proanthocyanidin (Grape seed extract, Naturex)을 같은 농도로 사용하였다.
이론/모형
- Osawa의 방법 [16]에 따라 linoleic acid (25 mg/ml in EtOH), ferrous chloride (2.45 g/ml in 3.5% hydrochloric acid), ammonium thiocyanate (0.3 g/ml in HQ), 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0)를 만들어 이것을 stock solution 으로 사용하였다. 적송잎 추출물 0.
- Proanthocyanidin의 농도는 acid butaimol에서의 proan- thocyanidin의 산화적 분해 (oxidative depolymerization) 로측정하였다19]. 솔잎추출물 0.
- 총 폴리페놀성 성분의 농도는 Folin-Ciocalteu법에 의해 비색정량 하였다[14]. 각 추출물을 70% 아세톤 용액으로 10 배 희석한 후, 희석시료 50 μl와 0.
성능/효과
- DPPH radical의 초기농도를 50% 감소시키는데 필요한 항산화제의 농도인 IC50을 산출한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 경우 각각 0.013 ng/ml 및 0.91 μ/ml의 농도를 나타냈다 (Table 3). 반면, 헥산 및 아임계 추출물의 경우는 모두 10 ng /ml 보다 높은 농도를 나타냈다(Table 3).
- 나타냈다. Thiocyanate에 의한 항산화 활성 측정과 마찬가지로 표준물질인 BHT가 가장 높은 항산화 활성을 나타냈으며, 농도 의존적으로 6일째까지 높은 항산화 활성이 지속되었다. 또 다른 표준물질인 96% proanthocyanidin의 경우는 2일째 처리까지는 높은 항산화 활성을 나타냈지만 3일째 부터는 항산화 활성이 크게 감소하는 경향을 보였다.
- 또한, 아 임계추출물의 경우 비록 추출물에 포함된 총 폴리페놀성 물질의 농도는 낮지만 이들 대부분이 proanthocyanidin으로 이루어진 시료를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 각 추출물에 대한 항산화 활성을 측정한 결과, 열수 추출물의 경우 가장 높은 활성을 보였으며 에탄올 추출물도 비교적 높은 활성을타나냈다. 이상의 결과에서 솔잎으로부터 4가지 추출법에 의해 제조된 추출물을 비교 분석한 결과, 열수 추출물에서 가장 높은 기능성 성분 함량 및 항산화 활성을 나타냈으므로 솔잎을 이용한 기능성 식품의 추출 가공법 선택에 있어 좋자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 2). 각 추출물의 전자공여 능은 농도 의존적 경향을 나타냈으며, 열수 추출물에서 가장 높은 전자 공여능을 보였으며, 에탄올 추출물의 경우도 비교적 높은 전자 공여능을 나타냈다.
- 본 연구에서는 다양한 용매를 이용한 추출방법에 따른 솔잎 추출 시료에 포함된 총 폴리페놀성 성분 및 proanthocyanidin의 함량을 비교하였고 이들 시료의 항산화 활성 차이를 비교하였다. 그 결과, Choi 등의 연구와는 달리 솔잎으로부터 열수를 이용한 추출물이 에탄올 추출물보다 추출수율 및 항산화 활성이 더 높았다. 이러한 결과로 솔잎을 이용한 기능성 식품개발을 위한 추출 가공방법으로 에탄올을 이용한 방법보다 열수를 이용한 방법이 더 효과적일 것으로 생각된다.
- 지리산 적송잎으로부터 열수, 에탄올, 헥산 및 아임계 장치를 이용하여 추출물을 제조하여 총 폴리페놀성 물질 중에 포함된 proanthocyanidin의 함량을 측정하였다. 그 결과, 총 폴리 페놀성 물질 및 proanthocyanidin의 농도가 열수 추출물의 경우 가장 높게 나타났으며, 에탄올 추출물, 헥산 추출물, 아임계 추출물 순으로 낮아졌다. 한편, 각 추출물들의 총 폴리 페놀성 물질의 농도에 대한 proanthocyanidin의 함량을 계산한 결과, 아임계 추출물의 경우 가장 높은 함량을 보였고, 헥산 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 순으로 낮아졌다.
- 6%의 가장 낮은 proanthocyanidin 함량을 나타냈다 (Table 2). 또한 총 폴리페놀성 성분의 농도가 비교적 높게 나타난 에탄올 추출물의 경우도 9.8%의 비교적 낮은 proan thocyanidin 함량을 나타냈다(Table 2). 한편, 헥산 추출물의 경우는 총 폴리페놀성 성분에 대한 proanthocyanidin의 함량이 64.
- 이러한 결과로 적송잎을 열수 및 에탄올로 추출한 경우 높은 농도의 총 폴리페놀성 물질 및 proanthocyanidin이 포함된 추출물을 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 아 임계추출물의 경우 비록 추출물에 포함된 총 폴리페놀성 물질의 농도는 낮지만 이들 대부분이 proanthocyanidin으로 이루어진 시료를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 각 추출물에 대한 항산화 활성을 측정한 결과, 열수 추출물의 경우 가장 높은 활성을 보였으며 에탄올 추출물도 비교적 높은 활성을타나냈다.
- 열수 추출물도 96% proan- thocyanidin과 마찬가지로 전반적인 항산화 활성에 있어 농도 의존적 경향을 나타냈다. 에탄올 추출물 및 아임계 추출물은 처리 2일째까지는 비교적 높은 항산화 활성을 나타냈지만, 처리 3일째 이후부터는 항산화 활성이 현저하게 감소하였다. 헥산 추출물의 경우 전반적으로 가장 낮은 항산화 활성을 나타냈다.
- 반면, 헥산 및 아임계 추출물의 경우는 모두 10 ng /ml 보다 높은 농도를 나타냈다(Table 3). 이 결과를 토대로 열수 추출물의 경우 항산화 효과를 나타내는 총 폴리 페놀성 성분이 높은 농도로 포함되어 있어 가장 높은 항산화 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
- 5%로 비교적 높은 함량을 나타냈고, 아임계 추출물의 경우는 100%로 가장 높은 proanthocyanidin 함량을 나타냈다(Table 2). 이 결과를 토대로 열수 추출물의 경우는 높은 농도의 총 폴리페놀성 성분을 포함하고 있지만 여기에 포함되 어 있는 proanthocyanidin의 함량은 낮은 것을 알 수 있다. 반면, 아임계 추출물의 경우는 비록 추출물의 농도는 낮지만 여기에 포함된 총 폴리페놀성 성분 중 대부분이 proantho- cyanidin인 것을 알 수 있다.
- 한편, 각 추출물들의 총 폴리 페놀성 물질의 농도에 대한 proanthocyanidin의 함량을 계산한 결과, 아임계 추출물의 경우 가장 높은 함량을 보였고, 헥산 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 순으로 낮아졌다. 이러한 결과로 적송잎을 열수 및 에탄올로 추출한 경우 높은 농도의 총 폴리페놀성 물질 및 proanthocyanidin이 포함된 추출물을 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 아 임계추출물의 경우 비록 추출물에 포함된 총 폴리페놀성 물질의 농도는 낮지만 이들 대부분이 proanthocyanidin으로 이루어진 시료를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
- 또 다른 표준물질인 96% proanthocyanidin 역시 6일째까지 높은 항산화 활성을 나타냈지만 농도 의존적인 활성 경향을 나타냈다. 적송잎 열수 추출물은 500 Rg/ml의 가장 높은 농도에서 5일째까지 처리한 경우에서 BHT와 비슷한 정도의 강한 항산화 활성을 나타냈지만 일째 처리에서 항산화 활성이 현저하게 감소하였다. 열수 추출물도 96% proan- thocyanidin과 마찬가지로 전반적인 항산화 활성에 있어 농도 의존적 경향을 나타냈다.
- 열수 및 에탄올 추출물의 경우 비슷한 농도를 보였으며, 헥산 및 아임계 추출물에 비해 2배 이상의 농도를 보였다. 적송잎 용매별 추출물에 포함된 총 폴리 페놀성 성분에 대한 proanthocyanidin의 함량을 계산한 결과, 총폴리 페놀성 성분의 농도가 가장 높게 나타난 열수 추출물의 경우 3.6%의 가장 낮은 proanthocyanidin 함량을 나타냈다 (Table 2). 또한 총 폴리페놀성 성분의 농도가 비교적 높게 나타난 에탄올 추출물의 경우도 9.
- 또 다른 표준물질인 96% proanthocyanidin의 경우는 2일째 처리까지는 높은 항산화 활성을 나타냈지만 3일째 부터는 항산화 활성이 크게 감소하는 경향을 보였다. 적송잎의 열수 추출물, 에탄올 추출물 및 헥산 추출물은 모두 비슷한 정도의 항산화 활성을 나타냈으며, 농도 의존적 활성 경향을 나타냈다. 하지만 표준물질인 BHU와 비교하여 매우 낮은 항산화 활성을 나타냈다.
- 열수 추출물의 경우 타 추출물에 비해 3배 이상의 높은 농도를 보였다. 적송잎의 용매별 추출물에 대한 proantho- cyanidin의 농도를 측정 한 결과, 추출물 1 g 당 proanthocya- nidin의 농도는 열수 추출물이 4.5 mg으로 가장 높게 나타났으며, 에탄올 추출물의 경우 4.2 mg으로 다음으로 높게 나타났다(Table 2). 헥산 추출물의 경우는 2.
- 이들은 phenolic hydroxy기를 가지고 있기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질을 나타내며, 항산화 효과 등의 생리활성 기능을 가진다는 보고가 있다[4]. 적송잎의 용매별 추출물에 대한 총 폴리페놀성 성분의 농도를 측정한 결과, 추출물 1 g 당 총 폴리페놀성 성분의 농도는 열수 추출물이 124.4 mg으로 가장 높게 나타났고, 에탄올 추출물의 경우 42.9 mg으로 다음으로 높게 나타났다(Table 2). 헥산 추출물의 경우는 3.
- 2). 총 폴리페놀성 성분의 농도가 가장 높은 적송잎 열수 추출물의 경우, 250 Hg/ml 및 500 μg/ml의 농도에서는 약 70% 전후의 높은 전자 공여능을 나타냈으며 이는 같은 농도의 BHT 및 96% proanthocyanidin의 전자 공여능에 근접한 수치이다 (Fig. 2). 에탄올 추출물의 경우는 100〜500 μ/ml의 농도에서 약 20〜40%의 전자 공여능을 나타냈고, 아임계 추출물의 경우는 50 - 500 pg/ml의 농도에서 10〜20%의 비교적 낮은 전자 공여능을 나타냈다(Fig.
- 9%의 가장 낮은 수율을 나타냈다. 추출물의 양으로 단순 비교할 경우, 열수 추출물에서 가장 높은 수율을 나타냈으며, 에탄올 추출물에서 가장 낮은 수율을 나타냈다.
- 그 결과, 총 폴리 페놀성 물질 및 proanthocyanidin의 농도가 열수 추출물의 경우 가장 높게 나타났으며, 에탄올 추출물, 헥산 추출물, 아임계 추출물 순으로 낮아졌다. 한편, 각 추출물들의 총 폴리 페놀성 물질의 농도에 대한 proanthocyanidin의 함량을 계산한 결과, 아임계 추출물의 경우 가장 높은 함량을 보였고, 헥산 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 순으로 낮아졌다. 이러한 결과로 적송잎을 열수 및 에탄올로 추출한 경우 높은 농도의 총 폴리페놀성 물질 및 proanthocyanidin이 포함된 추출물을 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
- 8%의 비교적 낮은 proan thocyanidin 함량을 나타냈다(Table 2). 한편, 헥산 추출물의 경우는 총 폴리페놀성 성분에 대한 proanthocyanidin의 함량이 64.5%로 비교적 높은 함량을 나타냈고, 아임계 추출물의 경우는 100%로 가장 높은 proanthocyanidin 함량을 나타냈다(Table 2). 이 결과를 토대로 열수 추출물의 경우는 높은 농도의 총 폴리페놀성 성분을 포함하고 있지만 여기에 포함되 어 있는 proanthocyanidin의 함량은 낮은 것을 알 수 있다.
후속연구
- 그 결과, Choi 등의 연구와는 달리 솔잎으로부터 열수를 이용한 추출물이 에탄올 추출물보다 추출수율 및 항산화 활성이 더 높았다. 이러한 결과로 솔잎을 이용한 기능성 식품개발을 위한 추출 가공방법으로 에탄올을 이용한 방법보다 열수를 이용한 방법이 더 효과적일 것으로 생각된다.
- 각 추출물에 대한 항산화 활성을 측정한 결과, 열수 추출물의 경우 가장 높은 활성을 보였으며 에탄올 추출물도 비교적 높은 활성을타나냈다. 이상의 결과에서 솔잎으로부터 4가지 추출법에 의해 제조된 추출물을 비교 분석한 결과, 열수 추출물에서 가장 높은 기능성 성분 함량 및 항산화 활성을 나타냈으므로 솔잎을 이용한 기능성 식품의 추출 가공법 선택에 있어 좋자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 반면, 아임계 추출물의 경우는 비록 추출물의 농도는 낮지만 여기에 포함된 총 폴리페놀성 성분 중 대부분이 proantho- cyanidin인 것을 알 수 있다. 즉, 높은 농도의 총 폴리 페놀성 성분이 포함된 추출물을 얻기 위해서는 열수 추출법이 적합할 것으로 생각되며, 총 폴리페놀성 성분 중 proanthocyani- din이 주로 포함된 추출물을 얻기 위해서는 아임계 추출법이 활용 가능할 것으로 생각된다.
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