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제안 방법
- Mannanase 반응속도에 미치는 반응 pH의 영향은 반응온도를 50℃로 하고 반응액 pH를 달리하여 mannanase 활성을 측정함으로써 조사하였으며, 이때 완충용액으로는 50 mM sodium citrate (pH 4.0-6.0)와 50 mM sodium phosphate (pH 6.0-8.0)가 사용되었다. 반응온도가 효소활성에 미치는 영향은 반응 pH를 5.
- subtilis WL-8 균체로부터 총 염색체 DNA를 분리하기 위해서는 Genomic DNA prep kit (Solgent, Korea), 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위해서는 Plasmid Mini-prep kit (Solgent)를 각각 제조사의 지침에 따라 사용하였다. Mannanase 유전자를 클로닝하기 위해 분리된 염색체 DNA를 PstI으로 절단하고 크기가 약 1.5 kb 이상인 DNA 단편을 아가로스젤에서 추출하였다. 이를 동일효소로 절단된 pUC19와 ligation한 후 E.
- Mannanase 유전자를 함유한 재조합 대장균을 ampicillin이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 13시간 정도 진탕 배양한 후 배양액을 원심분리하여 배양상등액과 균체를 분리하였다. 균체는 20 mM sodium phosphate 완충용액(pH 6.
- Mannanase를 생산하는 미생물 분리를 위해 가정에서 제조된 된장 시료 1 g을 0.85% NaCl 용액 10 ml에 현탁하고 현탁액의 적당량을 취하여 LBG를 첨가한 nutrient 평판배지에 도말한 후 37℃에서 배양하여 콜로니 주변에 LBG 분해환을 관찰하였다. B.
- Mannanase를 생산하는 미생물을 분리하기 위해서 0.5% locust bean gum (LBG)이 첨가된 nutrient 평판배지(beef extract, 3 g; bacto-peptone, 5 g; agar, 15 g; water, 1 L)를 사용하였으며, 분리균의 mannanase 생산균의 효소 생산량 조사를 위한 기본배지로는 LB 액체배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; water, 1 L)를 사용하였다. Mannanase 생산 분리균인 B.
- DNS 시약 3 ml을 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5분 동안 방치하여 발색시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Mannose를 표준시료로 사용하여 동일 조건에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성도 1.
- 균체내 효소와 분비된 효소의 반응특성을 비교하기 위해 배양상등액과 균체파쇄상등액을 효소액으로 각각 사용하여 온도와 pH가 효소의 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 반응온도(40-70℃)와 반응 pH(4.
- 균체는 20 mM sodium phosphate 완충용액(pH 6.0)에 현탁하고 Branson sonifier (Branson, USA)를 사용하여 균체를 파쇄한 후 15,000×g, 4℃에서 20분간 원심분리함으로써 균체 파쇄상등액을 제조하였으며, 배양상등액은 polyethersulfone membrane (분자량 10 kDa; Millipore, USA)을 사용하여 5배 농축하였다.
- subtilis WL-8의 염색체 DNA로부터 재료 및 방법에서 언급한 방법으로 mannanase 유전자를 클로닝한 결과 LBG 분해환을 보이는 형질전환주를 1주 선발하였다. 대장균 형질전환 주에서 플라스미드를 분리하고 클로닝된 DNA 단편(4 kb) 중 mannanase 유전자를 포함하는 1,373 bp 길이의 DNA 염기서열을 결정한 후 ORF를 조사하였다. 그 결과 개시코돈을 TTG로 하며 362 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,086 bp의 mannanase 유전자가 발견되었으며 개시코돈으로부터 6 nucleotides가 떨어진 부분에 ribosome 결합위치로 추정되는 GGGGAG가 존재하였다(GenBank accession no.
- coli XL-1 blue에 형질 전환하였다. 대장균 형질전환주를 0.5% LBG를 첨가한 LB 평판배지에 옮겨 배양한 후 0.2% congo red 용액으로 1시간 염색하고 1 M NaCl 용액으로 탈색하여 형질전환주 집락 주변에 분해환을 관찰함으로써 mannanase 유전자가 클로닝된 형질전환주를 선별하였다. 염기서열은 클론된 유전자를 제한효소로 적절한 크기로 절단하여 얻은 단편을 pUC19에 도입함으로써 재조합 플라스미드를 제조한 후, 이를 주형 DNA로 하고 M13 universal primer와 reverse primer를 사용하여 dideoxy-chain termination 방법으로 결정하였다.
- Mannanase 생산성을 가장 많이 증가시킨 밀기울의 첨가량을 1-10% 범위로 달리 첨가한 배지에서 배양한 후 효소 생산성을 조사하였을 때 밀기울 6%를 첨가한 배지에서 효소 생산성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 따라서 밀기울을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지에서 24시간 동안에 배양하면서 배양시간별 효소 생산성을 조사하였다. 그 결과 밀기울을 첨가하지 않은 LB 배지에서는 24시간 배양 후 약 2.
- 0)가 사용되었다. 반응온도가 효소활성에 미치는 영향은 반응 pH를 5.5 (50 mM sodium citrate)로 고정하고 반응온도를 달리하여(40-70℃) 효소활성을 측정함으로써 결정하였다.
- 본 연구에서는 이들 균과는 생리적 특성과 효소생산성이 차이가 있는 WL-8 분리균과 mannanase 특성을 비교⋅분석하였다.
- 분리균의 16S rRNA의 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열 5′-TGCCAG CAGCCGCCCTA-3′ (E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열의 515-531 지역), 5′-TTGTACACACCGCCCGTC-3′ (E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열의 1389-1406 지역)을 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다.
- 분리균의 생화학적 특성을 조사하기 위해 배양균체 현탁액을 API 50 CHB kit (bioMéreux, France)를 제조사의 지침에 따라 접종하고 37℃에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 탄소원 이용능을 판별하였다.
- 5 U Pfu polymerase로 구성하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 50초간 반응을 30회 반복하여 16S rRNA를 코드하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여 dye terminator cycle sequencing kit와 373A automate DNA sequencer (Perkin Elmer Co., USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
대상 데이터
- B. subtilis WL-8의 염색체 DNA로부터 재료 및 방법에서 언급한 방법으로 mannanase 유전자를 클로닝한 결과 LBG 분해환을 보이는 형질전환주를 1주 선발하였다. 대장균 형질전환 주에서 플라스미드를 분리하고 클로닝된 DNA 단편(4 kb) 중 mannanase 유전자를 포함하는 1,373 bp 길이의 DNA 염기서열을 결정한 후 ORF를 조사하였다.
이론/모형
- LB 액체배지에서 배양한 B. subtilis WL-8 균체로부터 총 염색체 DNA를 분리하기 위해서는 Genomic DNA prep kit (Solgent, Korea), 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위해서는 Plasmid Mini-prep kit (Solgent)를 각각 제조사의 지침에 따라 사용하였다. Mannanase 유전자를 클로닝하기 위해 분리된 염색체 DNA를 PstI으로 절단하고 크기가 약 1.
- Mannanase 활성은 LBG을 기질로 하여 효소 반응 후에 유리된 환원당을 3, 5-dinitrosalicylic acid 방법으로 다음과 같이 정량함으로써 측정하였다. 증류수에 현탁 시킨 1% (w/v) LBG 용액 0.
- 2% congo red 용액으로 1시간 염색하고 1 M NaCl 용액으로 탈색하여 형질전환주 집락 주변에 분해환을 관찰함으로써 mannanase 유전자가 클로닝된 형질전환주를 선별하였다. 염기서열은 클론된 유전자를 제한효소로 적절한 크기로 절단하여 얻은 단편을 pUC19에 도입함으로써 재조합 플라스미드를 제조한 후, 이를 주형 DNA로 하고 M13 universal primer와 reverse primer를 사용하여 dideoxy-chain termination 방법으로 결정하였다.
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