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제안 방법
- Agarose Gel Electrophoresis − 1.0% agarose gel powder(Cambrex Bio Science, Rockland, ME) 를 1× TBE buffer(45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA)에 녹이고 틀에 부어agarose gel을 만들었다.
- Agarose Gel Electrophoresis − 각 시료에 대하여 함량에 대한 정성적인 결과를 얻기 위하여 agarose gel을 이용한 전기영동을 수행하였다.
- Heparinase I 으로 헤파린을 분해하여 제거한 후 Chondroitinase를 사용하여 성분분석 − NMR을 통하여 헤파린의 이당과 올리고당이 거의 제거된 것을 확인한 시료를 동결 건조하여 chondroitinase로 분해시킨 후 콘드로이틴황산의 함유 여부를 SAX-HPLC로 확인 하였다 (Fig. 8).
- Heparinase I과 Chondroitinase ABC에 의한 분해후 시간 별 흡광도 측정 − 표준품과 시료에 대해 heparinase I를 처리하여 37℃에서 반응시키면서 시간을 정하여 흡광도값을 측정하였다 (Fig. 2) 20시간 반응 시킨 후 흡광도가 더 이상 올라가지 않는 것을 확인한 후 완전 반응이 일어난 것으로 판단하고 SAX-HPLC로 분석하였다 (Fig. 3).
- 헤파린 시료내의 혼합물 분리 − 3일 동안 투석한 후 SAXHPLC로 확인한 결과 헤파린 이당과 올리고당이 많이 제거되지 않아 시료를 동결건조 하여 10 K MWCO microcon으로 여과 후 증류수를 가하여 투석을 반복하였고 최종적으로 SAX-HPC,로 확인한 결과 이당과 올리고당이 대부분 제거 된 것으로 보고 시료를 동결 건조하여 NMR로 분석하였다. NMR로 분석 한 결과 헤파린의 이당과 올리고당이 완전히 제거되지 않아서 microcon의 MWCO 크기가 더 큰 것을 사용하여 추가실험을 했다. 시료는 1차 실험과 같은 것을 사용하였고 헤파린 외에 어떤 성분이 함유되어 있는지 확인하기 위하여 2차 실험에서는 heparinase I 으로 시료를 완전 분해한 후 일차적으로 12~14 K 투석 막으로 3일간 투석하여 동결건조 했다.
- NZP 콘드로이틴황산과 시료를 100 µg 되도록 SAX-HPLC에 주입하였고 27분간 분석하였다 (Fig. 5).
- 0) 에 녹여서 1U/ml 되게 했다. NZP 콘드로이틴황산을 표준품으로 사용하여 표준품과 시료를 50 mg/ml로 녹여서 buffer와 섞어 효소를 30 mU 넣어 37.5℃에서 생성되는 이당류의 비환원당의 이중 결합을 이용하여 232 nm에서 흡광도 증가가 없을 때까지 12시간 이상 분해시켜 콘드로이틴황산의 함유량을 분석하였다. 반응확인은 초기 반응을 알아보기 위하여 UV분광기를 사용하여 232 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였고 최종 완전 분해된 생성물을 분석하기 위하여 SAX-HPLC에서 NaCl 0M~2M (pH 3.
- 그렇지만, 상대적으로 가격이 저렴한 OSCS (헤파린 가격의10 % 미만)가 헤파린과 비슷한 분자량 (18 kDa)과 전하밀도 (charge density)를 가지므로6) 인위적으로 혼입되었을 가능성을 배제할 수는 없다. OSCS는 chondroitininase ABC에 의해 분해가 되지 않으며3) 이점을 착안하여 6종의 헤파린시료에 대해서 분석하였다. 헤파린 분해효소 (heparinase)와 콘드로이틴황산 분해효소 (chondroitinase) 처리 후 생성되는 이당과 올리고당을 제거하면, 이 효소에 의해 분해되지 않는 OSCS가 남게 되고, 이를 1H-NMR의 chemical shift 값을 이용하여 헤파린의 순도를 규명하고자 하였다.
- Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)를 이용한 시료의 분석 − PAGE는 논문에 발표된 방법을 참조8)하여 15% running gel (0.1 M boric acid, 0.1 M Tris, 0.01M EDTA2Na, pH 8.3,)과 5%의 stacking gel (1 M HCl로 보정하여 pH 6.3으로 만듦) 조성비로 만든 polyacrylamide gel을 이용하여.
- SAX-HPLC는 각 시료를 100 µg 되도록 기계에 주입하여 232 nm에서 distilled water (pH 3.5)와 2.0 M NaCl (pH 3.5)를 step gradient로 하여 분석하였다.
- 글리코사미노글리칸 분해효소에 의한 헤파린 시료의 분해 − 헤파린의 함유량을 알아보기 위해 NZP 헤파린을 표준품으로 사용하여 표준품과 시료를 50 mg/ml 되도록 멸균한 증류수에 녹여 250 mM NaCl in 50 mM phosphate buffer(pH 7.0)와 섞어 최종농도 1 mg이 되게 넣고 유전자재조합 Bacteroids에서 유래한 heparinase I을 10 µl씩 넣어서 37℃에서 완전분해 시키기 위해 232 nm에서 흡광도 증가가 없을 때까지 12시간 이상 반응시켰다.
- 더마탄황산의 분석 − 일부 시료의 더마탄황산 (콘드로이틴황산 B)의 존재 유무를 위와 같은 방법으로 chondroitinaseABC, chondroitinase AC로 처리하여 더마탄황산을 확인하였다.
- 특히, S2와 S4의 흡광도가 S1 및 S5, 대조군 헤파린에 비해 두드러지게 낮은 것은 일부 헤파린 시료들이 다른 종류의 glycosaminoglycan 류와 섞여 있음을 강하게 제시하고 있다. 또한 표준품과 시료에 대해 chondroitinase ABC 를 처리하여 37.5℃에서 반응시키면서 시간을 정하여 흡광도 값을 측정하였다 (Fig. 4) 20 시간 반응 시킨 후 흡광도가 더 이상 올라가지 않는 것을 확인한 후 완전 반응 되었다고 판단하여 SAX-HPLC로 분석하였다. 시료 S3의 경우 chondroitinase ABC를 처리하였을 때 흡광도가 증가하는 점은 헤파린 시료 내에 콘드로이틴황산이 존재하고 있음을 제시하고 있다.
- 측정한 시료를 모아서 완전 분해시키기 위해 37℃에서 반응 시킨 후 초기 반응 속도가 빠르기 때문에 흡광도를 희석하여 완전분해가 일어나도록 반응시간을 연장하여 더 이상의 흡광도 증가가 없음을 확인하였다(결과 미제시). 반응시료에 대하여 SAX-HPLC로 분석하였다 (Fig. 4). Chondroitinase ABC로 여섯 종류의 시료와 NZP 콘드로이틴황산을 분해시켰을 때 NZP 콘드로이틴황산과 달리 여섯 종류 시료에서 흡광도가 급격하게 증가하지 않는 것으로 보아 시료 내의 콘드로이틴황산의 함유량은 높지 않음을 알 수 있었다.
- 5℃에서 생성되는 이당류의 비환원당의 이중 결합을 이용하여 232 nm에서 흡광도 증가가 없을 때까지 12시간 이상 분해시켜 콘드로이틴황산의 함유량을 분석하였다. 반응확인은 초기 반응을 알아보기 위하여 UV분광기를 사용하여 232 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였고 최종 완전 분해된 생성물을 분석하기 위하여 SAX-HPLC에서 NaCl 0M~2M (pH 3.5) 기울기 용리로 AKTA Purifier(Amersham Pharmacia)에 연결하여 유속은 1 ml/min로 유지하면서 UV 232 nm에서 검출하였다.
- NMR로 분석 한 결과 헤파린의 이당과 올리고당이 완전히 제거되지 않아서 microcon의 MWCO 크기가 더 큰 것을 사용하여 추가실험을 했다. 시료는 1차 실험과 같은 것을 사용하였고 헤파린 외에 어떤 성분이 함유되어 있는지 확인하기 위하여 2차 실험에서는 heparinase I 으로 시료를 완전 분해한 후 일차적으로 12~14 K 투석 막으로 3일간 투석하여 동결건조 했다. 얻어진 시료 cellulose 50 K MWCOmicrocon filter에 넣은 후 13,000 rpm 으로 10분 간 원심분리한 후 남아 있는 상등액에 증류수를 추가하여 반복실험해서 헤파린의 이당과 올리고당을 제거했다.
- 시료를 각각 well에 20 µl 씩 loading하고 power supply에 연결하여 100 V에서 40분간 전기영동을 하였다.
- 얻어진 시료 cellulose 50 K MWCOmicrocon filter에 넣은 후 13,000 rpm 으로 10분 간 원심분리한 후 남아 있는 상등액에 증류수를 추가하여 반복실험해서 헤파린의 이당과 올리고당을 제거했다. 실험 중간에 시료 내에 이당과 올리고당이 어느 정도 제거 되었는지 확인하기 위하여 SAX-HPLC로 분석하였고 최종 시료를 동결건조 한 후 NMR로 분석하여 헤파린 이외에 어떤 물질이 포함되어 있는지 알아보았다. 이 때 처리한 시료는 혼합물이 섞였다고 판단한 I: S2, II: S3, III: S4, IV: S5 4종류이었다.
- 얻어진 시료를 cellulose 10 K molecular weight cut-off(MWCO) microcon filter에 넣은 후 13,000 rpm 으로 10분간 원심분리 한 후 남아있는 상등액에 증류수를 첨가하여 원심분리를 반복하여 헤파린의 이당 (dimer)과 올리고당(oligomer)을 제거했다. 실험 중간에 시료 내에 이당과 올리고당이 어느 정도 제거 되었는지 확인하기 위하여 SAXHPLC로 분석하였다. SAX-HPLC는 각 시료를 100 µg 되도록 기계에 주입하여 232 nm에서 distilled water (pH 3.
- 헤파린 분해효소 (heparinase)와 콘드로이틴황산 분해효소 (chondroitinase) 처리 후 생성되는 이당과 올리고당을 제거하면, 이 효소에 의해 분해되지 않는 OSCS가 남게 되고, 이를 1H-NMR의 chemical shift 값을 이용하여 헤파린의 순도를 규명하고자 하였다. 이 연구에서는 glycosaminoglycan 분해효소 및 1H-NMR 이외에도 polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 이용하여 헤파린의 순도를 확인하였다.
- 05 ppm)의 위치에서 나타나는 것이 헤파린에서 기인된 것이다. 이물질의 제거의 확인을 위해 NMR로 완전히 헤파린이 제거가 안되었음을 확인한 후 재차 분자량에 따른 여과 후 헤파린 올리고당의 제거를 하였다 (결과 미제시). 다시 NMR을 이용하여 분석 시 거의 이물질만 남아 있음 (2.
- 5)를 step gradient로 하여 분석하였다. 최종 시료를 동결건조 한 후 500 MHz NMR로 분석하여 헤파린 이외에 어떤 물질이 포함되어 있는지 확인하였다.
- 여섯 종류의 시료를 비교해볼 때, 시료 S3가 다른 시료들에 비해 같은 시간 내 (300초)에 흡광도 증가가 더 큰 것을 관찰할 수 있었으며, 다른 시료에 비해 S3에 콘드로이틴황산의 함유량이 많음을 알 수 있었다. 측정한 시료를 모아서 완전 분해시키기 위해 37.5℃에서 반응 시킨 후 SAX-HPLC로 분석하였다 (Fig.5)
- 0) 에 녹여서 1 U/ml 되게 해서chondroitinase ABC와 마찬가지로 같은 조건에서 반응시켰다. 콘드로이틴황산 이당 표준품으로는 Seikagaku 제품을 사용하였고 SAX-HPLC로 위와 같은 조건에서 분석하였다. Fig.
- OSCS는 chondroitininase ABC에 의해 분해가 되지 않으며3) 이점을 착안하여 6종의 헤파린시료에 대해서 분석하였다. 헤파린 분해효소 (heparinase)와 콘드로이틴황산 분해효소 (chondroitinase) 처리 후 생성되는 이당과 올리고당을 제거하면, 이 효소에 의해 분해되지 않는 OSCS가 남게 되고, 이를 1H-NMR의 chemical shift 값을 이용하여 헤파린의 순도를 규명하고자 하였다. 이 연구에서는 glycosaminoglycan 분해효소 및 1H-NMR 이외에도 polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 이용하여 헤파린의 순도를 확인하였다.
- 헤파린을 제외한 콘드로이틴황산 및 기타 물질 분석 − 위의 결과를 바탕으로 S2, S3, S4와 대조군으로 S5을 실험에 사용하였다. 헤파린 외에 어떤 성분이 함유되어있는지 확인하기 위하여 1차 실험에서는 heparinase I 으로 시료를 완전분해한 후 일차적으로 12~14 K 투석막을 이용하여 3일간 12시간 마다 증류수를 바꿔주며 투석하여 동결건조 하였다. 얻어진 시료를 cellulose 10 K molecular weight cut-off(MWCO) microcon filter에 넣은 후 13,000 rpm 으로 10분간 원심분리 한 후 남아있는 상등액에 증류수를 첨가하여 원심분리를 반복하여 헤파린의 이당 (dimer)과 올리고당(oligomer)을 제거했다.
- 8). 효소는 3가지를 사용하였는데 chondroitinase ABC, chondroitinase AC, chondroitinase B를 사용하여 분해시킨 후 어떤 종류의 콘드로이틴황산이 함유되어 있는지 확인하였다.
대상 데이터
- Chondroitinase ABC (Proteus vulgaris)와 콘드로이틴황산 B(porcine intestinal mucosa)는 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, chondroitinase AC (Flavobacterium heparinum), chondroitinase B (Flavobacterium heparinum), 콘드로이틴황산 C (shark cartilage), 콘드로이틴황산 이당 표준품 (∆UA-[1→3]-GalNAc), ∆UA-[1→3]-GalNAc6S), ∆UA-[1→3]-GalNAc4S)은 Seikagaku (Tokyo, Japan)에서 구입해서 사용하였다.
- 실험재료 − 실험용 헤파린 시료 6가지는 모두 식품의약품안정청에서 제공을 받았고 (S1, S2, S3, S4, S5, S6) 양성대 조군으로 사용한 헤파린 (189 IU/mg)과 콘드로이틴황산은뉴질랜드제약회사 제품 (New Zealand Pharmaceuticals, Palmerston North, New Zealand)을 사용하였다.
- 콘드로이틴황산 A (bovine trachea)는Calbiochem (San Diego, CA)에서 구입하였다. 유전자재조합 heparinase I (Bacteroids thetaiotaomicron)은 Genbank로부터 유전자를 클로닝하여 발현시켜서 정제한 것을 사용하였다7). 효소의 활성은 1분간 헤파린 이당류의 생성을 1 unit로 정의할 때 8.
- Louis, MO)에서 구입하였으며, chondroitinase AC (Flavobacterium heparinum), chondroitinase B (Flavobacterium heparinum), 콘드로이틴황산 C (shark cartilage), 콘드로이틴황산 이당 표준품 (∆UA-[1→3]-GalNAc), ∆UA-[1→3]-GalNAc6S), ∆UA-[1→3]-GalNAc4S)은 Seikagaku (Tokyo, Japan)에서 구입해서 사용하였다. 콘드로이틴황산 A (bovine trachea)는Calbiochem (San Diego, CA)에서 구입하였다. 유전자재조합 heparinase I (Bacteroids thetaiotaomicron)은 Genbank로부터 유전자를 클로닝하여 발현시켜서 정제한 것을 사용하였다7).
- 헤파린을 제외한 콘드로이틴황산 및 기타 물질 분석 − 위의 결과를 바탕으로 S2, S3, S4와 대조군으로 S5을 실험에 사용하였다.
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