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문제 정의
- 따라서 이번 연구는 톳과 감태의 혼합물을 사료 내에 단계별로 첨가하여 넙치에 있어서 적정 첨가함량 및 비 특이적 면역반응에 미치는 영향을 조사하고, 주요 어병세균 중에 하나인 E. tarda에 대한 질병저항성에 미치는 영향을 알아보고자 수행되었다.
제안 방법
- 2주간의 사료공급 마지막 날 최후 사료 공급을 실시한 후, 시간대별로 나누어 혈액을 채취하였다. 시간은 마지막 사료공급을 실시하고 3, 6, 12 및 24시간 후에 각 수조마다 3마리씩의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol (100 ppm)용액으로 마취시켜 주사기를 사용하여 미부동맥에서 채혈을 한 후, NBT (nitroblue tetrazolium) activity를 측정하였다.
- 2주간의 사료공급 후 24시간 절식시킨 다음, 각 수조마다 10마리의 실험어를 무작위 선별하여 E. tarda 부유액 0.1 mL (1.0 ×107 CFU/mL)를 넙치 복강 내에 주사하였다.
- 시간은 마지막 사료공급을 실시하고 3, 6, 12 및 24시간 후에 각 수조마다 3마리씩의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol (100 ppm)용액으로 마취시켜 주사기를 사용하여 미부동맥에서 채혈을 한 후, NBT (nitroblue tetrazolium) activity를 측정하였다. Nitrobluetetrazolium (NBT) 분석은 Anderson and Siwicki (1995)의 방법을 응용하여 폭발호흡 동안에 neutrophils에 의한 oxidative radical 생산을 측정하였다. 분석방법은 혈액과 0.
- 3. Total polyphenolic compounds in the experimental diets supplemented with 0%, 2%, 4%, 6% and 8% of alga mixtures (Hizikia:Ecklonia, 1:1). Bars with different letters are significantly different (P≤0.
- USA)에 균액을 접종하여 균의 집락을 확인하였다. 균액의 농도를 McFarland No. 0.5로 맞추기 위하여 배양된 균을 멸균생리식염수로 희석하였다. 2주간의 사료공급 후 24시간 절식시킨 다음, 각 수조마다 10마리의 실험어를 무작위 선별하여 E.
- 그 후, Formazon 생성을 감소시키기 위해 1 mL의 dimethylformamide를 첨가한 후, 2000 × g 에서 5분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 상층액을 취한 후, NBT의 감소되는 범위를 spectrophotometer (Genesys 10 UV, Rochester, NY, USA)를 사용하여 최적의 흡광도인 540 nm에서 측정하였다.
- 분석방법은 혈액과 0.2% NBT 용액을 1:1의 비율로 각각 50 μL씩 혼합한 후, 25℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 50 μL을 취하여 유리튜브에 옮긴다.
- 사료 내 톳·감태 혼합물의 첨가가 넙치의 항병력에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Edwardsiella tarda을 이용하여 공격 실험을 하였다.
- 01 g)는 총 15개의 100 L 원형수조에 각 수조 당 30 마리씩 무작위로 선택하여 배치되었다. 사료공급실험은 실험구당 3 반복구를 두었으며, 사육수는 여과해수를 사용하여 2~3 L/min 의 유수량이 공급되도록 조절되었고, 모든 실험수조에 용존산소 유지와 원활한 사육수 순환을 위하여 에어스톤을 설치하였다. 광주기는 자동타이머가 설치된 형광등을 이용하여 12L:12D 조건으로 유지되었고, 전 실험기간 동안 평균 수온은 21℃에서 24℃ 범위로 자연수온에 의존되었다.
- 실험사료는 1일 2회 (오전 09:00 hr 와 오후 16:00 hr)에 나눠서 2주 동안 만복공급을 실시하였다. 사료공급은 2주간 수행되었다.
- 2주간의 사료공급 마지막 날 최후 사료 공급을 실시한 후, 시간대별로 나누어 혈액을 채취하였다. 시간은 마지막 사료공급을 실시하고 3, 6, 12 및 24시간 후에 각 수조마다 3마리씩의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol (100 ppm)용액으로 마취시켜 주사기를 사용하여 미부동맥에서 채혈을 한 후, NBT (nitroblue tetrazolium) activity를 측정하였다. Nitrobluetetrazolium (NBT) 분석은 Anderson and Siwicki (1995)의 방법을 응용하여 폭발호흡 동안에 neutrophils에 의한 oxidative radical 생산을 측정하였다.
- 우선 동결건조된 분말형태의 톳과 감태를 1:1 비율로 혼합한 후, 사료 내 첨가함량이 각 0, 2, 4, 6 및 8%가 되도록 첨가하여 (HE 0, HE 2, HE 4, HE 6 및 HE8) 실험사료를 제조하였다. 실험사료 제조는 우선 모든 사료원들을 파쇄기를 이용하여 분말형태로 일정하게 만들고, 각 사료원들을 사료조성표에 따라 정확히 무게를 잰 후, 잘 섞은 다음 사료원 총량의 30~40% 에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기 (NVM-14-2P, KOREA)로 혼합, 반죽시켰다. 혼합반죽물은 소형쵸파기 (SMC-12, KOREA)를 이용하여 직경3 mm 크기로 성형되었다.
- 광주기는 자동타이머가 설치된 형광등을 이용하여 12L:12D 조건으로 유지되었고, 전 실험기간 동안 평균 수온은 21℃에서 24℃ 범위로 자연수온에 의존되었다. 실험사료는 1일 2회 (오전 09:00 hr 와 오후 16:00 hr)에 나눠서 2주 동안 만복공급을 실시하였다. 사료공급은 2주간 수행되었다.
- 실험사료에서의 총 폴리페놀 함량은 Skerget et al. (2005)의 방법을 기초로 약간 수정하여 비색 정량하였다. 먼저, 사료를 분쇄시킨 다음 각 사료의 1 g을 메탄올 50 mL에 넣은 후 40℃에서 2시간 동안 추출하였다.
- 톳과 감태 분말의 일반성분 분석은 Table 2에 나타내었다. 우선 동결건조된 분말형태의 톳과 감태를 1:1 비율로 혼합한 후, 사료 내 첨가함량이 각 0, 2, 4, 6 및 8%가 되도록 첨가하여 (HE 0, HE 2, HE 4, HE 6 및 HE8) 실험사료를 제조하였다. 실험사료 제조는 우선 모든 사료원들을 파쇄기를 이용하여 분말형태로 일정하게 만들고, 각 사료원들을 사료조성표에 따라 정확히 무게를 잰 후, 잘 섞은 다음 사료원 총량의 30~40% 에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기 (NVM-14-2P, KOREA)로 혼합, 반죽시켰다.
- 병원균이 주입된 실험어는 총 10개의 20 L 수조에 그룹별로 2반복 무작위 배치되었다. 하루 2번 폐사를 형태적으로 관찰하면서 사육수를 여과해수로 교환하였으며, 사망어류의 신장을 분리한 후 Salmonella Shigella agar에 배양하여 사망원인을 진단하였다.
대상 데이터
- 1Hizikia fusiformis was purchased in the market (Dongmun public market, Jeju, Korea).
- 그 후, Formazon 생성을 감소시키기 위해 1 mL의 dimethylformamide를 첨가한 후, 2000 × g 에서 5분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 상층액을 취한 후, NBT의 감소되는 범위를 spectrophotometer (Genesys 10 UV, Rochester, NY, USA)를 사용하여 최적의 흡광도인 540 nm에서 측정하였다. Blank는 dimethyl formamide를 사용하였다.
- 사료 내 톳·감태 혼합물의 첨가가 넙치의 항병력에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Edwardsiella tarda을 이용하여 공격 실험을 하였다. 실험에 사용된 균주인 E. tarda (KCTC-12267)는 한국유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures,KCTC)에서 분양받아 1.5% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion Broth (Difco. Co. USA) 배지 25℃에서 48시간 배양하여 사용하였으며, 1.5% NaCl이 첨가된 Salmonella Shigella agar (Difco. Co. USA)에 균액을 접종하여 균의 집락을 확인하였다. 균액의 농도를 McFarland No.
- 본 실험의 사료조성표는 Table 1에 나타내었으며, 실험사료원의 성분분석 결과는 Table 2에서 보여주고 있다. 이 실험에 사용된 톳 분말은 제주시에 위치한 동문시장에서 제주산 톳을 구입하여 줄기를 제거한 후, 동결건조하여 분말을 제조하였다. 감태 분말은 제주대학교 해양과학대학 해양생물자원이용공학연구실로부터 지원받았다.
- 이번 실험에 사용된 실험어류는 제주도내 해수리수산에서 중간육성된 넙치로 제주대학교 소속 해양과환경연구소로 운송되어, 4주 동안 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에 적응할 수 있도록 순치시킨 후 사료공급실험에 사용되었다.
- 실험사료 제조는 우선 모든 사료원들을 파쇄기를 이용하여 분말형태로 일정하게 만들고, 각 사료원들을 사료조성표에 따라 정확히 무게를 잰 후, 잘 섞은 다음 사료원 총량의 30~40% 에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기 (NVM-14-2P, KOREA)로 혼합, 반죽시켰다. 혼합반죽물은 소형쵸파기 (SMC-12, KOREA)를 이용하여 직경3 mm 크기로 성형되었다. 성형된 실험사료는 -70℃ 동결냉동건조기에서 건조시켜, 시브 (Sieve)를 이용하여 적당한 크기의 사료로 가공되었으며, 사료 공급 전까지 -20℃ 냉동고에 보관되었다.
데이터처리
- 데이터 값의 유의차는 Duncan’s multiple test (P≤0.05)로 비교되었다.
- 데이터는 평균값 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었다.
- 데이터는 평균값 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었다. 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석되었다.
- 실험사료군의 배치는 완전확률계획법 (Completely randomized design)에 따라 실시하였고, 성장 및 분석결과는 SPSS (Statistical package for the social sciences) (Version 12.0)프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석되었다. 데이터 값의 유의차는 Duncan’s multiple test (P≤0.
이론/모형
- 실험사료의 일반성분 분석은 AOAC (Association of Official Analytical Chemists) (1995) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법 (125℃, 3 hr), 조회분은 직접회화법 (550℃, 12 hr)으로 측정하였고, 단백질은 자동 조단백분석기 (Kejltec system 2300, Sweden)로 분석되었으며, 지방은 Folch et al. (1959)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치 (Soxhlet heater system C-SH6,Korea)를 이용하여 분석되었다.
성능/효과
- 2주간의 사료공급 마지막 날 최후 사료 급을 실시한 후, 사료 내 톳·감태 혼합물이 비 특이적 면역반응에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 시간대별 (먹이공급 후 3hr,6hr, 12hr 및 24hr)로 혈액을 채취하여 NBT activity를 분석한 결과 6시간 후에서 톳․감태 혼합물을 첨가한 모든 실험구에서 대조구 보다 유의적으로 높은 활성을 보였다 (Fig 1). 24시간 후에는 4%와 6% 첨가구에서 대조구 보다 유의적으로 높은 활성을 보였으며, 다른 실험구에서는 대조구와 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. Kim et al.
- 2주간의 사료공급 마지막 날 최후 사료 급을 실시한 후, 사료 내 톳·감태 혼합물이 비 특이적 면역반응에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 시간대별 (먹이공급 후 3hr,6hr, 12hr 및 24hr)로 혈액을 채취하여 NBT activity를 분석한 결과 6시간 후에서 톳․감태 혼합물을 첨가한 모든 실험구에서 대조구 보다 유의적으로 높은 활성을 보였다 (Fig 1).
- 톳ㆍ감태 혼합물이 가장 낮게 첨가된 2% 첨가구를 제외한 모든 첨가 실험구에서 대조구에 비해 초기폐사율이 유의적으로 낮게 나타났다. Pham et al. (2006)의 연구에서 치어기 넙치를 대상으로 사료 내 톳을 0%, 2%, 4% 및 6%를 각각 첨가하여 8주 동안 사육한 실험구에 Streptococcus iniae (106 CFU/mL)를접종하여 공격실험을 수행한 결과 2%와 4% 실험구에서의 누적사망률은 대조구(0%)와 유의적인 차이를 보이지 않았으나 (누적사망률, 33%, 33% 및 28.6%), 가장 높은 6% 첨가구에서는 대조구 보다 유의적으로 높은 생존율을 보였다. 본 연구에서도 이와 비슷하게 가장 낮은 2% 첨가구는 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않았고, 4%, 6%, 및 8% 첨가구에서는 대조구 보다 유의적으로 낮은 누적사망률을 보였다.
- 따라서 톳·감태 혼합물은 최근 많은 문제가 되고 있는 합성항생제를 대체하여 어류의 면역력을 증강시킬 수 있는 천연 면역증강제로 사용 가능할 것으로 판단된다. 또한 비 특이적 면역반응과 질병저항성을 고려할 경우 가장 적절한 사료 내 첨가함량은 약 6%로 판단된다. 하지만 톳·감태 혼합물이 넙치의 성장에 미치는 효과는 사육기간이 짧은 관계로 조사되지 못했다.
- 본 연구에서는 사료 내 톳·감태 혼합물을 첨가함에 따라 실험사료에서의 DPPH radical scavenging activity (Fig 2) 및 폴리페놀 함량 (Fig 3)이 농도 의존적으로 증가하였다.
- 6%), 가장 높은 6% 첨가구에서는 대조구 보다 유의적으로 높은 생존율을 보였다. 본 연구에서도 이와 비슷하게 가장 낮은 2% 첨가구는 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않았고, 4%, 6%, 및 8% 첨가구에서는 대조구 보다 유의적으로 낮은 누적사망률을 보였다.
- (2006)은 넙치에서 NBT activity를 분석하여 톳의 면역증강 효과를 증명하였고, Kim and Lee(2008)는 넙치에서 NBT activity를 분석하여 감태의 면역증강 효과를 증명하였다. 이 두 실험에서 면역증강 효과에 대한 메커니즘으로 사료 내 톳과 감태를 각각 첨가함에 따라 DPPHradical scavenging activity 및 폴리페놀 함량과 같은 항산화 효과가 향상됨을 알 수 있었다. 톳, 감태와 같은 갈조류에는 많은 fucoidan이 존재하여 종양세포의 성장저해 (Yamamotoet al.
- 이 연구결과를 요약하면, 사료 내 톳ㆍ감태 혼합물의 첨가는 톳·감태 혼합물에 포함된 생리활성 물질이 항산화 효과를 증진하여 넙치의 비 특이적 면역반응을 증강시켜 E. tarda에대한 질병저항성을 향상시킨 것으로 사료된다.
- 이 연구에서 사용된 톳·감태 혼합물은 6시간과 24시간 후에 면역력을 증강시킴으로서 다른 물질보다 더 지속적으로 면역력을 증강시키는 것으로 판단된다.
- 이번 연구에서는 갈조류에 속하는 해조류인 톳·감태 혼합물을 1:1 비율로 혼합하여 사료 내에 첨가하였을 때 양식넙치의 면역력과 질병저항성을증진시킬 수 있는 천연 사료첨가제로 사용 가능함을 보여주었다.
- 총 5개의 실험사료는 조단백질 함량과 에너지 수준이 각각 44%와 17.1 MJ/kg을 갖도록 동일하게 조성되었다. 본 실험의 사료조성표는 Table 1에 나타내었으며, 실험사료원의 성분분석 결과는 Table 2에서 보여주고 있다.
- 톳ㆍ감태 혼합물 첨가에 따라 어병세균에 대한 저항성을 알아보기 위해 실시한 공격실험 결과, 접종한지 3일 후에 급격한 폐사를 보이고 그 이후에는 폐사하지 않았다 (Table 3). 톳ㆍ감태 혼합물이 가장 낮게 첨가된 2% 첨가구를 제외한 모든 첨가 실험구에서 대조구에 비해 초기폐사율이 유의적으로 낮게 나타났다. Pham et al.
- (2007)은 사료 내 두메꿀풀 열수추출액과 미생물 배양액을 사료 내 첨가하여 넙치를 대상으로 시간대별(3hr, 24hr)로 NBT activity를 분석한 결과 3시간에서 유의적으로 높은 활성이 관찰되었고, 24시간 후에는 유의적인 차이를 보이지 않았다고 보고하였다. 하지만 본 실험에서는 6시간과 24시간 후 모두에서 NBT activity가 대조구보다 유의적으로 높은 활성을 보였다. 이것은 첨가물질에 따라서 생리활성 물질의 대사과정 시간과 그 효능이 면역반응에 미치는 효과가 다를 수 있다는 것을 의미한다.
후속연구
- 또한 많은 연구에서 그 우수성이 보고된 물질이라 하더라도 그 농도를 적정농도 이상 사용하면 오히려 부작용이 나타날 수 있으며 (Shiau and Yu, 1999), 적정농도 이하로 사용하면 그 효과가 미비할 수도 있다. 따라서 양식대상 어종에 따라 첨가제의 종류 및 첨가농도를 고려하면서 연구되어야 할 것이다. 하지만 톳, 감태의 혼합첨가에 따른 면역증강 효과 및 어병세균 (E.
- 따라서 톳·감태 혼합물은 최근 많은 문제가 되고 있는 합성항생제를 대체하여 어류의 면역력을 증강시킬 수 있는 천연 면역증강제로 사용 가능할 것으로 판단된다.
- 따라서 톳·감태 혼합물의 최종적인 사료 내 첨가함량은 성장실험에 초점을 둔 장기적인 사육실험을 실시하여 성장, 단백질전환효율, 사료효율, 일간성장률, 먹이섭취율 등을 고려하여 재조명 되어야 할 것으로 사료된다.
- 하지만 보다 더 구체적인 매커니즘은 장기간의 성장실험과 톳·감태 혼합물의 생리활성 성분분석을 통한 충분한 해석이 필요할 것으로 판단된다.
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