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가설 설정
- b : Positive control.
제안 방법
- n-BuOH 분획 46 g을 silica gel column chromatography (CHCl3: MeOH : H2O = 7 : 3 : 1→ 6 : 4 : 1)를 실시하여 7개의 분획물(AEB1～AEB7)을 얻었다.
- 분획 AEB6 (14.14g) 분획에 대하여 CHCl3: MeOH: H2O (7 : 3 : 1→ 65 : 35 : 10)을 기울기용리 방식으로 silica gel c.c를 실시하여 5개의 소분획물(AEB6-1～AEB6-5)을 얻었다.
- AEB5 (5.7 g) 분획에 대하여 CHCl3: MeOH : H2O (7 : 3 : 1→ 65 : 35 : 10)로 silica gel column chromatography (c.c)를 실시하여 5개의 소분획(AEB5-1～AEB5-5)으로 나누고 그 중 AEB5-3을 ODS c.c (H2O: MeOH = 6 : 4)를 이용하여 화합물 1 (109mg)을 분리하였다.
- 두릅나무 순에서 분리된 生理活性 物質의 抗酸化 效果에 대한 硏究가 거의 없는 실정으로 본 硏究에서는 두릅나무 순에서 식물 화학적 성분 연구 결과로 4종의 flavonol glycoside를 분리하였으며 이들 화합물은 두릅 순에서 처음 분리된 것이다. 이 化合物들에 대하여 DPPH, ABTS 및 SOD를 이용하여 抗酸化 活性을 검토하였다.
- H2SO4를 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA)으로 측정하였다.
- 5 l)로 분배 추출하고, 다시 물층은 n-butanol (n-BuOH, 1l × 2)로 분배 추출하였다. 얻어진 각층을 감압 농축하여 EtOAc 가용분획(2.7g), n-BuOH (46.2g) 및 물분획을 얻었다.
- 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) spectrum에서 flavonoid A ring의 H-6과 H-8의 signal이 각각 δH 6.60 및 6.36에서 broad singlet으로 관측되었으며, B ring 의 ABX type의 H-2', H-5', H-6'의 signal이 각각 δH 7.30 (s), 7.24 (d, J=7.6 Hz), 6.85 (d, J=7.6 Hz)에서 나타나 B환의 3', 4'이 치환된 quercetin골격을 갖는 것으로 추정하였다.
- 이들의 결합 위치는 2D-NMR의 HMBC에서 C-3', C-7'과 δH 5.51, 5.32의 correlation peak과 관측되어 각 결합위치를 확인하였다.
- 두릅 잎으로부터 얻어진 MeOH 추출물에 대하여 용매의 극성에 따라 EtOAc, n-BuOH 및 H2O로 순차 분획하고 각 분획은 감압 농축하여 3개의 분획물을 얻었다. n-BuOH 분획으로부터 silica gel과 ODS column chromatography를 이용하여 화합물 1, 2, 3, 4를 분리하였다.
- O로 순차 분획하고 각 분획은 감압 농축하여 3개의 분획물을 얻었다. n-BuOH 분획으로부터 silica gel과 ODS column chromatography를 이용하여 화합물 1, 2, 3, 4를 분리하였다.
- 이와 같이 플라보노이드 화합물들의 생리활성이 널리 알려지면서 이들 물질을 이용한 식품 및 의약품 개발에 관심과 연구가 지속적으로 증가하고 있다. 따라서 두릅에서 분리한 플라보노이드 화합물의 항산화 활성을 확인화기 위하여 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 활성 및 SOD 유사 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 두릅 순은 제주도 지역의 재배 두릅을 제주도의 시장에서 구입하여 제주대학교 생물학과 김문홍 교수가 동정하여 사용하였으며, 표품은 대구한의대학교 한방식품약리학과 실험실에 보관하였다.
- 시료의 추출과 분획에 사용한 유기 용매는 대정화학주식회사에서 생산한 1급 시약을 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Merck, Germany)을, octadecylsilica gel (ODS)은 LiChroprep RP-18 (Merck, Germany)을 사용하였다.
- TLC는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254s를 사용하였고, TLC상의 물질 검출에는 UV lamp와 10% aq. H2SO4를 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA)으로 측정하였다.
- 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 L-Ascorbic Acid와 BHA(butylated hydroxyanisole)을 사용하였다.
- 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 L-ascorbic Acid와 BHA (butylated hydroxyanisole)을 사용하였다.
- SOD 유사활성은 시료용액의 실험군과 대조군의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 L-Ascorbic Acid를 사용하였다.
이론/모형
- 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 Blois17) 방법에 따라 측정하였다. 각 시료 용액 100 μL에 0.
- Superoxide dismutase(SOD) 유사활성은 pyrogallol 자동 산화의 저해를 관찰하는 Marklund의 방법19)을 사용하였다. 각 시료용액 40μL에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM Tris +10mM EDTA, pH 8.
성능/효과
- 화합물 4는 화합물 3과 매우 유사한 양상을 보였으며 1H-NMR spectrum에서 δH 7.35 (s, H-2'), 6.89 및 7.30 에서 각각의 duublet (J=8.0 Hz)이 관측되어 flavonoid B-ring의 H-2' 및 H-5', 6'에 의한 것임을 확인하여 quercetin 골격을 갖는 화합물임을 확인하였고, 당부분의 chemical shift들은 화합물 3과 유사하여 각각의 chemical shift들을 문헌과 비교하여 화합물 4는 quercetin 3-O-β-glucosyl(1→2)-α-rhamnoside-7-O-α-rhamnoside로 구조 동정하였다23).
- 또한 δH 4.42에서(d, J=7.6 Hz)에서 관측된 signal 및 5.70, 5.55에서 관측된 signal, 그리고 3.22∼4.30 ppm 부근에서 산소와 결합된 다수의 signal들이 관측되어 당의 존재를 확인하였으며, 각각의 signal들은 4.42 ppm에서 glucose가 J=7.6 Hz로 β 결합하고 있으며 5.70 및 5.55 ppm에서 두 분자의 rhamnose가 α결합하고 있는 것을 확인하였으며 각각의 chemical shift들을 문헌과 비교하여 화합물 3은 kaempferol 3-O -β-glucosyl (1→2)-α-rhamnoside-7-O -α-rhamnoside로 구조 동정하였다22).
- 화합물 2는 화합물 1의 NMR spectrum과 매우 유사한 양상을 보였으며 화합물 1의 spectrum과 비교한 결과 δH 5.18의 anomeric proton의 coupling constant가 J=7.6 Hz로 관측되어 당이 β결합하고 있는 것을 확인하였다.
- 이상의 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 1은 quercetin 3,7-di-O-α-rhamnopyranoside로 동정하였다20).
- 두릅에서 분리된 화합물들의 항산화 활성을 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거능 활성은 화합물 1과 4는 50 ㎍/㎖의 농도에서 50% 이상의 라디칼 소거 활성을 나타내었으며 화합물 1은 91% 이상의 높은 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능 활성 역시 시료의 농도 의존적으로 활성이 증가되었으며 100 ㎍/㎖의 농도에서 화합물 모두 50% 이상의 소거 활성을 나타내었으며 그 중에서도 화합물 1, 4가 가장 높은 활성을 보였으며 대조구인 BHA의 소거능과 거의 유사한 정도의 활성을 나타내었다.
- 두릅에서 분리된 화합물들의 항산화 활성을 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거능 활성은 화합물 1과 4는 50 ㎍/㎖의 농도에서 50% 이상의 라디칼 소거 활성을 나타내었으며 화합물 1은 91% 이상의 높은 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능 활성 역시 시료의 농도 의존적으로 활성이 증가되었으며 100 ㎍/㎖의 농도에서 화합물 모두 50% 이상의 소거 활성을 나타내었으며 그 중에서도 화합물 1, 4가 가장 높은 활성을 보였으며 대조구인 BHA의 소거능과 거의 유사한 정도의 활성을 나타내었다. SOD를 이용한 항산화 활성 테스트에서는 Table 3에 나타낸 바와 같이 화합물 3이 positive control인 L-ascorbic acid보다는 약하지만 두릅에서 분리한 화합물 중 가장 강한 활성을 나타내었다.
- ABTS 라디칼 소거능 활성 역시 시료의 농도 의존적으로 활성이 증가되었으며 100 ㎍/㎖의 농도에서 화합물 모두 50% 이상의 소거 활성을 나타내었으며 그 중에서도 화합물 1, 4가 가장 높은 활성을 보였으며 대조구인 BHA의 소거능과 거의 유사한 정도의 활성을 나타내었다. SOD를 이용한 항산화 활성 테스트에서는 Table 3에 나타낸 바와 같이 화합물 3이 positive control인 L-ascorbic acid보다는 약하지만 두릅에서 분리한 화합물 중 가장 강한 활성을 나타내었다.
- 이상의 결과로 보아 두릅에서 분리된 flavonoid 배당체 화합물은 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 두릅은 매우 쉽게 구할 수 있으며 식용으로 쓰이고 있다는 점에서 두릅의 폭넓은 이용 가능성을 시사하고 있다. 이들 flavonoid 화합물에 대한 다양한 생리적 및 약리적 활성이 검토됨으로써 건강기능성 식품 또는 의약품의 소재로서의 개발가능성이 있다고 여겨지며, 추후 이와 관련된 연구가 활발히 추진 될 것으로 기대된다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 두릅에서 분리된 flavonoid 배당체 화합물은 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 두릅은 매우 쉽게 구할 수 있으며 식용으로 쓰이고 있다는 점에서 두릅의 폭넓은 이용 가능성을 시사하고 있다. 이들 flavonoid 화합물에 대한 다양한 생리적 및 약리적 활성이 검토됨으로써 건강기능성 식품 또는 의약품의 소재로서의 개발가능성이 있다고 여겨지며, 추후 이와 관련된 연구가 활발히 추진 될 것으로 기대된다.
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