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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 적색과 보라색을 나타내는 수용 성안 토시 아닌 색소가 풍부하게 함유된 유색감자 홍영 및 자영 품종의 추출물을 대상으로 정밀한 항산화 활성, RAW 264.7세포에서의 항염증 활성(NO), LPS 유도 및 비유도 RAW 264.7세포의 iNOS 단백질 및 COX-2 단백질 발현 활성을 비교, 검토하여 고기능성 유색감 자 신품종 육성 및 유색감자 이용성 증진을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
- E와 직접 비교 검토하였다. 또한 기존에 보고되어진 항암활성 및 항고혈압 활성 외에 항염증 활성평가를 실시하여위궤양 및 관절염 등에 대한 홍영과 자영품종의 활성을 검토하여 유색감자의 건강기능식품으로서의 활용가치를 검토 하고자 하였다.
제안 방법
- 각 유색감자는 껍질을 제거하고, 괴경을 3 mm 수준으로 자른 후, 생체시료 100 g에 80%에 탄올 1,000 mL를 첨가하여 24시간 동안 상온에서 추출한 후 여과하고, 잔류물은동일한 방법으로 2회 반복하여 추출하였으며, 추출된 용액은 모두 합하여 40℃ 감압 농축장치에서 완전히 건고하여활성평가용 시료로 사용하였다.
- 본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시액들의 제조에는 중성phosphate buffer 를 사용하였다. 검량곡선을 작성하기 위하여 항산화 활성비교 표준액으로 Trolox(water soluble analogueof vitamin E, 6-hydroxy-2, 5, 7, 8- tetramethlychrman-2-carboxylicacid, Aldrich Chem, Inc. Milw. WI)를 인산 완충용액을 가하여 각각 0.0, 1.65, 3, 125, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 aM 농도로 희석하여 표준곡선을 작성하였다.
- 본 연구자들은 선행연구에서 유색 감자인 홍영과 자영 품종의 추출물을 대상으로 항산화와 관련된 자유 라디칼 소거 활성을 보고한 바 있으나, 항산화 활성에 대한 평가 감도가 우수하여 국제적 표준으로 이용되고 있는 항산화 측정법인ORAC(oxygen radical absorbance capacity)법을 이용하여 홍영과 자영 품종의 추출물이 나타내는 항산화 활성을 비타민 E와 직접 비교 검토하였다. 또한 기존에 보고되어진 항암활성 및 항고혈압 활성 외에 항염증 활성평가를 실시하여위궤양 및 관절염 등에 대한 홍영과 자영품종의 활성을 검토하여 유색감자의 건강기능식품으로서의 활용가치를 검토 하고자 하였다.
- 유색감자인 홍영 및 자영 추출물의 항산화 활성을 검정하기 위해 괴경 내부가 적색인 홍영, 괴경 내부가 보라색인 자영 감자의 추출물을 얻고, 추출물의 항산화 활성을 검토하였다. 추출물의 항산화 활성을 ORAC assay를 이용하여 측정한 결과 각 추출물의 농도가 2 Mg/mL 이 하 수준에서는차이를 나타내지 않았으나, 10 ng/mL을 처리한 경우 시료간 차이를 뚜렷하게 나타내었다 (Fig.
- Membrane을 5% BSA blockingbuffer어서 반응시킨 후 특정 단백질에 특이한 1차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 2차 항체를 1시간 동안 반응 시킨 후 luminescence로 반응 정도를 확인하였다.
- 7 세포를 lxl06 cell/mL의 농도로 조절한 후 96 well plate에 100 |1L씩 접종하고, 5% CO2, 37℃에서 18시간 동안 전 배양을 하였다. 이후 전 배양 배지를 제거하고, 50, 100 ng/mL로 조제한 홍영 및 자영 추출물 50ul (LPS(Lipopolysaccharide, 최종 농도 1 μg/mL) 50 |1L 함유 배지를 well에 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 다음날 원심분리(l, 500xg, 10분)하고, 상층액 100 ml를 취해정량 전까지-20℃ 이하에서 보관하였다.
- 7세포를 lxl06 cell/mL의 농도로 조절한 후, 96 well plate 에 1 mL 씩 분주하고, 배지 3 mL을 첨가한 후 5% CO2, 37℃에서 18시간 동안 전 배양을 하였다. 전술한 NO 실험법과 동일하게 50, 100 ng/mL로 조제한 유색감자홍영과 자영 추출물과 LPS(최종 농도 1 ng/mL) 함 유 배지를 well에 동시 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 lysis buffer(20 mM Tris-HCl, pH7.
- 홍영 및 자영 추출물의 항염증 효과를 검정하기 위해 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7세포의 배양액 중 생성된 nitrite의 양을 griess 시약을 사용하여 홍영 및 자영 추출물의 NO 생성 저해 효과를 조사하였다. 그 결과 추출물의 농도에 의존적으로 NO 생성을 저해하였으며(Table 1), 홍영 및 자영 추출물 모두 추출물의 농도가 100 Ug/mL에서 NO 생성을 20% 이상 저해하였고, 자영 품종이 홍영에 비해 NO 생성 저해율이 높은 것으로 조사되었다.
대상 데이터
- RAW 264.7 세포(mouse macrophage cell line)들은 5% CO2, 37℃ incubator(MCO-18AIC, Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 게1지는 penicillin-streptomycinje 10% FBS가 포함된 RPMI 1640(Gibco, BRL)을 사용하였다.
- 7 세포(mouse macrophage cell line)들은 5% CO2, 37℃ incubator(MCO-18AIC, Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 게1지는 penicillin-streptomycinje 10% FBS가 포함된 RPMI 1640(Gibco, BRL)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 유색감자 홍영(적색) 및 자영(보라색) 품종은 농촌진흥청 고령지 농업연구소에서 감자 표준 재배 법으로 재배된 시료를 이용하였다 (Fig. 1).
이론/모형
- 7 cells (lx105 cells/mL) were pre-incubated for 18 h, and the cells were stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of samples for 24 h. COX-2 protein level was determined using immunoblotting method.
- The production of NO was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of the Hongyoung and Jayoung. Cytotoxicity was determined using the LDH method. Value are the mean±SEM of triplicate experiments.
- Fluorescent 표준용액은 Ou 등(2001)의 방법에 따라 fluorescent stock(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) 10 |丄L를phosphate buffer 50 mL에 용해하여 제조하였고, 측정기기는 fimax® fluorescent microplate reader(Molecular DeviceCo. Califomia)> 사용하여 485 nm에서 전자가 여기(excitation)되고 538 nm에서 방출(emission)되게 조절하여 본 실험에 적용하였다.
- 7 cells (Ix106 cells/mL) were pre-incubated for 18 h, and the cells were stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of samples for 24 h. iNOS protein level was determined using immunoblotting method.
- 4, 2 mM EDTA, 2 mM ethyleneglycotetraacetic acid, 50 mM 3-glycerophosphate? 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM dithiothreitol, 1% pepstatin, 1 mM benzimide 및 2 mMhydrogen peroxide)를 처리하여 total cell lystate# 조제하였다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 전기영동하고, wet-blotting transfer 방법을 이용하여, PVDF membrane 으로 단백질을 transfer하였다. Membrane을 5% BSA blockingbuffer어서 반응시킨 후 특정 단백질에 특이한 1차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다.
- 유색감자 홍영 및 자영 추출물의 항산화 활성은 peroxyl radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율 변화를측정하였다’ 과 산화 라디칼의 생성을 위해 2, 2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihychloride(Aldrich Chem, Inc. Milw.WI, 이하 AAPH로 표기)를 사용하였고, Talcott & Lee(2002) 가 항산화 활성 측정에 사용한 ORAC(oxygen radicalabsorbanceby fluorescein) 분석법을 이용하였다.본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시액들의 제조에는 중성phosphate buffer 를 사용하였다.
성능/효과
- 1.유색감자 홍영 및 자영 추출물의 항산화 활성검정 결과 추출물의 농도가 2 Hg/mL 이하 수준에서는 차이를 나타내지 않았으나, 10 aolmL을 처리한 경우 시료 간 차이를 나타내었으며, 유색감자 중 괴경 내부의 색상이 적색인 홍영은 ORAC value 0.257, 자영은 ORAC value 0.402로 대조 표준액인 trolox 보다 낮은 수치를 보였지만, 각각의 추출물로부터 유색의 원인이 되는 안토시아닌을 순수 분리하여 활성을 평가할 경우 표준액인 trolox와 동 등 혹은 그 이상의 항산화 효과를 기대할 수 있을 것이다.
- 2. 홍영 및 자영 추출물이 RAW 264.7 세포의 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제함을 확인하였고, 또한 Western blot으로 분석한 결과 각 추출물에 의한 iNOS 발현 억제는 NO 형성 억제와 유사한 경향을 보였으므로, NO 형성 억제는 iNOS의 발현저해 경로를 통하여 억제되는 것을 알 수있고, 또한 홍영 및 자영 추출물이 LPS에 의해 형성되는 PGE2를 감소시킬 것으로 판단되는데, 이는 COX-2 단백질의 발현 저해를 통하여 확인할 수 있었다.
- ORAC법을 적용한 항산화 시험 결과 홍영 및 자영 추출물은 비타민 E에 비하여 뚜렷한 항산화 활성을 나타내지는않았지만, 조 추출물 상태에서도 비타민 E 대비 1/2 또는 1/4정도의 항산화 효과를 나타냈었다. 또 NO생성을 저해하므로 각 추출물에 의한 염증인자(NO)의 생성 억제가 iNOS 단백질의 발현과 상관관계가 있는지를 검토하기 위하여 Western blot으로 조사한 결과 LPS를 첨가한 홍영과 자영에서는 농도의존적으로 iNOS의 발현을 억제하므로 LPS 의존적인 iNOS의 발현 억제를 통하여 NO생성이 억제되는것으로 조사되었다 (Fig.
- 7세포의 배양액 중 생성된 nitrite의 양을 griess 시약을 사용하여 홍영 및 자영 추출물의 NO 생성 저해 효과를 조사하였다. 그 결과 추출물의 농도에 의존적으로 NO 생성을 저해하였으며(Table 1), 홍영 및 자영 추출물 모두 추출물의 농도가 100 Ug/mL에서 NO 생성을 20% 이상 저해하였고, 자영 품종이 홍영에 비해 NO 생성 저해율이 높은 것으로 조사되었다. 한편 NO 생성 억제 효과가 있는 각 추출물 100 ug/mL로 재현성을 검토한 결과, 홍영과 자영 모두 유의한 수치를 보였고, 또한 세포독성 (cytotoxity)을 LDH assay kit를 이용하여 조사한 결과, 이 농도에서 세포독성은 나타나지 않았다 (Fig.
- 3). 따라서 홍영 및 자영 추출물은 RAW 264.7 세포에 대해 NO억제를 통한 항염증 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 항산화 효과를 나타냈었다. 또 NO생성을 저해하므로 각 추출물에 의한 염증인자(NO)의 생성 억제가 iNOS 단백질의 발현과 상관관계가 있는지를 검토하기 위하여 Western blot으로 조사한 결과 LPS를 첨가한 홍영과 자영에서는 농도의존적으로 iNOS의 발현을 억제하므로 LPS 의존적인 iNOS의 발현 억제를 통하여 NO생성이 억제되는것으로 조사되었다 (Fig. 4). LPS에 의한 대식세포의 활성etoll-like receptor(TLR) 4의 발현을 조절하며 (Harbone &Williams, 2000), LPS와 TLR 4가 결합하여 활성화되면 세포질 조절단백질인 MyD88이 모이게 되고, 여러 신호전달기전을 통하여 전사인자인 NF-kB가 인산화되어 핵 내로 이동하여 전사유도 된다(lontcheva et al.
- 또한 홍영 및 자영 추출물이 RAW 264.7 세포에서 LPS처리에 의한 COX-2의 생성을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). COX는 COX-1과 COX-2로 구분되는데, 다양한 세포에서 각각 다른 발현경향을 나타낸다.
- , 2004).이러한 사실에 기초하여 홍영 및 자영 추출물은 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해유도된 NO의 생성을 억제함을 확인하였고, 또한 Western blot으로 분석한 결과 각 추출물에 의한 iNOS발현 억제는 NO 형성 억제와 유사한 경향을 보였으므로, NO 형성 억제는 iNOS의 발현 저해경로를 통하여 억제되는 것을 알 수 있다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 ORAC를 통한 항산화 활성 비교에서 자영 추출물이 홍영추출물보다 우수한 항산화 활성을 나타내지만, 조 추출물 상태에서는 국제적 표준인 비타민 E 보다 낮은 활성을 나타낸다. 그러나 향후 유색의 원인이 되는 안토시아닌이 각각 순수 분리된다면 이들 안토시아닌은 비타민 E보다 우수하거나 동등한 효력의 항산화 활성을 나타낼 것으로 판단되고, 향후 이들 안토시아닌은 강력한 항산화물질로의 개발을 기대할 수 있을 것이다.
- , 2007).이에 따라 신품종인 유색감자 홍영과 자영 품종은 기존 백색을 가진 일반 감자에 비해 항산화, 항고혈압활성이 높아 식용감자로서의 기능성이 증대되어 그 이용가치가 높을 것으로 판단된다.
- 감자의 추출물을 얻고, 추출물의 항산화 활성을 검토하였다. 추출물의 항산화 활성을 ORAC assay를 이용하여 측정한 결과 각 추출물의 농도가 2 Mg/mL 이 하 수준에서는차이를 나타내지 않았으나, 10 ng/mL을 처리한 경우 시료간 차이를 뚜렷하게 나타내었다 (Fig. 2). ORAC value는 항산화 대조물질로 수용성 비타민E의 일종인 trolox를 대조 표준액으로 사용하였고, 대조 표준액의 value를 1로 볼 때 상대적으로 비교한 수치이다.
- 그 결과 추출물의 농도에 의존적으로 NO 생성을 저해하였으며(Table 1), 홍영 및 자영 추출물 모두 추출물의 농도가 100 Ug/mL에서 NO 생성을 20% 이상 저해하였고, 자영 품종이 홍영에 비해 NO 생성 저해율이 높은 것으로 조사되었다. 한편 NO 생성 억제 효과가 있는 각 추출물 100 ug/mL로 재현성을 검토한 결과, 홍영과 자영 모두 유의한 수치를 보였고, 또한 세포독성 (cytotoxity)을 LDH assay kit를 이용하여 조사한 결과, 이 농도에서 세포독성은 나타나지 않았다 (Fig. 3). 따라서 홍영 및 자영 추출물은 RAW 264.
- ORAC value는 항산화 대조물질로 수용성 비타민E의 일종인 trolox를 대조 표준액으로 사용하였고, 대조 표준액의 value를 1로 볼 때 상대적으로 비교한 수치이다. 홍영(ORAC value : 0.257) 및자영(ORAC value : 0.402)의 조 추출물에서는 대조 표준액인 trolox에 비해 낮은 항산화 효과를 보였지만, 각 조 추출물로부터 유색의 원인물질인 안토시아 인 성분을 순수하게 분리한 후 동일한 방식으로 항산화를 측정할 경우 대조 표준액인 trolox와 대등 한 결과가 나올 것으로 판단되며, 홍영과 자영 품종 간 항산화 능력을 비교하면 괴경 내부가 보라색인 자영 품종이 괴경 배부가 적색인 홍영에 비해 약 1.5 배 높은 항산화 활성을 나타내는 것으로 조사되었다.
후속연구
- 3.유색감자 중 괴경 내부가 적색인 홍영 품종은 자색인 자영 품종에서 보다 상대적으로 우수한 COX-2 발현 단백질 저해 효과가 확인되었으며, 괴경 내부가 보라색인 자영품종은 ORAC를 통한 항산화 활성, NO 및 iNOS 억제효과가 홍영 대비 30% 이상 증가된 양상을 나타내므로, 홍영과 자영 품종에 함유된 안토시아닌은 서로 다른 기능의 질환을예방하거나 치료할 수 있을 것으로 판단되며, 향후 품종별용도를 구분하여 활용하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
- E 보다 낮은 활성을 나타낸다. 그러나 향후 유색의 원인이 되는 안토시아닌이 각각 순수 분리된다면 이들 안토시아닌은 비타민 E보다 우수하거나 동등한 효력의 항산화 활성을 나타낼 것으로 판단되고, 향후 이들 안토시아닌은 강력한 항산화물질로의 개발을 기대할 수 있을 것이다. 또한, 자영 품종은 홍영에 비하여 항산화 활성 외에도 약 30% 정도 향상된 NO 및 iNOS 억제 효과를 나타내어 염증 및 면역체계의 다양한 기 전에 있어 하나의 작용점으로 제시될 수 있다.
- 따라서 유색 감자 홍영과 자영 품종에 함유되어 있는 안토시아닌은 우수한 항산화 활성이 있는 것으로 판단되며, 특히 자영 품종에 함유된 안토시아닌은 iNOS 의존적인 질환의 예방 및 치료에, 홍영에 함유된 안토시아닌은 COX-2 발현 저해를 통한 질환 치료 또는 예방의 관점에서 연구개발및 이용되어져야 할 것으로 사료된다.
- 또한, 자영 품종은 홍영에 비하여 항산화 활성 외에도 약 30% 정도 향상된 NO 및 iNOS 억제 효과를 나타내어 염증 및 면역체계의 다양한 기 전에 있어 하나의 작용점으로 제시될 수 있다. 반면 괴경 내부의 색이 적색인 홍영은 보라색인 자영보다 COX-2 발현 단백질의 저해 효과가 높은 양상을 나타내므로, 홍영과 자영 품종에 함유된 안토시아닌은 서로 다른 기능의 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 것으로 판단되며, 향후 품종별 용도를 구분하여 활용하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
- , 2005). 위의 결과에서 홍영 및 자영 추출물의 항산화 효과는 함유된 안토시아닌 및 플라보노이드를 포함하는 phenolic compounds의 분포와 구성에 영향을 받는 것으로 생각되며, 추후 항산화 활성에 영향을 주는 주요 안토시아닌 및 페놀 화합물의 명확한구조해석과 활성 메카니즘의 구명이 필요할 것이다.
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