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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 건강 기능성식품 원료로 가능성이 잠재되어 있는 한약재 중 산사를 알코올 발효, 초산 발효 2단계로 구분하여 제조한 산사발효초의 일반성분을 분석하고, 고지방 식이로 비만을 유도한 흰쥐의 체중 조절, 혈청 및 간의 지질 함량, 분변의 지방산 변화에 미치는 영향을 관찰하고, 이러한 결과를 바탕으로 산사발효초의 체중 조절 및 지질대사 개선 효과를 검증하고자 하였다.
- 본 연구에서는 산사 발효초가 고지방식이를 급여한 흰쥐의 지질대사에 미치는 영향에 대해 살펴보았다. 흰쥐에게 고지방식이(40% kcal% fat, beef tallow)를 급여하면서 산사 발효초를 저농도(1.
- 본 연구에서는 심혈관계 질환, 고지혈증 등의 여러 질환들에 효능이 있는 산사를 건강 기능성식품으로 개발하고자 2단계 발효 과정을 통해 발효초로 제조하였다. 제조한 산사발효초의 일반성분을 확인한 후, 고지방 식이를 섭취한 흰쥐에 산사발효초를 급여하여 체내 지질대사 개선 효과를 관찰하고자 하였다.
- 본 연구에서는 심혈관계 질환, 고지혈증 등의 여러 질환들에 효능이 있는 산사를 건강 기능성식품으로 개발하고자 2단계 발효 과정을 통해 발효초로 제조하였다. 제조한 산사발효초의 일반성분을 확인한 후, 고지방 식이를 섭취한 흰쥐에 산사발효초를 급여하여 체내 지질대사 개선 효과를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
- 1 N NaOH로 적정한 후 acetic acid 함량(%)으로 환산하였다. 당의 함량은 Abbe 굴절당도계(NOW, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 수분, 조지방, 무기질은 식품공전 시험법(21), 조단백질은 Semi-micro kjeldahl법(21), 조회분은 AOAC법(22)에 준하였으며, 식이섬유는 Prosky법(23)에 의해 수용성 식이섬유와 불용성 식이섬유 함량을 분석하여 총 식이섬유 함량을 구하였다.
- 분리한 혈청의 total protein, albumin, aspatate transaminase(AST), alanine transaminase(ALT), alkaline phosphatase(ALP)의 농도는 각각의 kit(Asan Pharm.)를 이용하여 측정하였다.
- 산사를 waring blender로 마쇄한 후 살균 및 갈변 방지를 위하여 K2S2O5(Sigma, St. Louis, USA)를 100 ppm 농도로 첨가하였다. 설탕으로 24%가 되게 보당한 후 1일간 방치하고, YM broth(Table 1)에서 배양시킨 주모액 5%를 접종하여 27℃에서 10일간 발효시켰다(16)
- 산사발효초의 pH 측정은 pH meter(Beckman, Fullerton, USA)를 이용하여 측정하였고, 총산도는 시료 10 mL을 bromthymol blue와 neutral red 혼합지시약을 첨가하여 0.1 N NaOH로 적정한 후 acetic acid 함량(%)으로 환산하였다. 당의 함량은 Abbe 굴절당도계(NOW, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 체중은 1주일에 두 번씩 일정한 시간에 측정하였고, 식이섭취량은 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다. 식이효율은 실험 전 기간의 체중증가량을 같은 기간 동안의 섭취한 식이량으로 나누어 줌으로써 계산하였다. 실험동물은 stainless wire cage에서 한마리씩 분리하여 사육하였고 사육실의 온도는 22±2 ℃, 습도는 50±5%이었다.
- 실험동물은 생후 5주령 Sprague-Dawley 종 수컷 흰쥐를 (주)샘타코에서 구입하였고, 1주일간 적응시킨 후, 난괴법에 의해 8마리씩 4군으로 나누어 실험에 사용하였고 실험식이의 조성은 Table 3과 같다. 실험군은 정상식이군, 고지방식이대조군(40% kcal% fat, beef tallow), 1.5% 및 3.0% 산사발효초군(고지방식이에 산사발효초를 1.5% 및 3.0%씩 첨가한군) 등 4군으로 나누어 해당 식이로 6주간 사육하였다. 체중은 1주일에 두 번씩 일정한 시간에 측정하였고, 식이섭취량은 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
- 을 YPM medium(Table 2)에 접종하여 30℃, 72시간 정치 배양하여 종초로 사용하였다. 알코올 발효가 된 발효액을 면 거즈로 여과한 여과액에 종초 5%를 접종하였다. 30℃에서 4일간 발효시킨 후, 여과지(Whatman No.
- 실험동물은 12시간 절식시킨 후 ethyl ether로 마취하고 단두하여 채혈하여 실온에서 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분석 시료로 사용하였다. 채혈 후 즉시 장기를 적출하여 생리식염수로 세척한 다음여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다. 분변의 수집은 실험종료 전 일주일간 모아서 건조기에서 건조하여 분석 시료로 사용하였다.
- 0%씩 첨가한군) 등 4군으로 나누어 해당 식이로 6주간 사육하였다. 체중은 1주일에 두 번씩 일정한 시간에 측정하였고, 식이섭취량은 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다. 식이효율은 실험 전 기간의 체중증가량을 같은 기간 동안의 섭취한 식이량으로 나누어 줌으로써 계산하였다.
- 본 연구에서는 산사 발효초가 고지방식이를 급여한 흰쥐의 지질대사에 미치는 영향에 대해 살펴보았다. 흰쥐에게 고지방식이(40% kcal% fat, beef tallow)를 급여하면서 산사 발효초를 저농도(1.5% wt/wt, n=8), 고농도(3.0% wt/wt, n=8)로 투여하였을 때, 정상식이군(n=8)과 고지방식이 대조군(n=8)과의 체중, 장기무게, 지질 함량 등의 차이를 관찰하였다. 체중은 산사발효초군이 정상식이군보다 유의적으로 증가하였지만, 고지방식이 대조군보다 유의적으로 각각 7.
대상 데이터
- 산사의 알콜 발효에 사용한 효모는 Saccharomyces cerevisiae(KTCT 7246)를 사용하였으며, 초산균은 Acetobacter sp.(KTCT 2806)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 산사(山査)는 전라북도 장수에서 수확한 국내산 산사를 장수제약에서 구입하여 흐르는 물에 세척하고 음건시킨 후 사용하였다.
- 실험동물은 12시간 절식시킨 후 ethyl ether로 마취하고 단두하여 채혈하여 실온에서 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분석 시료로 사용하였다. 채혈 후 즉시 장기를 적출하여 생리식염수로 세척한 다음여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
- 실험동물은 stainless wire cage에서 한마리씩 분리하여 사육하였고 사육실의 온도는 22±2 ℃, 습도는 50±5%이었다.
- 실험동물은 생후 5주령 Sprague-Dawley 종 수컷 흰쥐를 (주)샘타코에서 구입하였고, 1주일간 적응시킨 후, 난괴법에 의해 8마리씩 4군으로 나누어 실험에 사용하였고 실험식이의 조성은 Table 3과 같다. 실험군은 정상식이군, 고지방식이대조군(40% kcal% fat, beef tallow), 1.
데이터처리
- Values with different superscripts are significantly different by ANOVA with Duncan's multiple range test at p<0.05.
- 본 실험 결과는 SPSS package program 15.0을 이용하여 평균치와 표준오차를 구하였으며 각 군 간의 유의성은 oneway ANOVA 분석 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple comparison test로 검증하였다.
이론/모형
- , Seoul, Korea)를 사용하여 각각 550, 500 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. HDL-cholesterol은 2% dextrin sulfate와 1 M MgCl2 침전액(1:1)을 가해서 상층액을 시료로 표준효소비색법의 의한 kit(Asan Pharm.)를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. LDL-cholesterol은 Friedewald 식에 의하여 산출하였고(24), 심혈관 질환의 유병율과 관련이 있는 동맥경화지수(atherogenic index, AI)를 산출하였다(25).
- )를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. LDL-cholesterol은 Friedewald 식에 의하여 산출하였고(24), 심혈관 질환의 유병율과 관련이 있는 동맥경화지수(atherogenic index, AI)를 산출하였다(25). 간의 지질 함량은 Folch 등의 방법(26)에 의해 추출하여 중성지방, 총콜레스테롤 kit를 이용하여 측정하였다.
- LDL-cholesterol은 Friedewald 식에 의하여 산출하였고(24), 심혈관 질환의 유병율과 관련이 있는 동맥경화지수(atherogenic index, AI)를 산출하였다(25). 간의 지질 함량은 Folch 등의 방법(26)에 의해 추출하여 중성지방, 총콜레스테롤 kit를 이용하여 측정하였다.
- 당의 함량은 Abbe 굴절당도계(NOW, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 수분, 조지방, 무기질은 식품공전 시험법(21), 조단백질은 Semi-micro kjeldahl법(21), 조회분은 AOAC법(22)에 준하였으며, 식이섬유는 Prosky법(23)에 의해 수용성 식이섬유와 불용성 식이섬유 함량을 분석하여 총 식이섬유 함량을 구하였다.
- 지방산은 Folch 등의 방법(26)에 따라 분변의 지질을 추출한 후 BF3/MeOH로 메틸에스테르화시켜 GC(4890 series, Hewlett-Packard, Palo Alto, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 혈청의 중성지방(tryglyceride, TG)과 총콜레스테롤(total cholesterol, TC)은 표준 효소비색법에 의한 kit(Asan Pharm., Seoul, Korea)를 사용하여 각각 550, 500 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. HDL-cholesterol은 2% dextrin sulfate와 1 M MgCl2 침전액(1:1)을 가해서 상층액을 시료로 표준효소비색법의 의한 kit(Asan Pharm.
성능/효과
- 2단계 발효를 통해 제조된 산사발효초의 pH는 3.82, 총 산도는 5.14%, 당의 함량은 6.46oBrix이었다. 그러나 시판중인 산사발효초가 없어 직접 비교는 할 수 없었지만 과실을 이용한 과실식초 연구들의 pH, 총산도, 당의 함량 결과에 비하면 비슷한 수치를 나타내었다(14,16)
- CFL군과 CFH군의 total protein과 albumin 농도는 ND 군보다 유의적으로 낮았지만 HD군보다 유의적으로 높았다. AST와 ALT에서 CFL군과 CFH군은 ND군과 유의적 차이를 보이지 않았지만 HD군보다 유의적으로 낮았으며, ALP 에서 CFH군이 HD군보다 유의적으로 낮게 나타났다.
- 혈청의 대사 지표 물질들의 농도는 Table 6에 나타내었다. CFL군과 CFH군의 total protein과 albumin 농도는 ND 군보다 유의적으로 낮았지만 HD군보다 유의적으로 높았다. AST와 ALT에서 CFL군과 CFH군은 ND군과 유의적 차이를 보이지 않았지만 HD군보다 유의적으로 낮았으며, ALP 에서 CFH군이 HD군보다 유의적으로 낮게 나타났다.
- 혈청의 중성지방과 총콜레스테롤의 함량은 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 높았으나 고농도 산사발효초군에서 정상식이군과 차이를 보이지 않았다. HDL-C 함량은 산사발효초군이 고지방식이 대조군보다 유의적으로 높았으며, 동맥경화 발병 빈도와 양의 상관관계를 보이는(33) LDL-C 함량은 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 현저하게 높았지만 산사발효초군은 고지방식이대조군에 비해 각각 2.8배, 3.5배 감소 하여 동맥경화에 효과적임을 알 수 있었다. Jung 등(34)의 감식초가 혈중 총콜레스테롤, LDL-C 함량을 감소시키고, HDL-C 함량을 높여주는 결과와 유사하여 산사발효초도 혈중 지질대사 개선에 도움을 줄 것으로 사료되어진다.
- 2% 유의적으로 감소되었다. HDL-C은 CFL군과 CFH군이 HD군보다 각각 52.9%, 62.8% 유의적으로 높았고, LDL-C과 동맥경화지수는 유의적으로 낮았다. 간의 중성지방은 CFL군과 CFH군은 HD군에 비해 각각 54.
- 이는 고지방식이 섭취시 체내 에너지 균형의 조절이 무너져 체중이 증가하여 hyperleptinemic과 인슐린 저항이 생긴다는 보고와(31) 같이 고지방식이를 통해 비만 유도가 되었음을 확인할 수 있었으며, 산사발효초군의 체중 감소는 산사의 식이섬유와 quercetin과 같은 생리활성 물질들이 지질 흡수를 저해하여 체중감소를 유도한 것으로 여겨진다(32). 간 기능의 지표인 AST, ALT 결과에서 산사발효초군은 정상식이군과 유의적인 차이를 보이지 않았지만 고지방식이군과는 유의적 차이를 나타내어 산사발효초가 고지방식이로 인해 간 기능 저하를 개선시키며 부작용이 없음을 확인하였다. 혈청의 중성지방과 총콜레스테롤의 함량은 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 높았으나 고농도 산사발효초군에서 정상식이군과 차이를 보이지 않았다.
- 0% 감소하였다. 간과 신장 무게도 고지방식이 대조 군에 비해 산사발효초군들에서 유의적으로 감소하였다. 고농도 산사발효초군에서 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-C, 동맥경화지수 및 간의 중성지방, 총콜레스테롤 함량은 고지방식이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였지만 혈청 중 HDL-C 함량은 유의적으로 증가하였다.
- 8% 유의적으로 높았고, LDL-C과 동맥경화지수는 유의적으로 낮았다. 간의 중성지방은 CFL군과 CFH군은 HD군에 비해 각각 54.6%, 61.9% 유의적으로 감소하였다. 총콜레스테롤은 HD군이 ND군보다 유의적으로 높게 나타나 고지방식이로 비만 유도가 진행되었음을 알 수 있었고 Wursch 연구 결과(28)와 유사하였고 CFL군과 CFH군은 HD군보다 유의적으로 각각 26.
- 분변 중 포화지방산 함량은 고농도 산사발효초군에 비해 정상식이 군이나 고지방식이대조군에서 유의적으로 높았다. 결론적으로 산사발효초는 체중을 감소시키며 혈청이나 간의 지질 함량을 개선시키고, 포화지방산 배설을 증가시키므로 체중 조절 및 지질대사 개선 효과가 규명되었다.
- 간과 신장 무게도 고지방식이 대조 군에 비해 산사발효초군들에서 유의적으로 감소하였다. 고농도 산사발효초군에서 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-C, 동맥경화지수 및 간의 중성지방, 총콜레스테롤 함량은 고지방식이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였지만 혈청 중 HDL-C 함량은 유의적으로 증가하였다. 분변 중 포화지방산 함량은 고농도 산사발효초군에 비해 정상식이 군이나 고지방식이대조군에서 유의적으로 높았다.
- 그러나 포화지방산(ΣSFA)은 CFH군이 ND군과 HD군보다 유의적으로 높았으며, n-6/ n-3 비율에서 CFH군은 유의적으로 ND군보다 낮았지만 HD군보다 높았다.
- 이는 한방에서 한약재의 생리활성 물질들을 열수 추출하여 사용하는데, 열수 추출보다 산사를 발효를 통해 일반성분이나 무기질 등의 손실을 최소화 시켜서 산사의 생리활성과 영양학적 효율을 증대시킬 수 있을 것으로 여겨진다. 동물실험 결과 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 체중 증가와 장기무게의 증가가 유의하게 나타났으며, 저농도와 고농도 산사발효초군에서 체중 증가와 장기무게가 고지방식이 대조 군에 비해 유의적으로 감소되었다. 이는 고지방식이 섭취시 체내 에너지 균형의 조절이 무너져 체중이 증가하여 hyperleptinemic과 인슐린 저항이 생긴다는 보고와(31) 같이 고지방식이를 통해 비만 유도가 되었음을 확인할 수 있었으며, 산사발효초군의 체중 감소는 산사의 식이섬유와 quercetin과 같은 생리활성 물질들이 지질 흡수를 저해하여 체중감소를 유도한 것으로 여겨진다(32).
- 고농도 산사발효초군에서 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-C, 동맥경화지수 및 간의 중성지방, 총콜레스테롤 함량은 고지방식이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였지만 혈청 중 HDL-C 함량은 유의적으로 증가하였다. 분변 중 포화지방산 함량은 고농도 산사발효초군에 비해 정상식이 군이나 고지방식이대조군에서 유의적으로 높았다. 결론적으로 산사발효초는 체중을 감소시키며 혈청이나 간의 지질 함량을 개선시키고, 포화지방산 배설을 증가시키므로 체중 조절 및 지질대사 개선 효과가 규명되었다.
- 산사발효초군 중 고농도인 CFH군의 체중변화, 혈청 및 간의 지질 농도 결과가 저농도인 CFL군보다 긍정적인 효과를 크므로 CFH군의 분변 지방산 조성을 Table 8에 나타내 었다. 분변의 지방산 함량은 linoleic acid는 ND군은 16.59%로 HD군과 CFH군보다 각각 13.88%, 12.83% 유의적으로 높았고, linolenic acid는 CFH군이 ND군과 HD군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. DHA에서도 CFH군은 HD군보다 낮았지만 유의적이지 않았다.
- 산사발효초와 산사자, 산사열수추출물의 일반성분을 비교하였을 때, 식이섬유 및 무기질 등의 함량이 산사자보다 낮았지만 산사열수추출물보다 높은 수치를 나타내었다. 발효 한약은 한약재를 저분자 구조로 분해하여 체내 흡수율과 생체 이용률 모두 증가시켜 한약재의 효과를 극대화시킬 수있는 것으로 알려져 있으며(29), Shon에 의하면 발효한 한약재에서 항산화, 항암 효과가 증가한다고 하였다(30).
- 0% 감소되었다. 식이섭취량은 고지방식이군들이 ND군보다 낮았으나 식이효율은 유의 적으로 높았다. 이는 식이지방이 공복감을 줄여 식이섭취량을 감소시키고, 열량 밀도가 높을수록 식이섭취량이 감소되기 때문이다(27).
- 1과 Table 5에 나타내었다. 실험식이 급여 전 실험군 간의 체중은 차이가 없었으나 급여 3주 후부터 정상식이군(ND)보다 고지방식이군들의 체중이 유의적으로 증가하기 시작하였으며, 실험 종료 시에는 저농도 산사발효초군(low doses of fermented Crataegi fructus vinegar, CFL) 및 고농도 산사발효초군(high doses of fermented Crataegi fructus vinegar, CFH)의 체중은 고지방식이대조군(HD)에 비해 유의적으로 각각 7.2%, 10.0% 감소되었다. 식이섭취량은 고지방식이군들이 ND군보다 낮았으나 식이효율은 유의 적으로 높았다.
- 0% wt/wt, n=8)로 투여하였을 때, 정상식이군(n=8)과 고지방식이 대조군(n=8)과의 체중, 장기무게, 지질 함량 등의 차이를 관찰하였다. 체중은 산사발효초군이 정상식이군보다 유의적으로 증가하였지만, 고지방식이 대조군보다 유의적으로 각각 7.2%, 10.0% 감소하였다. 간과 신장 무게도 고지방식이 대조 군에 비해 산사발효초군들에서 유의적으로 감소하였다.
- 53%이었다. 총 식이섬유소의 함량은 산사자는 5.60%(불용성 4.66%, 수용성 0.94%), 산사 열수추출물과 발효초는 각각 0.15%, 0.24%이었고 불용성 식이섬유는 함유되어 있지 않았다.
- 9% 유의적으로 감소하였다. 총콜레스테롤은 HD군이 ND군보다 유의적으로 높게 나타나 고지방식이로 비만 유도가 진행되었음을 알 수 있었고 Wursch 연구 결과(28)와 유사하였고 CFL군과 CFH군은 HD군보다 유의적으로 각각 26.5%, 35.5% 감소하였다.
- 혈청과 간의 지질 농도 변화는 Table 7에 나타내었다. 혈청의 중성지방은 HD군이 CFL군과 CFH군보다 각각 22.6%, 25.6% 유의적으로 높았으며, 총콜레스테롤은 CFH군에서 HD군보다 39.2% 유의적으로 감소되었다. HDL-C은 CFL군과 CFH군이 HD군보다 각각 52.
후속연구
- 결론적으로 고지방식이 급여로 증가된 체중, 장기무게를 감소시키고, 혈청 및 간의 지질 조성을 개선시키며, 포화지방산의 배설을 증가시킨 산사발효초는 고지방 식사로 인한 고지혈증, 고혈압 및 비만 같은 지질대사 이상을 개선시키는데 긍정적인 영향을 나타내므로 건강 기능성식품의 소재로써 이용될 가능성을 높다고 할 수 있겠다.
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