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문제 정의
- 인체 섬유육종세포(HT-1080)는 활성산소종 형성과 관련된 실험에서 널리 사용되어는 방법이며(Lee 등 2008), 양파 섭취는 결장암 위험을 감소시켰다고 보고되었다(Millen 등 2007). 그러므로 본 연구에서는 저온 진공 건조기를 이용하여 건조시킨 붉은 양파를 분말화하여 품질 특성을 검토하고 유기용매로 추출한 후 인체 섬유육종세포(HT-1080) 및 결장암세포(HT-29)에 대한 증식 및 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과에 대하여 검토하고자 한다.
- 본 연구에서는 저온 진공 건조장치를 이용하여 붉은 양파를 건조한 후 비타민 C를 포함한 일반성분 및 총 페놀성분을 측정하였고 유기 용매로 추출하여 인체 섬유육종세포 (HT-1080) 및 결장암세포(HT-29)에 대한 증식 억제효과와 세포 내 활성산소종 억제 효과에 대해 검토하였다. 저온 진공 건조방법으로 건조된 붉은 양파 분말은 생것과 비교했을 때 수분의 경우 80%가 감소하였고 높은 비타민 C와 총 페놀함량을 확인하였다.
제안 방법
- HPLC 분석 시료는 무게 1 g을 정확히 취하여, 10% HPO3 용액 9 mL을 가해 균질화하여 추출한 후 원심분리기(Combi-514R, Hanil, Korea)를 사용하여 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻어진 상층액을 20 μL를 취하여 HPLC에 주입하여 비타민 C를 분석하였다.
- 건조된 붉은 양파 분말은 실험 사용 전까지 -70℃의 deep freezer(NF-400SF, Nihon, Freezer, Japan)에 냉동 보관되었다가 유기용매 추출을 위하여 acetone:methylene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 붉은 양파 분말이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator(N-1000, Eyela, Japan)로 농축하여 aceton/methylene chloride 추출물(A+M)을 얻었다.
- 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 μM H2O2를 처리를 하고, blank군은 500 μM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
- 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 혼합한 다음 3분 동안 방치한 후 10% Na2CO3 용액 2 mL을 넣고 1시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 UV-visible spectrometer(helios beta, thermo electron corporation, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이때 표준물질로 tannic acid(Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였으며 시료와 동일한 방법으로 분석 후 얻은 표준곡선으로부터 총 페놀성 화합물 함량을 나타내었다.
- 배양 후 MTT assay를 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약 5 mg을 1 mL PBS로 녹인 후, 10% FBS가 함유된 배지 9 mL와 희석하여 100 μL를 첨가하고 3~4시간 동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다.
- 배양된 암세포는 96 well cell culture plate에 2×104 cells/mL이 되도록 100 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-15AC, Sanyo Electric Biomedical Co., Japan)에서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 배지로 희석하여 각 well당 시료를 100 μL씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 100 μL씩 첨가하였다.
- 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO를 100 μL씩 분주하여 5~10분간 반응시켜 microplate reader(VICTOR3, Perkin Elmer, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Denizot & Lang 1986).
- 본 실험에 사용된 붉은 양파(red onion)는 경상남도 창녕군에서 재배한 것을 구입하였다. 붉은 양파는 저온 진공 건조기(STVD-50, Sanya, Korea)를 이용하여 상당포화온도 15~25℃, 절대압력 15~40 mmHg에서 24시간 건조시켜 붉은 양파 분말을 제조하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 붉은 양파(red onion)는 경상남도 창녕군에서 재배한 것을 구입하였다. 붉은 양파는 저온 진공 건조기(STVD-50, Sanya, Korea)를 이용하여 상당포화온도 15~25℃, 절대압력 15~40 mmHg에서 24시간 건조시켜 붉은 양파 분말을 제조하였다.
- 05 M KH2PO4/acetonitrile(60:40)을 사용하였으며 유속은 1mL/min으로 하여 UV/VIS detector로 254 nm에서 분석하였다. 표준물질은 L-ascorbic acid(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다.
- 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유육종세포(HT-1080)와 인체 결장암세포(HT-29)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-1080 세포와 HT-29 세포를 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지와 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-15AC, Sanyo Electric Biomedical Co.
데이터처리
- 실험결과는 Mean±SE(Standard Error)으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 건조 붉은 양파 분말의 수분, 조단백질, 조지방, 조회분은 AOAC 방법(AOAC International 2005)에 따라 분석하였다. 즉, 수분은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조단백은 Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조회분은 550℃ 전기로에서 화학시키는 직접회화법으로 정량하였다.
- 즉, 수분은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조단백은 Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조회분은 550℃ 전기로에서 화학시키는 직접회화법으로 정량하였다. 비타민 C의 함량은 식품공전(한국식품공업협회 2000)의 방법에 의하여 HPLC(P580, Dionex, USA)로 분석하였다. HPLC 분석 시료는 무게 1 g을 정확히 취하여, 10% HPO3 용액 9 mL을 가해 균질화하여 추출한 후 원심분리기(Combi-514R, Hanil, Korea)를 사용하여 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻어진 상층액을 20 μL를 취하여 HPLC에 주입하여 비타민 C를 분석하였다.
- 세포 내 활성산소종은 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescin diacetate) assay로 측정하였다(LeBel 등 1992; Tsuchiya 등 1994).
- 건조 붉은 양파 분말의 수분, 조단백질, 조지방, 조회분은 AOAC 방법(AOAC International 2005)에 따라 분석하였다. 즉, 수분은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조단백은 Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조회분은 550℃ 전기로에서 화학시키는 직접회화법으로 정량하였다. 비타민 C의 함량은 식품공전(한국식품공업협회 2000)의 방법에 의하여 HPLC(P580, Dionex, USA)로 분석하였다.
- 총 페놀성 화합물 함량 측정은 Folin-Denies법(Amerinem & Ough 1958)을 응용하여 측정하였다.
성능/효과
- 19 mg/mL로 HT-1080 세포에 대하여 가장 높은 활성을 나타내었다. HT-29 세포에 대한 결과는 HT-1080 세포와 유사하게 붉은 양파 A+M 추출물은 MeOH 추출물보다 높은 증식 억제 효과를 나타내었다. 또한 분획물들도 앞서 HT-1080 암세포에 대한 결과와 유사하게 water 분획물을 제외하고 5 mg/mL 이상의 농도에서는 88% 이상의 억제효과를 보였다.
- 분획물들 중 hexane 및 85% aq. MeOH 분획물들에 의한 활성이 높았으며 각각의 IC50 농도는 0.17 및 0.16 mg/mL이었고 특히 HT-29 세포에 대한 증식 억제가 보다 효과적이었다. 세포 내 활성산소종 생성 억제 능력은 저온 진공으로 건조된 붉은 양파 A+M 추출물, MeOH 추출물, hexane, 85% aq.
- 05 mg/mL에서는 85% aq. MeOH 분획물에 의한 항산화 효과가 우수하였음을 살펴 볼 수가 있었다. 그러나 water 분획물에 의한 항산화 효과는 미미하였다.
- 분획물들 중 hexane 분획물은 암세포 증식 억제에 효과적이었으며 85% aq. MeOH 분획물은 우수한 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다.
- [Table 5]는 붉은 양파 추출물들의 hexane, 85% aq. MeOH, BuOH, water 분획물을 농도별로 처리한 결과로 앞서 HT-1080 세포에 대한 결과와 유사하게 water 분획물을 제외하고 5 mg/mL 이상의 농도에서는 88% 이상의 억제효과를 보였다. 분획물들 중 특히 hexane 및 85% aq.
- MeOH, butanol (BuOH), water로 다시 추출하여 얻어진 각 분획물들을 농도별로 HT-1080 세포에 처리했을 때 [Table 3], 첨가농도 5 mg/mL의 농도에서 붉은 양파 분획물들 중 water 분획물을 제외하고 86% 이상의 암세포 증식 억제효과를 나타내었고(p<0.05), 이들 분획물들 중 특히 hexane 분획물이 IC50 농도가 0.19 mg/mL로 가장 높은 활성을 나타내었다.
- 16 mg/mL이었다. 따라서 본 연구 결과로부터 인체 섬유육종세포(HT-1080)와 인체 결장암세포(HT-29)에 대한 암세포 증식 억제 효과는 붉은 양파의 A+M 추출물이 같은 농도의 MeOH 추출물에 비해 우수하였다. 분획물들의 경우에는 water 분획물을 제외한 분획물들의 암세포 억제 효과가 높았고 모든 분획물들에서 HT-1080 세포보다 HT-29 세포 증식 억제에 더 효과적이었다.
- HT-29 세포에 대한 결과는 HT-1080 세포와 유사하게 붉은 양파 A+M 추출물은 MeOH 추출물보다 높은 증식 억제 효과를 나타내었다. 또한 분획물들도 앞서 HT-1080 암세포에 대한 결과와 유사하게 water 분획물을 제외하고 5 mg/mL 이상의 농도에서는 88% 이상의 억제효과를 보였다. 분획물들 중 hexane 및 85% aq.
- 양파의 총페놀 및 플라보노이드 함량은 산지와 품종에 따라 상당한 차이가 있는 것으로 사료되며 지금까지 붉은 양파를 저온 진공 건조법을 이용하여 건조한 후 이것의 생리활성에 관해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서 사용된 저온 진공 건조 기술은 건조과정 중 산소가 거의 차단되어 건조과정 중에 일어날 수 있는 부패와 변질을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 열풍건조기에 비하여 건조시간도 비교적 짧은 장점이 있다. 또한 재료의 수분함유량의 조절이 간편하며 재료의 건조온도가 비교적 낮아 재료의 열에 의한 변성이 적고 에너지 비용 절약이라는 측면에서도 열풍건조 및 동결건조와 비교했을 때 결과적으로 생산단가를 1/3~1/4 정도로 낮출 수 있으며, 건조 품질의 향상과 다양한 응용식품의 개발이 가능하다(Kim 1999; Kim 등 2000).
- 따라서 본 연구 결과로부터 인체 섬유육종세포(HT-1080)와 인체 결장암세포(HT-29)에 대한 암세포 증식 억제 효과는 붉은 양파의 A+M 추출물이 같은 농도의 MeOH 추출물에 비해 우수하였다. 분획물들의 경우에는 water 분획물을 제외한 분획물들의 암세포 억제 효과가 높았고 모든 분획물들에서 HT-1080 세포보다 HT-29 세포 증식 억제에 더 효과적이었다. 이상의 암세포주들 이외에 Rho & Han (2000)은 폐암세포주인 NCI-H522와 NCI-H596에 대한 양파의 메탄올 추출물의 세포독성을 검토한 결과 양파 메탄올 추출물은 NCI-H522의 경우 48%, NCI-H596에서 25% 로 NCI-H596에서 더 높은 세포독성을 보였다고 보고하였고, Lee 등(2000)은 양파추출물을 암을 유발한 mouse에 처리한 결과 피부암의 경우 20 mg 처리구에서 55%, 위장암의 경우 25 및 50 mg 처리구에서 각각 32 및 34%의 종양억제효과가 있었다고 보고하였다.
- 붉은 양파의 일반성분을 생것과 비교했을 때 저온 진공 건조된 붉은 양파 분말의 수분함량은 17.95%로 생 붉은 양파의 수분함량과 비교했을 때 80% 정도 감소되었다[Table 1]. 수분함량의 감소에 따라 건조 붉은 양파 분말의 탄수화물, 조단백질, 조지방 및 조회분의 경우 각각 62.
- 그러나 water 분획물에 의한 항산화 효과는 미미하였다. 이상의 결과로부터 붉은 양파의 A+M 추출물, MeOH 추출물 및 그 분획물들이 세포 내 활성산소종의 생성을 감소시키므로 우수한 항산화 활성이 있음을 확인하였다. 붉은 양파와 흰색 및 노란색 양파의 항산화력을 비교한 연구에서 Shon & Park(2006)은 흰색, 노란색 및 붉은 양파의 총 페놀 함량을 측정한 결과 붉은 양파의 총 페놀 함량이 높았으며 붉은 양파가 가지는 항산화 효과는 페놀의 함량과 관련이 있을 것으로 보고하였다.
- 양파는 높은 수분함량으로 비교적 저장성이 낮아 선행된 연구(Jang 등 2008)에서는 양파의 저장성을 높이기 위해 여러 가지 건조법을 이용한 후 생리기능성을 살펴보았다. 저온 진공 건조 방법에 의해 건조된 양파추출물에 의한 인체 암세포 증식 및 세포 내 활성산소종 생성 억제 효과는 동결건조에 의해 건조된 양파 추출물보다 더 높게 나타났다. 한편, 웰빙 식문화의 발달로 진한 색을 가진 식물성 식품은 일반 식품에 비해 피토케미컬을 많이 함유한 것으로 인식되고 있다.
- 저온 진공 건조방법에 의해 건조된 붉은 양파 분말의 A+M 추출물 및 MeOH 추출물과 각 분획물들을 0.01 및 0.05 mg/mL의 농도로 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리하였을 때 활성산소종의 생성을 크게 억제시켰다. [Figure 1]은 저온 진공 건조법에 의한 붉은 양파 A+M 추출물과 MeOH 추출물의 억제 효과를 나타낸 것으로 500 μM H2O2만을 처리한 control군보다 활성산소종 농도가 낮았고 농도 의존적으로 측정 시간 120분 동안 높은 활성산소종 생성 억제 능력을 나타내었다.
- 본 연구에서는 저온 진공 건조장치를 이용하여 붉은 양파를 건조한 후 비타민 C를 포함한 일반성분 및 총 페놀성분을 측정하였고 유기 용매로 추출하여 인체 섬유육종세포 (HT-1080) 및 결장암세포(HT-29)에 대한 증식 억제효과와 세포 내 활성산소종 억제 효과에 대해 검토하였다. 저온 진공 건조방법으로 건조된 붉은 양파 분말은 생것과 비교했을 때 수분의 경우 80%가 감소하였고 높은 비타민 C와 총 페놀함량을 확인하였다. HT-1080 세포의 경우, 붉은 양파 분말의 A+M 추출물 및 MeOH 추출물의 IC50 농도는 각각 0.
- 저온 진공 건조방법으로 건조된 붉은 양파 분말의 A+M 추출물은 낮은 농도인 0.25 mg/mL에서부터 농도 의존적으로 HT-1080 세포의 성장을 억제시켜 2.5 mg/mL 첨가농도에서 96%의 증식 억제효과를 보였고, 5 mg/mL 첨가농도에서는 98%로 높은 억제효과를 보였다 (p<0.05).
- 비타민 C 함량의 경우, 생 붉은 양파는 15 mg/100 g을 나타내었고 건조 붉은 양파 분말은 96 mg/100 g을 나타내었다. 총 페놀 함량은 건조 붉은 양파 분말에서 생것의 함량(34.29 mg/mL)보다 약간 높은 39.05 mg/mL 함량을 나타내었다.
- 특히 2.5 및 5 mg/mL 첨가농도에서 붉은 양파 A+M 추출물이 각각 91 및 97%의 높은 저해 효과를 보였고(p<0.05), IC50 농도는 0.02 mg/mL였다.
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