편육과 브로콜리싹에서 Salmonella spp. 검출을 위한 배지법과 Real-time PCR 및 신속 검사키트(VIDAS(R))의 비교검증 Evaluation of an Automated ELISA (VIDAS(R)) and Real-time PCR by Comparing with a Conventional Culture Method for the Detection of Salmonella spp. in Steamed Pork and Raw Broccoli Sprouts원문보기
본 연구에서는 편육과 브로콜리 싹에 Salmonella 농도를 단계별로 접종하고 배지법, $VIDAS^{(R)}$, real-time PCR의 양성 검출률을 비교함으로써 $VIDAS^{(R)}$, real-time PCR의 Salmonella 검출력을 검증하였으며, 또한 각 식품별로 검출률에 차이가 있는가를 알아보았다. 편육과 브로콜리 싹(500 g)에 3단계 농도(<15, 15-100, 100-1000 CFU/500 g)를 접종하고 20개 샘플로 나눈 후 배지법, $VIDAS^{(R)}$ Salmonella ($VIDAS^{(R)}$SLM), real-time PCR법을 시행하여 검출능력을 비교하였다. 편육에서 배지법, $VIDAS^{(R)}$, real-time PCR를 이용하여 Salmonella를 검출한 결과, 낮은 접종 농도(<15 CFU/500 g)에서도 Salmonella가 검출되었고 $VIDAS^{(가)}$O real-time PCR 모두 배지법과 통계학적 유의차가 나타나지 않았다. 반면에 브로콜리 싹을 이용하였을 때 낮은 접종 농도에서는 Salmonella가 검출되지 않았으며 $VIDAS^{(가)}$O real-time PCR 모두 배지법보다 더 많은 샘플을 검출하였다. 따라서 정상 세균총이 많은 야채 식품의 경우 배지법은 경쟁 세균에 의해 검출이 저해되므로 이보다 영향을 덜 받는 $VIDAS^{(R)}$법이나 real-time PCR법을 이용하여 검출하는 것이 더 효과적이라고 할 수 있겠다. 또한 이러한 신속 진단법을 이용하면 $VIDAS^{(R)}$는 3일, real-time PCR은 1일 이내에 배지법과 같거나 보다 높은 검출률로 Salmonella를 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
본 연구에서는 편육과 브로콜리 싹에 Salmonella 농도를 단계별로 접종하고 배지법, $VIDAS^{(R)}$, real-time PCR의 양성 검출률을 비교함으로써 $VIDAS^{(R)}$, real-time PCR의 Salmonella 검출력을 검증하였으며, 또한 각 식품별로 검출률에 차이가 있는가를 알아보았다. 편육과 브로콜리 싹(500 g)에 3단계 농도(<15, 15-100, 100-1000 CFU/500 g)를 접종하고 20개 샘플로 나눈 후 배지법, $VIDAS^{(R)}$ Salmonella ($VIDAS^{(R)}$ SLM), real-time PCR법을 시행하여 검출능력을 비교하였다. 편육에서 배지법, $VIDAS^{(R)}$, real-time PCR를 이용하여 Salmonella를 검출한 결과, 낮은 접종 농도(<15 CFU/500 g)에서도 Salmonella가 검출되었고 $VIDAS^{(가)}$O real-time PCR 모두 배지법과 통계학적 유의차가 나타나지 않았다. 반면에 브로콜리 싹을 이용하였을 때 낮은 접종 농도에서는 Salmonella가 검출되지 않았으며 $VIDAS^{(가)}$O real-time PCR 모두 배지법보다 더 많은 샘플을 검출하였다. 따라서 정상 세균총이 많은 야채 식품의 경우 배지법은 경쟁 세균에 의해 검출이 저해되므로 이보다 영향을 덜 받는 $VIDAS^{(R)}$법이나 real-time PCR법을 이용하여 검출하는 것이 더 효과적이라고 할 수 있겠다. 또한 이러한 신속 진단법을 이용하면 $VIDAS^{(R)}$는 3일, real-time PCR은 1일 이내에 배지법과 같거나 보다 높은 검출률로 Salmonella를 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
Salmonellosis is an important worldwide foodborne infectious disease that is transmitted by many food vehicles including raw and processed animal products and fresh produce. In this study, the effectiveness of automated ELISA ($VIDAS^{(R)}$) and realtime PCR in the detection of Salmonella...
Salmonellosis is an important worldwide foodborne infectious disease that is transmitted by many food vehicles including raw and processed animal products and fresh produce. In this study, the effectiveness of automated ELISA ($VIDAS^{(R)}$) and realtime PCR in the detection of Salmonella spp. in steamed pork and raw broccoli sprouts was evaluated by comparing their results with those of a conventional culture method. Bulk samples (500 g) of steamed pork and raw broccoli sprouts were inoculated with various levels of Salmonella and divided into 20 samples (25 g each). All the samples, including the controls, were analyzed using a conventional culture method, $VIDAS^{(R)}$, and real-time PCR to detect the presence of Salmonella. In addition, the levels of background flora in the steamed pork and the raw broccoli sprouts were determined. In the steamed pork that contained less than 100 CFU/g of aerobic bacteria, all three methods detected low levels of Salmonella without a statistical difference in their performance. In the broccoli sprouts with high quantities of background flora (ca. $6.7{\times}10^7$ CFU/g), however, all three methods were unable to detect low levels of Salmonella, and real-time PCR and $VIDAS^{(R)}$ more sensitively detected Salmonella than the culture method, with significant statistical differences. In conclusion, $VIDAS^{(R)}$ and real-time PCR could be superior to conventional culture methods in detecting Salmonella in food with high levels of background flora.
Salmonellosis is an important worldwide foodborne infectious disease that is transmitted by many food vehicles including raw and processed animal products and fresh produce. In this study, the effectiveness of automated ELISA ($VIDAS^{(R)}$) and realtime PCR in the detection of Salmonella spp. in steamed pork and raw broccoli sprouts was evaluated by comparing their results with those of a conventional culture method. Bulk samples (500 g) of steamed pork and raw broccoli sprouts were inoculated with various levels of Salmonella and divided into 20 samples (25 g each). All the samples, including the controls, were analyzed using a conventional culture method, $VIDAS^{(R)}$, and real-time PCR to detect the presence of Salmonella. In addition, the levels of background flora in the steamed pork and the raw broccoli sprouts were determined. In the steamed pork that contained less than 100 CFU/g of aerobic bacteria, all three methods detected low levels of Salmonella without a statistical difference in their performance. In the broccoli sprouts with high quantities of background flora (ca. $6.7{\times}10^7$ CFU/g), however, all three methods were unable to detect low levels of Salmonella, and real-time PCR and $VIDAS^{(R)}$ more sensitively detected Salmonella than the culture method, with significant statistical differences. In conclusion, $VIDAS^{(R)}$ and real-time PCR could be superior to conventional culture methods in detecting Salmonella in food with high levels of background flora.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
제안 방법
, 2004). Real-time PCRe ABI 7500® real-time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하였으며 반응 조건은 50oC 에서 2분, 95oC 에서 10분간 반응시킨 후 95oC 에서 15초, 60oC에서 1분을 1회로 하여 40 cycle을 반응시 켰다. Ct (threshold cycle) 값은 형광커브와 역치선이 만나는 cycle 값으로 ABI 7500® software(Applied Biosystems) 로 분석하였다.
Real-time PCR을 위한 반응액의 조성은 Taqman gene expression Master Mix 12.5 pL(Applied biosystems), foward primer(300 nM); 서열(5-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3')와 reverse primer(900 nM); 서열(5-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3') 그리고 probe(200 nM); 서열 (5-Cy3-CAC CGA CGG CGA GAC CGA CTT T-BHQ3-3')를 각각 2.5 pL 넣고, 샘플 DNA 5 pL로 총량이 25 pL이 되게 하였다. Salmonella spp.
각 식품에 존재하는 총 세균 수를 측정하기 위해 각 식품샘플 25 g를 멸균 stomacher bag에 담고 buffered peptone water(BPW, Difco laboratory) 225 mL를 첨가하여 laboratory stomacher blender(Interscience, USA)를 이용하여 30초간균질화하였다. 그 후, 100 #를 취하여 10배수로 희석하고 nutrient agar에 도말하여 37oC에서 24시간 배양하였다.
따라서 본 연구에서는 Salmonella 신속검출법을 비교 검증하기 위하여 상재균 수가 적은 편육과 많은 브로콜리 싹에 Salmonella 농도를 단계별로 접종한 후 20개 샘플로 나누어 배지법, VIDAS, real-time PCR을 사용하여 동시에 Salmonella를 검출하였고, 그 후 배지법과 두 종류의 신속검출법의 양성 검출률을 각각 통계학적으로 비교함으로써VIDAS과 real-time PCR의 검출도를 비교 검증하였으며추가적으로 각 식품에 존재하는 상재균 수가 검출률에 어떤 영향을 미치는가를 평가하였다.
그 후, 100 #를 취하여 10배수로 희석하고 nutrient agar에 도말하여 37oC에서 24시간 배양하였다.배양 후 집락 수를 세어 평균 총 세균 수를 측정하였다.
냉동보관(-70oC) 되어 있던 균주를 녹여 tryptic soy broth (TSB, Difco, USA)에서 37oC에 18시간 증균 배양하였다. 배양한 균액을 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2)에 10배수로 희석하여 nutrient agar(Difco laboratory에 100 pL를 도갈하고 37oC 에 18시간 배양하여 집락 수를 확인하였다. 균 수는 위와 같은 방법으로 필요할 때마다 확인하였다.
하나의 샘플에 각각 한 개의 VIDAS® "SLM" strip과 VIDAS® "SLM" SPR®(the solid phase receptacle)을 사용하였다. 샘플을 분석하기 전에 먼저 calibrating을 하고 준비가 다 되었으면 SPR과 strip을 장치에 끼운 다음 각각의 strip에 500 pL의 가열된 M broth 를 넣고 분석을 시작하였다. 결과는 test value로 확인하였으며 0.
대조군은 음성과 양성을 준비하였다. 음성 대조군의 경우에는 식품 25 g를 멸균 stomacher bag 에 담고 멸균된 PBS를 100 # 접종하고, 양성 대조군의 경우에는 식품 25 g에 100 # SE와 ST 중 한가지 균을 매우 높은 농도인 106CFU/mL 로 접종하였다. 모든 샘플은 24시간 동안 4oC의 환경에서 보관함으로써 실제 식품 샘플과 유사하도록 안정화 과정을 거쳤다.
laboratory stomacher blender를 이용해 30초간 균질하게 섞었다. 이렇게 균질화된 20개의 식품 샘플과 각각 한 개씩 설정한 대조군(양성, 음성)을 37oC에서 24시간 배양하였다.
접종량은 각 식품에 낮은 농도(<15 CFU/500 g), 중간 농도(15-100 CFU/500 g), 높은 농도 (100-1000 CFU/500g)를 각각 접종하였고 브로콜리싹에는 >1000 CFU/500 g의 가장 높은 농도를 추가 접종하였다. 접종과 동시에 접종한 균량을 nutrient agar(Difco, USA) 에도말하고 37oC에서 24시간 배양 후 집락 수를 세어 접종량을 확인 하였다. 대조군은 음성과 양성을 준비하였다.
접종량은 각 식품에 낮은 농도(1000 CFU/500 g의 가장 높은 농도를 추가 접종하였다.
총 22개의 샘플을 예비 증균 후, 분리배양을 위해 선택배지인 Rappaport Vassiliadis(RV; BioMrieux, France)의 10 mL에 예비 증균된 BPW 100 |jL를 접종하여 42oC에서 24 시간 배양하였다. 배양된 RV를 xylose lysine deoxycholate agar(XLD, Difco, USA)에 접종하고 37oC에서 24시간 배양하였다.
샘플은 편육과 브로콜리싹을 선정하였고 모두 서울시 광진구 소재의 대형 마트에서 구입하였다. 통계학적 분석을 위해 식품 샘플 500 g을 멸균 stomacher bag에 담고 SE와 ST 중 한 가지 균을 접종한 후 20개(25 g/샘플)로 나누어 각 검출법의 결과를 비교하였다. 접종량은 각 식품에 낮은 농도(<15 CFU/500 g), 중간 농도(15-100 CFU/500 g), 높은 농도 (100-1000 CFU/500g)를 각각 접종하였고 브로콜리싹에는 >1000 CFU/500 g의 가장 높은 농도를 추가 접종하였다.
대상 데이터
VIDAS®를 시행하기 위해 4oC에 보관되어 있던 시약 및 키트를 미리 꺼내어실온에 놓고 automated VIDAS® instrument(BioMrieux,France)도 미리 켜놓았다. 하나의 샘플에 각각 한 개의 VIDAS® "SLM" strip과 VIDAS® "SLM" SPR®(the solid phase receptacle)을 사용하였다. 샘플을 분석하기 전에 먼저 calibrating을 하고 준비가 다 되었으면 SPR과 strip을 장치에 끼운 다음 각각의 strip에 500 pL의 가열된 M broth 를 넣고 분석을 시작하였다.
Salmonella enterica subsp. enterica serotypes Enteritidis (SE)와 Typhimurium(ST)은 미국 FDA(MD, USA)에서 분양 받아 실험실에서 보유하고 있던 균주를 사용하였다. 냉동보관(-70oC) 되어 있던 균주를 녹여 tryptic soy broth (TSB, Difco, USA)에서 37oC에 18시간 증균 배양하였다.
접종과 동시에 접종한 균량을 nutrient agar(Difco, USA) 에도말하고 37oC에서 24시간 배양 후 집락 수를 세어 접종량을 확인 하였다. 대조군은 음성과 양성을 준비하였다. 음성 대조군의 경우에는 식품 25 g를 멸균 stomacher bag 에 담고 멸균된 PBS를 100 # 접종하고, 양성 대조군의 경우에는 식품 25 g에 100 # SE와 ST 중 한가지 균을 매우 높은 농도인 106CFU/mL 로 접종하였다.
샘플은 편육과 브로콜리싹을 선정하였고 모두 서울시 광진구 소재의 대형 마트에서 구입하였다. 통계학적 분석을 위해 식품 샘플 500 g을 멸균 stomacher bag에 담고 SE와 ST 중 한 가지 균을 접종한 후 20개(25 g/샘플)로 나누어 각 검출법의 결과를 비교하였다.
호기성 정상 세균총의 수가 다른 편육과 브로콜리 싹을 샘플로 선정하였으며 실험에 앞서 그 수를 측정하였다. 그 결과 편육은 호기성 정상세균총의 수가 100 CFU/g 이하였으며 브로콜리싹은 6.
데이터처리
Real-time PCRe ABI 7500® real-time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하였으며 반응 조건은 50oC 에서 2분, 95oC 에서 10분간 반응시킨 후 95oC 에서 15초, 60oC에서 1분을 1회로 하여 40 cycle을 반응시 켰다. Ct (threshold cycle) 값은 형광커브와 역치선이 만나는 cycle 값으로 ABI 7500® software(Applied Biosystems) 로 분석하였다.
배지법, 검출키트, real-time PCR을 수행하여 얻은 양성샘플 수 결과를 바탕으로 통계프로그램인 GraphPad Instat(GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, US A)을 사용하여 95%의 신뢰한계를 갖고 Fisher's extract test를 통해 각 방법 간의 통계학적 유의차3값)을 비교하였다. #이 0.
성능/효과
Real-time PCR과 배지법을 이용하여 편육에서 Salmonella 를 검출하고 비교한 결과, 낮은 농도(7 CFU/500 g) 에서는두 방법 모두 6개 샘플을 검출하였으며 , 중간 농도(32 CFU/ 500 g) 에서 배지법은 12개, real-time PCR는 15개, 높은 농도(336 CFU/500 g)에서는 배지법은 20개 real-time PCR는 19개 샘플이 양성으로 검출되었다. VIDAS® 결과와 같이 3 단계 접종농도 모두 배지법과 통계학적 유의차가 나타나지 않았다(Table 3).
VIDAS®를 이용하여 편육에서 Salmonella를 검출한 후배지법과 비교한 결과, 낮은 농도(15 CFU/500 g)에서는 두 방법 모두 20개 중 13개 샘플을 검출하였으며, 중간 농도(43 CFU/500 g)에서 배지법은 12개 , VIDAS®는 14개, 높은 농도(336 CFU/500 g)에서는 20개 모든 샘플이 두 방법 에서 양성으로 검출되었다. 3단계 접종농도 모두 배지법과 VIDAS® 간의 통계학적 유의차가 나타나지 않았다(Table 2).
배지법, 신속 검출 키트, real-time PCR를이용하여 편육과 브로콜리싹에 인위적으로 접종한Salmonella를 검출한 결과는 Table 2과 3에 각각 정리하였다. 각 검출법에 따른 Salmonella 검출에서는 음성과 양성대조군의 결과가 각각 음성, 양성으로 나타냈으므로 실험상에는 오류가 없었다(결과 미제시). 두 검출법을 비교검증 하기 위해서는 20개 샘플 중 절반 정도 양성이 나오도록 접종하는 것이 중요한데 샘플에 따라 필요한 접종농도가 현저하게 차이가 있었다.
그러나 상재균이 많은 브로콜리 싹과 같은 야채식품에서는 낮은 농도를 접종했을 때에는 양성이 검출 되지 않았고 배지법에 비해 VIDAS®법이나 realtime PCR법이 더 우수한 검출력을 나타내었다. 결론적으로 VIDAS® 같은 신속키트법이나 real-time PCR과 같은유전자 기법을 이용하면 배지법과 동등한 민감도로 축산식품에서 Salmonella 검출이 가능하며, 특히 상재균이 많은 야채 식품의 경우에는 배지법은 경쟁 세균에 의해 검출이 저해되므로 이보다 경쟁 세균의 영향을 덜 받는VIDAS®법이나 real-time PCR법을 이용하여 검출하는 것이 더 효과적이라고 할 수 있겠다. 또한 이러한 신속 진단법을 이용하면 기존의 5일 이상이 소요되는 배지법에비해 VIDAS®는 3일, real-time PCRe 선택 증균 없이 BPW에서의 24시간 예비 증균 한 번으로도 배지법보다 높은 검줄률로 Salmonella를 검줄할 수 있는 것으로 나타났다.
선정하였으며 실험에 앞서 그 수를 측정하였다. 그 결과 편육은 호기성 정상세균총의 수가 100 CFU/g 이하였으며 브로콜리싹은 6.7x107CFU/g로 매우 큰 차이가 있었다(Table 1). 배지법, 신속 검출 키트, real-time PCR를이용하여 편육과 브로콜리싹에 인위적으로 접종한Salmonella를 검출한 결과는 Table 2과 3에 각각 정리하였다.
그러나 이들의 연구는 gold-standard법으로 nalidixic acid resistant strain 을 사용하여 nalidixic acid가 포함된 XLD로 검출한 것으로 다른 경쟁 세균의 영향을 받지 않고 검출되기 때문에 배지 법이 PCR법과 동일한 검출률을 보인 것으로 여겨지며 이는 실제 상황을 반영하지 못한다는 한계가 있다. 그러나 본 연구에서는 wild type 균주를 사용함으로써 현장과 같은 상황을 재현하였으며, 그 결과 새싹 식품에서 realtime PCR법이 통계학적 유의차를 나타내며 배지법보다 우수한 검출률을 나타내었다.
얻을 수 있었다. 그러나 상재균이 많은 브로콜리 싹과 같은 야채식품에서는 낮은 농도를 접종했을 때에는 양성이 검출 되지 않았고 배지법에 비해 VIDAS®법이나 realtime PCR법이 더 우수한 검출력을 나타내었다. 결론적으로 VIDAS® 같은 신속키트법이나 real-time PCR과 같은유전자 기법을 이용하면 배지법과 동등한 민감도로 축산식품에서 Salmonella 검출이 가능하며, 특히 상재균이 많은 야채 식품의 경우에는 배지법은 경쟁 세균에 의해 검출이 저해되므로 이보다 경쟁 세균의 영향을 덜 받는VIDAS®법이나 real-time PCR법을 이용하여 검출하는 것이 더 효과적이라고 할 수 있겠다.
각 검출법에 따른 Salmonella 검출에서는 음성과 양성대조군의 결과가 각각 음성, 양성으로 나타냈으므로 실험상에는 오류가 없었다(결과 미제시). 두 검출법을 비교검증 하기 위해서는 20개 샘플 중 절반 정도 양성이 나오도록 접종하는 것이 중요한데 샘플에 따라 필요한 접종농도가 현저하게 차이가 있었다. 표준법인 배지법에서 20개 샘플 중 절반 정도 양성이 나오게 하는데 필요한 접종농도는 상재균 수가 g 당 100 CFU 이하 (Table 1)인 편육의 경우 43 CFU/500 g(Table 2)과 32 CFU/500 g(Table 3)인 반면, 상재균 수가 6.
결론적으로 VIDAS® 같은 신속키트법이나 real-time PCR과 같은유전자 기법을 이용하면 배지법과 동등한 민감도로 축산식품에서 Salmonella 검출이 가능하며, 특히 상재균이 많은 야채 식품의 경우에는 배지법은 경쟁 세균에 의해 검출이 저해되므로 이보다 경쟁 세균의 영향을 덜 받는VIDAS®법이나 real-time PCR법을 이용하여 검출하는 것이 더 효과적이라고 할 수 있겠다. 또한 이러한 신속 진단법을 이용하면 기존의 5일 이상이 소요되는 배지법에비해 VIDAS®는 3일, real-time PCRe 선택 증균 없이 BPW에서의 24시간 예비 증균 한 번으로도 배지법보다 높은 검줄률로 Salmonella를 검줄할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 신속 검출법은 실제 식품검사에서 많이 나오게 되는 음성 샘플을 신속하게 배제하기 위한 presumptive screening 과정에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 여겨지며 또한 야채 내의 상재균에 의해 검출이 저해받는 배지법을 개선하기 위해서는 이들의 성장을 낮출 수 있는 새로운 선택 증균법 개발이 시급한 것으로 여겨진다.
음성 대조군의 경우에는 식품 25 g를 멸균 stomacher bag 에 담고 멸균된 PBS를 100 # 접종하고, 양성 대조군의 경우에는 식품 25 g에 100 # SE와 ST 중 한가지 균을 매우 높은 농도인 106CFU/mL 로 접종하였다. 모든 샘플은 24시간 동안 4oC의 환경에서 보관함으로써 실제 식품 샘플과 유사하도록 안정화 과정을 거쳤다.
본 연구의 결과를 종합해볼 때 상재균 수가 적은 편육과 같은 축산가공식품에서는 낮은 접종 농도에서도 양성샘플이 검출되었으며 VIDAS®법이나 real-time PCR법을사용하였을 때에도 전통배지법과 통계학적으로 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 그러나 상재균이 많은 브로콜리 싹과 같은 야채식품에서는 낮은 농도를 접종했을 때에는 양성이 검출 되지 않았고 배지법에 비해 VIDAS®법이나 realtime PCR법이 더 우수한 검출력을 나타내었다.
, 2003). 이러한 결과로 미루어볼 때 상재균이 비교적 적은 가공축산식품에서는 전통 배 지법 뿐만 아니라 신속키트법도 통계학적 유의차 없이 동일한 검출률로 식중독 균을 검출할 수 있는 것으로 여겨진다.
05) 를 보이며 real-time PCR에서 더 많은 샘플이 검출되었다 (Table 3). 중간 농도(62 CFU/500 g)에서 배지법은 4개 realtime PCRe 15개, 높은 농도(758 CFU/500 g)에서 배지 법은 3개 real-time PCRe 10개 , 가장 높은 농도(1635 CFU / 500g)에서는 배지법은 8개 real-time PCRe 17개를 검출하였다. 과일 및 야채 샘플에서 시행한 다른 연구에 의하면, Salmonella를 1, 10, 100 CFU/sample(25 g)로 접종한 후 real-time PCR(BAX system)과 배지법을 이용하여 검출하였을 때 배지법과 real-time PCR이 동일한 검출률을 보였다는 연구결과가 있다(Shearer et al.
그 외 Bohaychuk 등(2007) 에 의하면 다양한 육류(가금육, 우육, 돈육)에 1 CFU/sample 을 접종한 후 BPW에서 24시간, RV와 TT에서 24시간 배양 후 배지법과 real-time PCR법으로 검출한 결과, 육류에 5개 중 5개 모두 양성결과가 나타났다. 즉, 본 연구의 결과와 유사하게 육류샘플에 높은 농도와 낮은 농도를 접종했을 때 배지법과 real-time PCR간의 검출률에는 차이가 없었다. 따라서 real-time PCR법도 신속키트법과 같이 상재균이 비교적 적은 가공축산식품에서 전통배지법과 차이 없이 효율적으로 식중독균을 검출할 수 있는 것으로 여겨진다.
편육과는 달리 브로콜리싹을 이용한 실험에서는 낮은 농도(10 CFU/500 g)에서는 두 방법 모두 20개 샘플 중 1개의 샘플만이 양성을 나타냈으며, 낮은 농도를 제외한 모든 접종 농도에서 두 방법간에 통계학적인 유의차P<0.05) 를 보이며 real-time PCR에서 더 많은 샘플이 검출되었다 (Table 3). 중간 농도(62 CFU/500 g)에서 배지법은 4개 realtime PCRe 15개, 높은 농도(758 CFU/500 g)에서 배지 법은 3개 real-time PCRe 10개 , 가장 높은 농도(1635 CFU / 500g)에서는 배지법은 8개 real-time PCRe 17개를 검출하였다.
두 검출법을 비교검증 하기 위해서는 20개 샘플 중 절반 정도 양성이 나오도록 접종하는 것이 중요한데 샘플에 따라 필요한 접종농도가 현저하게 차이가 있었다. 표준법인 배지법에서 20개 샘플 중 절반 정도 양성이 나오게 하는데 필요한 접종농도는 상재균 수가 g 당 100 CFU 이하 (Table 1)인 편육의 경우 43 CFU/500 g(Table 2)과 32 CFU/500 g(Table 3)인 반면, 상재균 수가 6.7x107 CFU/g(Table 1)로 많은 브로콜리 싹의 경우에는 1635 CFU/500 g(Table 2, 3)으로 매우 높은 농도였다. 이는 브로콜리싹에 존재하는 상재균이 Salmonella 의 성장을 억제하여 검출력에 영향을 미치는 것으로 여겨 지며 이와 관련된 연구의한 예로 De Medici 등(1998) 의 연구 결과에 의하면 가금육에 인위적으로 10CFU/25g의 Salmonella을: 접종한 후 VIDAS®와 배지법을 비교한 결과 상재균의 수와 관계없이 두 방법에서 양성 결과를 나타내었지만 Citrobacter freundii가 높은 농도로 존재하는 샘플에서는 1.
후속연구
또한 이러한 신속 진단법을 이용하면 기존의 5일 이상이 소요되는 배지법에비해 VIDAS®는 3일, real-time PCRe 선택 증균 없이 BPW에서의 24시간 예비 증균 한 번으로도 배지법보다 높은 검줄률로 Salmonella를 검줄할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 신속 검출법은 실제 식품검사에서 많이 나오게 되는 음성 샘플을 신속하게 배제하기 위한 presumptive screening 과정에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 여겨지며 또한 야채 내의 상재균에 의해 검출이 저해받는 배지법을 개선하기 위해서는 이들의 성장을 낮출 수 있는 새로운 선택 증균법 개발이 시급한 것으로 여겨진다.
참고문헌 (18)
Bansal, N. S., Gray, V., and McDonell, F. (2006) Validated PCR assay for the routine detection of Salmonella in food. J. Food Protect. 69, 282-287
Bohaychuk, V. M., Gensler, G. E., McFall, M. E., King, R. K., and Renter, D. G. (2007) A real-time PCR assay for the detection of Salmonella in a wide variety of food and foodanimal matrices. J. Food Protect. 70, 1080-1087
Catarame, T. M. G., O'Hanlon, K. A., McDowell, D. A., Blair, I. S., and Duffy, G. (2006) Comparison of a real-time polymerase chain reaction assay with a culture method for the detection of Salmonella in retail meat samples. J. Food Safety 26, 1-15
Cheung, P. Y., Kwok, K. K., and Kam, K. M. (2007) Application of BAX system, Tecra UniqueTM Salmonella test, and a conventional culture method for the detection of Salmonella in ready-to-eat and raw foods. J. Appl. Microbiol. 103, 219-227
D'Aoust, J. Y., Sewell, A. M., and Warburton, D. W. (1992) A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 16, 41-50
De Medici, D., Pezzotti, G., Marfoglia, C., Caciolo, D., Foschi, G., and Orefice, L. (1998) Comparison between ICSVidas, MSRV and standard cultural method for Salmonella recovery in poultry meat. Int. J. Food Microbiol. 45, 205-210
Hein, I., Flekna, G., Krassnig, M., and Wagner, M. (2006) Real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: An alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project. J. Microbiol. Methods 66, 538-547
Korsak, N., Degeye, J. N., Etienne, G., China, B., and Daube, G. (2004) Comparison of four different methods for Salmonella detection in fecal samples of porcine origin. J. Food Protect. 67, 2158-2164
Krascsenicsova, K., Piknova, L., Kaclikova, E., and Kuchta, T. (2008) Detection of Salmonella enterica in food using two-step enrichment and real-time polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 46, 483-487
Malorny, B., Paccassoni, E., Fach, P., Bunge, C., Martin, A., and Helmuth, R. (2004) Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Appl. Environ. Microbiol. 70, 7046-7052
McMahon, W. A., Schultz, A. M., and Johnson, R. L. (2004) Evaluation of VIDAS Salmonella (SLM) immunoassay method with Rappaport-Vassiliadis (RV) medium for detection of Salmonella in foods: collaborative study. J. AOAC Int. 87, 867-883
Oliveira, S. D., Rodenbusch, C. R., Ce, M. C., Rocha, S. L. and Canal, C. W. (2003) Evaluation of selective and nonselective enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett. Appl. Microbiol. 36, 217-221
Shearer, A. E., Strapp, C. M., and Joerger, R. D. (2001) Evaluation of a polymerase chain reaction-based system for detection of Salmonella Enteritidis, Escherichia coli O157: H7, Listeria spp., and Listeria monocytogenes on fresh fruits and vegetables. J. Food Protect. 64, 788-795
Uyttendaele, M., Vanwildemeersch, K., and Debevere, J. (2003) Evaluation of real-time PCR vs automated ELISA and a conventional culture method using a semi-solid medium for detection of Salmonella. Lett. Appl. Microbiol. 37, 386-391
Walker, R. L., Kinde, H., Anderson, R. J., and Brown, A. E. (2001) Comparison of VIDAS enzyme-linked fluorescent immunoassay using Moore swab sampling and conventional culture method for Salmonella detection in bulk tank milk and in-line milk filters in California dairies. Int. J. Food Microbiol. 67, 123-129
Wang, X., Jothikumar, N., and Griffiths, M. W. (2004) Enrichment and DNA extraction protocols for the simultaneous detection of Salmonella and Listeria monocytogenes in raw sausage meat with multiplex real-time PCR. J. Food Protect. 67, 189-192
Yeh, K. S., Tsai, C. E., Chen, S. P., and Liao, C. W. (2002) Comparison between VIDAS automatic enzyme-linked fluorescent immunoassay and culture method for Salmonella recovery from pork carcass sponge samples. J. Food Protect. 65, 1656-1659
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