선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 이들의 선행된 연구 결과들을 좀 더 폭 넓게 유전자들의 변화와 상호작용을 동정하기 위하여 본 연구에서는 인체 백혈병 HL-60 세포에 현재까지 발견된 항암 활성을 나타내는 topoisomerase의 억제제 중 topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT와 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때 세포 내 유전자 발현 양상을 microarray 방법으로 비교 분석하였다. 본 실험을 위한 약물의 적정 투여량을 결정하기 위하여 세포독성 실험을 통해 약 70-80%의 생존율을 나타내는 조건에서 약물을 투여하였고, 10K 유전자 중에 통계프로그램을 통해 선정한 약 1,000여개의 의미있는 발현 양상을 나타내는 유전자들을 생물학적 기능별로 분류하였다.
- 본 실험에서는 인체 백혈병 HL-60 세포에서 topoisomerase 억제제가 topoisomerase 기능 활성과 유전자 발현을 조절하는지를 규명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 연구 방법은 HL60세포에 topoisomerase type I과 type Ⅱ의 대표적 억제제인 10-hydroxycamptothecin (10-CPT)과 dox- orubicin을 투여한 후 total RNA를 분리하였고, 10K-oligo- nucleotide microarray 방법으로 분석하여 유전자의 발현 양상을 조사하였다.
- 이와 같은 연구 배경에 따라 본 실험에서는 topoisomerase type I과 type Ⅱ의 대표적 억제제인 10-hydroxycamptothecin (10-CPT)과 doxorubiciri을 투여한 인체 백혈병 HL-60 세포에서 유전자의 발현 양상을 조사하고, topoisomerase 기능 활성에 영향을 미치는 topoisomerase type별 유전자 발현의 차이를 비교 검토하여 topoisomerase 억제제들의 세포 내 작용기전을 밝히는데 기초자료를 얻고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 약물의 1차적 표적소인 topoisomerase 효소 단백질에 약물의 결합을 통해 “cleavable complex"를 유도함에 따른 세포내 topoisomerase 유전자들의 발현 정도를 비교하였다. Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을 때 type I으로 분류되는 topoisomerase Illa의 유전자의 발현은 현저히 증가되었으며, 같은 type인 Ⅲβ 및 I의 발현도 약간 증가하였으나 다른 type인 topoisomerase IIa와 IIβ의 유전자의 발현은 감소되었다(Fi응.
- 10% fetal bovine serum이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 ml 당 2×104 세포의 농도로 희석한 배지 10 ml에 10-CPT와 doxorubicin을 각각 농도별 첨가하여 28시간(cell doubling time)동안 처리한 후 원심분리하고 phosphate buffered saline으로 씻어 약물을 제거하고, 56시간(two dou- bling time)동안 새 배지에 배양한 후 인체 백혈병 HL-60 세포 수를 hemocytometer로 측정하였다.
- HL-60 세포를 약물을 처리하지 않은 정상 HL-60 세포와 10-CPT 또는 doxorubicin을 처리한 세포에서 각각 total RNA를 추출하여 RT-PCR 과정에서 Cy3 (control), Cy5 (test)의 형광물질로 표지하고 10K human oligo 가lip상에서 하룻밤 hybridization 하였으며, 세정 후 Affymetrix 428 Array Scanner (Affymetrix Inc, Santa Clara, California, USA)로 scan하고, 형광감도 해석 프로그램을 사용하여 얻은 Cy3과 Cy5 의 감도 값을 house keeping gene 의 감도 값, 외부 유전자의 감도 값을 가지고 보정한 후 통계 처리하여 topoisomerase 유전자를 포함한 10K 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
- Oligo microarry 분석 결과 발현의 뚜렷한 증가 또는 감소 를 나타내는 유전자를 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) Gene Bank 검색을 통하여 유전자의 기능을 동정하였다.
- Topoisomerase I 억제제인 10-CPT와 doxorubicin을 각각 처리한 세포 및 정상 세포주로부터 total RNA를 분리하여 각각 Cy3과 Cy5 형광물질로 표지시킨 cDNA를 만들고 Oligo chip에 대한 microarray hybridizatione- 실시하였다. 형광물질로 표지된 microarray chip상의 10K 유전자 각각에 대한 intensity를 측정하고 보정한 후 통계 프로그램을 사용하여 Scatter plot (Fig.
- ml 당 2×104 세포 농도로 된 10 ml의 배양액을 분주한 25 cm2 culture flask 에 10-CPT와 doxorubicin을 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 400 nm을 각각 투여한지 28시간 후 정상 배지로 갈아주고 다시 56시간(two doubling time) 배양하여 세포의 생육에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 1). 10-CPT는 2.
- 5 nm의 10-CPT를 투여하였을 때 80%, 5 nm의 경우 약 70%의 생육도를 나타내었으며, doxorubicine 10 nm 이하를 투여하였을 때는 90% 이상의 생육을 나타내었고 25 nm 이상에서는 급격한 세포 수의 감소를 확인하였다. 따라서 2 가지 약물에 대한 동일한 생육 조건에서 각종 유전자의 발현 양상을 분석하기 위해 70-80%의 생육정도를 나타내는 농도인 4 nm (10-CPT)과 25 nm (doxorubicin)을 유전자 발현 실험의 투여 농도로 정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 이들의 선행된 연구 결과들을 좀 더 폭 넓게 유전자들의 변화와 상호작용을 동정하기 위하여 본 연구에서는 인체 백혈병 HL-60 세포에 현재까지 발견된 항암 활성을 나타내는 topoisomerase의 억제제 중 topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT와 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때 세포 내 유전자 발현 양상을 microarray 방법으로 비교 분석하였다. 본 실험을 위한 약물의 적정 투여량을 결정하기 위하여 세포독성 실험을 통해 약 70-80%의 생존율을 나타내는 조건에서 약물을 투여하였고, 10K 유전자 중에 통계프로그램을 통해 선정한 약 1,000여개의 의미있는 발현 양상을 나타내는 유전자들을 생물학적 기능별로 분류하였다. 10-CPT를 투여한 세포에서 유전자 발현이 촉진 또는 억제되는 유전자들은 signal transduction, cell adhesion, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell differentiation, transcription, immune response0]] 관여하는 유전자들이 고루 검출되었다(Table 1, 2).
- 본 실험에서는 인체 백혈병 HL-60 세포에서 topoisomerase 억제제가 topoisomerase 기능 활성과 유전자 발현을 조절하는지를 규명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 연구 방법은 HL60세포에 topoisomerase type I과 type Ⅱ의 대표적 억제제인 10-hydroxycamptothecin (10-CPT)과 dox- orubicin을 투여한 후 total RNA를 분리하였고, 10K-oligo- nucleotide microarray 방법으로 분석하여 유전자의 발현 양상을 조사하였다.
대상 데이터
- Doxorubicin과 10-CPT는 Sigma (Sigma-Aldrich Co, St. Luis, MO, USA)에서' fetal bovine serum, gentamicin과 RPMI 1640은 Gibco (Invitrogen Co, Grand Island, NYZ USA)에서/ 10k oligo 가lip과 관련 kit 시약들은 Macrogen (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Total RNA정제용 kit는 RNAzol™B (Tel-Test Inc, Friendswood, Texas, USA) 를, HL~60 세포는 KCTC HCl8103 (한국생명공학연구원, Daejeon, Korea)을, 그 외의 일반적인 시약은 분석용을 사용하였다.
- Luis, MO, USA)에서' fetal bovine serum, gentamicin과 RPMI 1640은 Gibco (Invitrogen Co, Grand Island, NYZ USA)에서/ 10k oligo 가lip과 관련 kit 시약들은 Macrogen (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Total RNA정제용 kit는 RNAzol™B (Tel-Test Inc, Friendswood, Texas, USA) 를, HL~60 세포는 KCTC HCl8103 (한국생명공학연구원, Daejeon, Korea)을, 그 외의 일반적인 시약은 분석용을 사용하였다.
데이터처리
- Topoisomerase I 억제제인 10-CPT와 doxorubicin을 각각 처리한 세포 및 정상 세포주로부터 total RNA를 분리하여 각각 Cy3과 Cy5 형광물질로 표지시킨 cDNA를 만들고 Oligo chip에 대한 microarray hybridizatione- 실시하였다. 형광물질로 표지된 microarray chip상의 10K 유전자 각각에 대한 intensity를 측정하고 보정한 후 통계 프로그램을 사용하여 Scatter plot (Fig. 2)하였고, 의미 있는 데이타로 선정된 약 1새)0개의 유전자를 동정하였으며, 그 중에 intensity ratio Plog (3F/5F)]가 약 -3.0 이하인 뚜렷한 발현의 증가를 보이는 유전자와 현저한 발현의 감소를 보이는 약 +3.0 이상의 유전자를 선별하여 Table L4에 나타내었다. 10-CPT를 투여한 HL-60세포에서의 과 발현을 보이는 유전자들은 검색을 통하여 생물학적 기능별로 분류한 결과(Table 1), 주로 signal transduction, cell adhesion, cell proliferation, cell differentiation, transcription 등에 관여하는 유전자들이 많았으며, 10-CPT에 의해 억제되는 유전자들은 cell adhesion, transcription, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell adhesion, signal transduction, immune response 등과 관련된 것으로 나타났다(Table 2).
성능/효과
- Topoisomerase가 DNA에 결합하여 "cleavable complex"를 이룬 후에 다시 끊어졌던 DNA 부위가 재 봉합하는데 앞의 선행된 실험 결과[3, 9-12]를 통해 typel, n 억제제가 재 봉합을 지연하면 topoisomerase 유전자의 발현에도 일부 영향을 미치는 것을 RT-PCR을 통해 확인하였기 때문에, 따라서 본 연구에서는 type 별 대표적 억제제인 10-CPT와 doxor- ubicin을 HL-60 세포주에 투여한 후 topoisomerase의 기능 활성에 영향을 미치는 topoisomerase 종류별 유전자 발현의 차이를 확인하였다(Fig. 3, 4)- Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을때 type I으로 분류되는 topoisomerase Ⅲa의 유전자의 발현은 현저히 증가되었으며, 같은 type인 Hip 및 I의 발현도 약간 증가하였으나 다른 type인 topoisomerase Ila와 110의 유전자의 발현은 감소되었다. 또한 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 상반된 topoisomerase IIa와 IIβ의 유전자의 발현이 현저히 증가되었고, topoisomerase I의 발현도 약간의 증가를 보였으며 topoisomerase Ⅲa와 Ⅲβ의 유전자의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미 있는 차이는 없었다.
- 1). 10-CPT는 2.5 nm의 10-CPT를 투여하였을 때 80%, 5 nm의 경우 약 70%의 생육도를 나타내었으며, doxorubicine 10 nm 이하를 투여하였을 때는 90% 이상의 생육을 나타내었고 25 nm 이상에서는 급격한 세포 수의 감소를 확인하였다. 따라서 2 가지 약물에 대한 동일한 생육 조건에서 각종 유전자의 발현 양상을 분석하기 위해 70-80%의 생육정도를 나타내는 농도인 4 nm (10-CPT)과 25 nm (doxorubicin)을 유전자 발현 실험의 투여 농도로 정하였다.
- 0 이상의 유전자를 선별하여 Table L4에 나타내었다. 10-CPT를 투여한 HL-60세포에서의 과 발현을 보이는 유전자들은 검색을 통하여 생물학적 기능별로 분류한 결과(Table 1), 주로 signal transduction, cell adhesion, cell proliferation, cell differentiation, transcription 등에 관여하는 유전자들이 많았으며, 10-CPT에 의해 억제되는 유전자들은 cell adhesion, transcription, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell adhesion, signal transduction, immune response 등과 관련된 것으로 나타났다(Table 2). Doxorubicin을 투여한 HL-60세포에서 과 발현을 보이는 유전자를 생물학적 기능별로 분류한 결과(Table 3), transcription, signal transduction, cell growth (apoptosis), cell differentiation, cell adhesion, me tabolism 등과 관련된 유전자들이 많았으며, 발현이 억제되는 유전자들은 apoptosis, signal transduction, transcription, cell proliferation, cell adhesion 등과 관련이 있었다.
- 10-CPT를 투여한 HL-60세포에서의 과 발현을 보이는 유전자들은 검색을 통하여 생물학적 기능별로 분류한 결과(Table 1), 주로 signal transduction, cell adhesion, cell proliferation, cell differentiation, transcription 등에 관여하는 유전자들이 많았으며, 10-CPT에 의해 억제되는 유전자들은 cell adhesion, transcription, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell adhesion, signal transduction, immune response 등과 관련된 것으로 나타났다(Table 2). Doxorubicin을 투여한 HL-60세포에서 과 발현을 보이는 유전자를 생물학적 기능별로 분류한 결과(Table 3), transcription, signal transduction, cell growth (apoptosis), cell differentiation, cell adhesion, me tabolism 등과 관련된 유전자들이 많았으며, 발현이 억제되는 유전자들은 apoptosis, signal transduction, transcription, cell proliferation, cell adhesion 등과 관련이 있었다.
- 연구 결과에 의하면 10-CPT 또는 doxorubicin을 투여한 HL-60세포에서의 유전자 발현 양상은 주로 signal transduction, cell adhesion, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell differentiation, transcription 및 immune response 등과 관련이 있었다. Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을 때 type I으로 분류되는 topoisomerase Illa, Hip 및 I의 발현은 증가하였으나 type II인 topoisomerase Ⅱa와 Ⅱβ의 유전자의 발현은 감소되었다. 반대로 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 상반된 topoisomerase Ila와 Ⅱβ의 유전자의 발현이 현저히 증가되었으며, topoisomerase IIIa와 IIIβ의 mRNA의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미 있는 차이는 없었다.
- 약물의 1차적 표적소인 topoisomerase 효소 단백질에 약물의 결합을 통해 “cleavable complex"를 유도함에 따른 세포내 topoisomerase 유전자들의 발현 정도를 비교하였다. Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을 때 type I으로 분류되는 topoisomerase Illa의 유전자의 발현은 현저히 증가되었으며, 같은 type인 Ⅲβ 및 I의 발현도 약간 증가하였으나 다른 type인 topoisomerase IIa와 IIβ의 유전자의 발현은 감소되었다(Fi응. 3). 반대로 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 싱반된 topoisomerase IIa와 IIβ의 유전자의 발현이 현저히 증가되었으며, topoisomerase I의 발현도 약간의 증가를 보였고 topoisomerase IIIa와 IIIβ의 유전자의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미있는 차이는 없었다.
- 3, 4)- Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을때 type I으로 분류되는 topoisomerase Ⅲa의 유전자의 발현은 현저히 증가되었으며, 같은 type인 Hip 및 I의 발현도 약간 증가하였으나 다른 type인 topoisomerase Ila와 110의 유전자의 발현은 감소되었다. 또한 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 상반된 topoisomerase IIa와 IIβ의 유전자의 발현이 현저히 증가되었고, topoisomerase I의 발현도 약간의 증가를 보였으며 topoisomerase Ⅲa와 Ⅲβ의 유전자의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미 있는 차이는 없었다. 이와 같은 연구로는 Kersting 등[15]이 doxorubicin이 topoisomerase IIβ의 발현을 유도한다고 하였으며, Stahl 등[23]이 camptothecin 에 의해 topoisomerase II를 down- regulation시키며, 앞에 언급한 선행의 연구결과와도 대체로 일치하였다.
- Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을 때 type I으로 분류되는 topoisomerase Illa, Hip 및 I의 발현은 증가하였으나 type II인 topoisomerase Ⅱa와 Ⅱβ의 유전자의 발현은 감소되었다. 반대로 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 상반된 topoisomerase Ila와 Ⅱβ의 유전자의 발현이 현저히 증가되었으며, topoisomerase IIIa와 IIIβ의 mRNA의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미 있는 차이는 없었다.
- 3). 반대로 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 싱반된 topoisomerase IIa와 IIβ의 유전자의 발현이 현저히 증가되었으며, topoisomerase I의 발현도 약간의 증가를 보였고 topoisomerase IIIa와 IIIβ의 유전자의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미있는 차이는 없었다.
- 연구 결과에 의하면 10-CPT 또는 doxorubicin을 투여한 HL-60세포에서의 유전자 발현 양상은 주로 signal transduction, cell adhesion, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell differentiation, transcription 및 immune response 등과 관련이 있었다. Topoisomerase type I의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포주에 투여하였을 때 type I으로 분류되는 topoisomerase Illa, Hip 및 I의 발현은 증가하였으나 type II인 topoisomerase Ⅱa와 Ⅱβ의 유전자의 발현은 감소되었다.
- 진핵 세포의 topoisomerase I, Ⅱ의 억제제들은 topoisomerase 촉매 반응의 전 단계인 phosphodiester bond 절단 과정에는 영향을 주지 않으며 그 후속 단계인 phosphodiester bond의 재 봉합을 방해하여 "cleavable complex"를 형성하는데 [4,22,26-28] camptothechie S'-phosphotyrosyl- 공유결합에 의한 중간 산물을 형성하여 DNA 재 봉합을 방해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다[16]. 이러한 결과들은 본 실험실의 선행된 연구결과[3, 9-12]를 통해 HL-60 인체 백혈병 세포에서 topoisomerase Ⅱ의 저해제인 doxorubicin과 topoisomerase I의 저해제인 camptothecin, 10-hydroxy- camptothecin, irinotecan0] topoisomerase의 이완 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, topoisomerase 억제제들은 모두 cleavable complex를 유도함을 확인하였고, doxorubicin을 HL-60 세포에 투여하였을 때 핵내 topoisomerase의 활성과 topoisomerase의 발현을 조사한 결과[3], doxorubicin의 투여 에 의해 topoisomerase의 활성이 감소하였기 때문에 top- oisomerase의 유전자 발현에 영향을 미칠 것으로 추측하였 으나 topoisomerase 활성의 감소에도 불구하고 topoisomerase Ila 유전자 발현은 약간 증가한 반면 topoisomerase I과 lip 유전자 발현은 큰 변화가 없었다. 또한 topoisomerase I 억제 제인 camptothecin을 HL-60 세포에 투여하였을 때에도 topoisomerase I의 활성은 억제되었으나 topoisomerase I의 발현에는 영향을 미치지 못하였는데[11, 12], 이는 1999년 Pu 등 [2이이 melphalan (alkylator)을 HL-60세포에 투여하여 내성 을 가진 세포 주에서 Topo IIa의 활성은 증가한다고 하였으나 Topo IIβ와 Topo I의 활성에는 아무 변화가 없는 것을 확인한 바 있는데 본 실험에서도 같은 경향을 나타내었다.
- 또한 doxorubicin을 투여한 HL-60세포에서도 비슷한 양상을 보였다(Table 3, 4). 특히 두 약물에서 transcription과 cell growth와 관련된 유전자들이 크게 영향을 받았으며, 약물에 따른 생물학적 기능별 분류상의 큰 차이는 없었으나 개별 유전자의 발현 양상에는 뚜렷한 차이를 나타내었다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 억제를 받은 효소의 세포 내 기능 활성을 회복시키기 위해 같은 type의 효소 발현을 증가시킨 것으로 여겨진다. 그러나 Chen 등[2]은 RT-PCR에 의해 Topotecan (type I 억제제)에 의해 topoisomerase Ila mRNA의 발현이 촉진된다는 상반된 보고도 있으므로 따라서 본 실험에서의 뚜렷한 발현의 변화를 보이는 유전자들을 검증하기 위하여 real time PCR과 northern blot 분석, Western blot을 통한 검증 등 그 발현 기전에 대해 앞으로 더 연구하여야 할 것으로 사료된다.
- 이 연구 결과는 앞으로 항암제의 기전을 밝히고 약물에 대한 치료 반응을 예측하고 새로운 약제 개발에 기초자료가 될 것으로 여겨진다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.