[국내논문]군소(Aplysia kurodai)에 분포하는 글루코사미노글리칸의 추출과 기능특성 2. 글루코사미노글리칸의 구조 특성 Extraction of Glycosaminoglycan from Sea Hare, Aplysia kurodai, and Its Functional Properties 2. Structural Properties of Purified Glycosaminoglycan원문보기
군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다. 정제한 GAG는 1648 $cm^{-1}$에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 $cm^{-1}$에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 $cm^{-1}$에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다. 정제한 GAG는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose로 구성되어 있는 것으로 나타났고, 이중에서 N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당 복합체인 heparan sulfate인 것으로 추정되었다. 군소 GAG는 단백질핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다.
군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다. 정제한 GAG는 1648 $cm^{-1}$에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 $cm^{-1}$에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 $cm^{-1}$에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다. 정제한 GAG는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose로 구성되어 있는 것으로 나타났고, 이중에서 N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당 복합체인 heparan sulfate인 것으로 추정되었다. 군소 GAG는 단백질핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다.
Glycosaminoglycan (GAG) was purified from polysaccharide extracted from sea hare muscle on DEAE-Sepharose column and investigated for the functional groups, distribution of sugars, composition of disaccharide and structure of GAG. Purified GAG was composed of disaccharide above 55% of total sugar. P...
Glycosaminoglycan (GAG) was purified from polysaccharide extracted from sea hare muscle on DEAE-Sepharose column and investigated for the functional groups, distribution of sugars, composition of disaccharide and structure of GAG. Purified GAG was composed of disaccharide above 55% of total sugar. Purified GAG showed amide I peak in 1648/cm and C-O stretch peak as properties of carbohydrate, amino acid peak in 1457/cm, and peak in 866/cm as properties of monosaccharide by FT-IR. Fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, mannose and xylose were found in MALDI-TOF MS/MS spectra of hydrolysates by chondroitin sulfate ABC lyase and heparanase I. Purified GAG was expected to be heparan sulfate including N-acetylgalactosamine and N-acetylglucosamine above 70% of total sugar. The structure of GAG was supposed as GlyUA(2S)-GlcNS and GlyUA-GlcNS(6S) with O-linkage on protein core.
Glycosaminoglycan (GAG) was purified from polysaccharide extracted from sea hare muscle on DEAE-Sepharose column and investigated for the functional groups, distribution of sugars, composition of disaccharide and structure of GAG. Purified GAG was composed of disaccharide above 55% of total sugar. Purified GAG showed amide I peak in 1648/cm and C-O stretch peak as properties of carbohydrate, amino acid peak in 1457/cm, and peak in 866/cm as properties of monosaccharide by FT-IR. Fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, mannose and xylose were found in MALDI-TOF MS/MS spectra of hydrolysates by chondroitin sulfate ABC lyase and heparanase I. Purified GAG was expected to be heparan sulfate including N-acetylgalactosamine and N-acetylglucosamine above 70% of total sugar. The structure of GAG was supposed as GlyUA(2S)-GlcNS and GlyUA-GlcNS(6S) with O-linkage on protein core.
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문제 정의
그리고 2가지 형태의 heparan sulfate가 동정됨으로 인해 앞서 정제물을 효소 처리하여 전기영동 한 결과(33)인 2개의 band와 일치하는 결과를 보였다. 따라서 정제한 GAG가 heparan sulfate일 가능성을 제시하였다.
군소의 생리적인 기능으로서 항암(21-23)효능, purple gland의 항균효능(24)과 군소의 신경 펩티드에 관한 연구(25,26)는 이루어져 있으나, 군소의 GAG와 관련하여 Hovingh와 Linker(27)의 Aplysia californica와 Helix aspersa의 chondrotin sulfate와 heparan sulfate에 관한 연구 외에는 거의 이루어져 있지 않다. 본 연구에서는 남해안 일대에서 여름철에 어획되어 부산과 경남지역을 중심으로 소비되고 있는 군소에서 GAG를 정제하고 IR spectrum, 이당류 분석 및 질량분석을 통하여 GAG의 구조적 특성을 조사하였다.
제안 방법
MBTH 법에 의한 당 함량의 측정은 증류수에 녹아있는 시료 100 μL를 시험관에 분취하고, 1,9-dimethylmethylene blue(pH 3.0) 용액 2.5 mL를 가하여 혼합하고 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며, N-acetyl-D-galactosamine으로 작성한 검량곡선으로 함량을 구하였다.
실온까지 방냉한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. Uronic acid 함량은 glucuronolactone으로 작성한 검량곡선으로 계산하였다.
가수분해물 중의 효소를 100℃에서 2분 동안 가열하여 불활성화 시키고, 0.45 μm 필터로 여과한 뒤 탈이온수로 평형화된 SAX column (Phenosphere 5u SAX 80A, 25 × 0.46 cm, Phenomenex Co., Torrance, CA, USA) 상에서 2 M NaCl(pH 3.5) 용액으로 선형균배하여 용출시키면서 232 nm에서 이당류를 검출하였다.
각 획분의 총 탄수화물 함량은 phenol-sulfuric acid법(30), uronic acid 함량은 Bitter와 Muir(31)의 carbazole assay을 다소 변형한 방법으로, N-acetylhexosamines 함량은 MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride) 법(32)으로 각각 측정하였다. 즉 phenol-sulfuric acid 법은증류수에 녹인 시료 150 μL를 시험관에 취하고 5%(w/v) phenol 용액 150 μL와 혼합한 후, 신속히 진한 황산 750 μL를 첨가해 10분간 실온에서 반응시켰다.
군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다.
동결 건조시료 1 g에 10 배량의 50 mM sodium phosphate 완충액(pH 6.0)을 첨가하고, 기질에 대하여 단백질 농도비가 1/50이 되도록 Flavourzyme 500 MG을 첨가하여 60℃의 항온 수조에서 흔들어 주면서 15시간 동안 가수분해하였다. 원심분리(3,000 × g, 30 min)하여 얻은 가수분해물의 상등액에 최종농도가 3%가 되도록 trichloroacetic acid를 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 후, 원심분리(3,000×g, 30 min)하여 침전한 단백질을 제거하였다.
45 μm 필터로 여과한 여액을 시험관에 50 μL를 분취하여 250 μL의 30 mM HCl을 첨가하여 탈중합시켰다. 반응액은 분광광도계로 232 nm에서 흡광도를 측정하였으며, chondroitin sulfate A(C9819)를 표준물질로 사용하여 작성한 검량곡선에 따라 GAG의 함량을 측정하였다.
산가수분해물을 Speed-vac(DP23080A, Sunonwealth Elec Mach Ind Co. Ltd., Peking, China)으로 건조하여 소량의 탈이온수로 수회 세척한 후 탈이온수 100 μL에 용해하여 16 mM NaOH 용액으로 평형화된 CarboPac PA1 column(0.45 × 25 cm, Dionex Co., Bannockburn, IL, USA)에 loading하고, 동일 용액으로 유속 1.0 mL/min에서 용출하면서 HPAED-PAD(High-performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector, Dionex Co.)로 당을 검출하였다.
정제 GAG의 질량은 electrospray ionization mass spec- trometry(ESI-MS) 질량분석기인 Qtrap 3200 LC/MS/MS (Applied Biosystems, Forster, CA, USA)를 사용하여 positive mode에서 ion voltage 5,500, curtain gas(CUR) 20으로 조건을 맞추어 syringe direction injection 방법으로 Q1 scan method로 실험을 수행하고 결과를 분석하였다.
정제한 GAG의 disaccharides 분석을 위해 건조된 시료 (50 μg)를 chondroitin sulfate ABC lyase와 heparinase I로 37℃에서 15시간 동안 가수분해하였다.
정제한 GAG의 기능기는 정제한 GAG에 소량의 KBr을 첨가하여 tablet를 형성시킨 후 적외선 분광광도계(Vertex 80v, Bruker Optics, Ettlingen, Germany)를 사용하여 스펙트럼을 측정하였다.
정제한 GAG의 조성당 분석은 건조 시료를 10 mg/mL 농도로 용해하여 2 mL를 분취하고 최종농도가 2 M이 되도록 trifluoroacetic acid를 첨가하여, 100℃에서 4시간 동안 산가수분해 하였다. 산가수분해물을 Speed-vac(DP23080A, Sunonwealth Elec Mach Ind Co.
즉 phenol-sulfuric acid 법은증류수에 녹인 시료 150 μL를 시험관에 취하고 5%(w/v) phenol 용액 150 μL와 혼합한 후, 신속히 진한 황산 750 μL를 첨가해 10분간 실온에서 반응시켰다. 한번 더 vortex를 이용해 혼합하고 발색이 될 때까지 실온에서 30분간 반응시킨다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, D-galactose로작성한 검량곡선에 따라 함량을 계산하였다.
회전진공증발기로 40℃ 이하에서 상등액의 Brix가 60이 될 때까지 감압농축하고, 농축물에 5배량의 에탄올을 첨가하여 알코올 불용성 물질을 침전시킨 다음, 원심분리(3,000 × g, 30 min)한 침전물을 회수하여 추출 다당류로 사용하였다.
효소적 탈중합으로 GAG를 확인하기 위해 정제한 시료(100 μg)를 chondroitin sulfate ABC lyase(C2905)와 heparinase I(H2519)로 37℃에서 15시간 동안 가수분해 하였다.
대상 데이터
끓는 물에서 5분 동안 자숙하여 색소와 냄새를 제거한 군소를 통영시 잠수기조합에서 구입하여, 육질과 내장을 분리한 다음 동결건조하여 -20℃의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 단백질 분해효소로서 Flavourzyme 500 MG 와 Neutrase는 Novozymes(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, DEAE-Sepharose 수지와 Superdex HR-200 칼럼은 GE healthcare Korea(Seoul, Korea)에서 구입하였고, papain (P3375), 분자량 측정을 위한 표준단백질과 GAG 표준물질 및 그 외의 모든 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
5) 용액으로 선형균배하여 용출시키면서 232 nm에서 이당류를 검출하였다. 표준품으로는 heparin/heparan sulfate disaccharide kit(Seikagaku Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다.
이론/모형
동결 건조한 군소의 일반성분은 AOAC법(28)에 따라 수 분은 상압가열건조법, 조회분은 건식회화법, 조단백질은 micro Kjeldahl법으로 분석하였으며, 조지방은 Folch법(29)으로 분석하고, 탄수화물은 위의 성분을 감하여 구하였다.
성능/효과
GAG 지표물질을 사용하여 군소 육질에서 추출한 다당류와 이들 정제물의 hexuronic acid와 hexosamine의 함량을 측정한 결과(Table 1), 아미노당의 유도체로 작용하는 hexuronic acid 함량은 다당 추출물의 경우 1.0 ± 0.0 g/100 g이었고 정제물의 경우에는 6.0 ± 0.2 g/100 g이었다.
GAG를 구성하는 성분으로 또 다른 지표물질인 hexosamine의 함량 또한 당 추출물에서 5.6±0.2 g/100 g의함량을 나타내었으며 정제물의 경우에는 25.7 ± 1.3 g/100 g 로서 상당히 높은 함량을 보였다.
1), 초기의 peak는 중성 다당류 중에서 단당류가 칼럼에 흡착하지 않고 용출되며, 이후에 용출하는 주 peak는 GAG의 용출 peak인 것으로 추정하였다. GAG의 지표 물질인 uronic acid와 hexosamine 함량을 측정한 결과 앞서 얻은 용출 형태와 일치하는 구간에서 uronic acid와 hexosamine이 용출되는 것을 확인하였다. 대부분의 uronic acid는 GAG와 프로테오글리칸에서 발견된다(33).
Heparan ΔDi-OS, heparan ΔDi-NS, heparan ΔDi-6S, heparan ΔDi-di(U,N)S, heparan ΔDi-tri(U,6,N)S를 표준물질로 사용하고, chondroitin sulfate ABC lyase와 heparinase I를 이용하여 탈중합한 후 질량 분석한 결과(Fig. 5A), 정제한 GAG를 chondroitin sulfate ABC로 가수분해 질량 스펙트럼에서는 Thr(118.9), GlcA(176.90), GlcNAc(220.9), glucuronic acid-2-N-acetyl-glucosamic acid(261.0), NeuAc(309.3), GlcNS(318.9)를 확인할 수 있었으며, heparanase I로 가수분해한 질량 분석 스펙트럼(Fig. 5B)에서도같은 질량의 물질을 확인할 수 있었다.
그리고 850 cm-1 부근의 peak는 glucose, galactose, mannose의 C-O-C skeletal을 반영한다(35). 본 실험 결과 정제한 GAG는 1648 cm-1에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 cm-1에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 cm-1에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다.
5 g/100 g으로 36% 이상을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 이 같은 결과는 GAG의 기본형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상인 것을 의미하는 것으로 정제물이 GAG로 이루어진 다당 복합체임을 제시한다.
5B)에서도같은 질량의 물질을 확인할 수 있었다. 이 같은 결과로 미루어 군소 GAG는 단백질 핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있음을 확인하였다(Fig. 6).
정제된 GAG의 이당류를 분석한 결과(Fig. 4), heparinase I을 사용한 Fig. 4(A)는 heparin/heparan sulfate 이당류 kit의 Δ4GlyUA→4GlcNS(6S)와 일치하는 35분대에서 peak가 용출되었으며, chondroitin sulfate ABC lyase를 사용한 Fig. 4(B)는 heparin/heparan sulfate disaccharide kit의 Δ4GlyUA (2s)→4GlcNS와 일치하는 36분대에서 peak가 용출되는 것을 확인할 수 있었다.
정제한 GAG는 1648 cm-1에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 cm-1에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 cm-1에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다. 정제한 GAG 는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose로 구성되어 있는 것으로 나타났고, 이중에서 N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당 복합체인 heparan sulfate인 것으로 추정되었다. 군소 GAG는 단백질핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다.
그리고 850 cm-1 부근의 peak는 glucose, galactose, mannose의 C-O-C skeletal을 반영한다(35). 본 실험 결과 정제한 GAG는 1648 cm-1에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 cm-1에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 cm-1에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다.
정제한 GAG는 agarose 겔 전기영동 상으로 미루어 보아 단일물질이며, 표준물질과의 이동도를 비교할 때 주성분은 heparan sulfate인 것으로 추정하였고, 겔 크로마토그래피상에서 분자량은 29.6 kDa으로 확인되었다(33).
정제한 GAG는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose 로 구성되어 있는 것으로 나타났고(Fig. 3), 이중에서 Nacetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당복합체임을 확인할 수 있었다. GAG는 glucose, galactose, N-acetyl-galactosamine, N-acetyl-glucosamine, mannose, xylose 등으로 연결되어 생물체내에서 proteoglycan의 형태로 존재하며(36), 구조를 해석하고 해당 분자들의 서열을 해석하기 위해 구성당 분석은 필수적인 항목이다.
군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다. 정제한 GAG는 1648 cm-1에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 cm-1에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 cm-1에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다.
효소특이적 탈중합으로 GAG를 확인한 결과(Table 1), 군소 다당류 추출물에서 정제한 글리코사미노글리칸을 chondroitin sulfate ABC lyase를 이용해 가수분해 후 측정한 결과 이당류의 함량은 22.1±1.7 g/100 g으로 22% 이상을 함유하고 있는 것으로 나타났고, heparinase I을 이용해 가수분해후 측정한 결과에서는 이당류의 함량이 36.1 ± 2.5 g/100 g으로 36% 이상을 함유하고 있는 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Chondroitin sulfate는 어디에 분포되어 있는가?
Chondroitin sulfate는 포유동물의 연골뿐만 아니라, 각 조직과 체액에 이르기까지 널리 분포하고 있다(5). 쥐의 늑골이나 소의 태아(6) 및 사람의 위와 신장조직(7), 사람이나 토끼의 혈액과 뇨(8)에 분포하며, 이 밖에 닭의 태아, 각막 상피조직(9), 상어연골(10), 무척추동물(11), 소, 돼지, 오징어 연골 등의 관절연골(12)에서 sulfate를 가진 GAG가 분리되었으며, 해삼에서도 당단백질이 발견되어 포유동물 이외에서도 고루 분포하고 있음이 확인되었다(13-16).
대표적인 GAG는 무엇이 있는가?
당 잔기에 황산기(SO3-)나 카르복실기(COO-)를 가져 음전하를 띠며, 당 잔기들 간의 결합 형태와 sulfate의 수와 위치에 따라그 특성이 분류된다(1,2). GAG는 황산기의 유무에 따라 황산화 다당과 비황산화 다당으로 크게 나누어지며, 대표적인 GAG에는 hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparin/heparan sulfate와 keratan sulfate 등이 있다(3). Hyaluronic acid를 제외한 GAG는 당단백질과는 다른 프로테오글리칸으로 존재하며, 음이온기가 많은 chondroitin sulfate, keratan sulfate(또는 dermatan sulfate)의 콘드로이틴군(chondroitin family)과 헤파린군(heparin family)은 결합 부위에 중심단백질을 가지고 있다(4).
정제한 glycosaminoglycan의 특징은 무엇인가?
군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다. 정제한 GAG는 1648 cm-1에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 cm-1에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 cm-1에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다. 정제한 GAG 는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose로 구성되어 있는 것으로 나타났고, 이중에서 N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당 복합체인 heparan sulfate인 것으로 추정되었다. 군소 GAG는 단백질핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다.
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