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문제 정의
- 향장 원료로써 가치 평가가 미흡한 Spirulina maxima는 종래 고온 열수 추출에 의한 수율이 낮아 활성 물질의 활용 극대화가 어렵고 에너지 소비가 많으며, 열로 인해 많은 유용 성분의 파괴, 단백질 변성, 가용성분 위주의 추출과 열에 대한 불안정성 등의 어려움이 있었다. 그러나 본 논문의 목적은 이러한 단점을 극복하고자 함에 있다. 향장 원료로서 Spirulina maxima의 가치를 최대한 높이기 위해 저온·초고압 처리를 통해 물질의 중요 구성 성분의 손실을 최대한 줄이고 단시간 내에 분리 가능하였다.
- 특히 고체화를 오랜 시간 유지 할 수 있고 불순물이 거의 없는 향상된 추출 수율 증가를 통해 고순도의 단일 성분을 간편하게 획득할 수 있었다. 그러므로 본 연구는 유용 활성 추출물의 증진에 의한 항산화 작용과 면역 증진의 관계를 규명하였다는데 그 의의가 있으며, 이는 높은 향장 활성의 유지가 피부 면역 증진의 작용을 높게 일으키는 결과로 나타났다. 따라서 저온·초고압 처리 시, 높은 순도의 단일 구성 성분의 추출이 단시간 내에 가능하고 세포막이 비가역적으로 분해되어 막 투과성이 증가되어 용매가 세포 안으로 들어가 보다 많은 종류의 유용 활성 성분이 용출되어 이의 활성에 의한 항산화 및 면역 증강 효과를 가져와 피부 면역 증진이 이루어졌다.
- 이 연구는 향장 원료로서 S. maxima의 가치를 최대한 높이기 위해 저온·초고압 처리 방법(Jin et al. 2009)을 이용, 물질의 중요 구성 성분의 손실을 최소화 하고 단시간 내에 분리 가능하도록 하였는데 그 목적이 있다.
- 2009)을 이용, 물질의 중요 구성 성분의 손실을 최소화 하고 단시간 내에 분리 가능하도록 하였는데 그 목적이 있다. 특히 고체화를 오랜 시간 유지 할 수 있고 불순물이 거의 없는 향상된 추출 수율 증가를 통해 고순도의 단일 성분을 간편하게 획득할 수 있는 방법을 제시하고 유용 활성 추출물의 증진에 의한 항산화 작용과 면역 증진의 관계를 규명을 통한 피부 면역 증진의 효과를 입증함으로써, 화장품 원료로의 이용 가치를 높이고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite 를 사용하였으며, 농도는 32 µM에서부터 0.25 µM까지 RPMI 1640 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다(Choi et al. 2006).
- Spirulina maxima의 유용 생리 활성 물질을 파악하기 위해, 각 추출물을 4.5 µm filter paper로 filtering 후, HPLC (Hewlett Packard HP1100, USA)에 의해 분석되었다.
- Spirulina maxima의 향장 원료로서 피부 면역에 미치는 효능을 찾기 위해 UV를 이용하여 인간 fibroblast인 CCD-986sk를 자극함으로써 PGE2 생성량을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다.
- 전자공여능(%)은 [(1−As/ Ac)×100]으로 나타내었고, As와 Ac에 실험군과 대조군의흡광도 값을 각각 대입하여 계산하였다. 그리고 항산화제인 butylated hydroxy anisole(BHA)의 활성을 조사하여본 실험의 추출물과의 비교를 실시하였다.
- 다음 세포 현탁액과 시료를 96 well 세포 배양관의 각각 well에 20 µl씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 UV 등에 필터를 이용하여 UVA(6.3 J/cm2)를 조사하였다.
- 대식세포의 NOS(nitric oxide synthase)는 항상 존재하는 것이 아니라, TNF-γ, TNF-α 와 같은 여러 가지 cytokine이나 LPS(E. coli 유래 lipopolysaccharide) 등 세균내독소의 영향을 받아 NOS 유전자가 발현 유도됨으로써 나타나기 때문에 이를 확인하고자 S. maxima 시료와 LPS를 단독 및 병합 투여함으로써 NO의 생성능을 확인하였다.
- 따라서 저온·초고압 처리 시, 높은 순도의 단일 구성 성분의 추출이 단시간 내에 가능하고 세포막이 비가역적으로 분해되어 막 투과성이 증가되어 용매가 세포 안으로 들어가 보다 많은 종류의 유용 활성 성분이 용출되어 이의 활성에 의한 항산화 및 면역 증강 효과를 가져와 피부 면역 증진이 이루어졌다.
- maxima의 향장 원료로서 매우 높은 가치를 결과로서 입증하였다. 또한 기존의 추출방법보다 향상된 유용 생리활성물질의 추출물 수율 증가 등을 HPLC 분석법 등을 통해 증명하였다.
- 상등액 50 µg을 취하여 동일 부피의 Griess시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihtdrochloride/2.5% h3po4)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 540 nm의 흡광도를 측정하였다.
- 세포독성은 3-(4,5-dimethythazo-2-yl)-2,5-dipheny-tetrazoliumbromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann 방법(Mosmann 1983)을 변형하였다. CCD986sk 세포를 2×104 cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후, 각 well에 70-80% confluency 배양 시점에 시료를 투여하여 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
- 이 현탁액에 aspirin을 50 µM이 되도록 첨가하여 세포에 잔존하는 Cox효소의 활성을 비가역적으로 억제시켜 동일한 PGE2 양이될 수 있도록 조절하였다.
- 인간 fibroblast에 Spirulina maxima 추출물을 0.2-1.0 mg/ml까지 다섯 가지 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, MTT assay로 측정한 세포 독성을 Fig. 1에 나타내 었다. 그림과 같이 각 추출 조건에 따른 추출물 모두 농도의존적으로 세포 독성이 증가하는 모습을 확인 할 수 있으며, 0.
- 전자공여능(%)은 [(1−As/ Ac)×100]으로 나타내었고, As와 Ac에 실험군과 대조군의흡광도 값을 각각 대입하여 계산하였다.
- 본 실험에 사용된 Spirulina maxima 건조 분말은 한국해양연구원(KORDI)으로부터 지원받았다. 초고압 추출은 S. amxima 건조 분말 100 g을 비닐 팩에 물과 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압추출장치(Ilshin autoclave, Daejeon, Korea)를 이용하여 500 Mpa의 압력으로 각각 5분, 15분간 초고압 추출을 시행하였다. 초고압 추출이 끝난 S.
- 추출물의 전자 공여 작용은 각각의 추출물에 대한 DPPH(a,a-diphenyl-picrylhy-drazyl)의 전자공여효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다. 즉, 메탄올 1 ml, 시료 10 µl, 100 mM sodium acetate buffer(pH 5.
- 향장 원료로서 Spirulina maxima의 가치를 최대한 높이기 위해 저온·초고압 처리를 통해 물질의 중요 구성 성분의 손실을 최대한 줄이고 단시간 내에 분리 가능하였다.
대상 데이터
- Human skin fibroblasts(HSFs)인 CCD-986sk(KCLB, No. 21947)와 mouse 유래 대식세포인 J774.1(KCLB, No. 40067)은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)로부터 동결상태로 구입하여 각 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin을 첨가해 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 사용하였다.
- NO 생성량 측정을 위해 사용된 세포주는 마우스 유래 J774.1 대식세포를 사용하였으며, 세포를 10% FBS와 RPMI 1640 배지에 배양하여 24 well plate에 4.5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가한 것과 첨가하지 않은 두 가지 군을 나누어 모두 37℃, 5% CO2 배양기에 48시간 동안 배양한 후 LPS(lipipilysaccharide)를 200 ng/well의 농도로 처리하여 48시간 동안 세포를 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 Spirulina maxima 건조 분말은 한국해양연구원(KORDI)으로부터 지원받았다. 초고압 추출은 S.
- 본 연구에서는 Spirulina종 중, 기존 연구를 통해 많이 알려진 Spirulina platensis와는 달리(Diego et al. 2001; Grinstead et al. 2000; Nandeesha et al. 2001), 식품학적 연구는 많이 이루어졌으나, 향장품으로써 생리활성 효능에 관한 연구가 미흡한 S. maxima를 원료로 하였다. 그러나 S.
- 세포배양에 필요한 시약으로 배지는 RPMI 1640(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 사용하였고, 혈청은 fetal bovine serum(Hyclone, Logan, Utah, USA)을 이용하였다. 그 외에 세포 배양에 필요한 시약으로 Hepes buffer (Sigma), gentamycin sulfate(Sigma), trypsin-EDTA(Sigma)등을 사용하였다.
- 인간 fibroblast인 CCD-986sk 세포를 10% FBS와 DMEM 배지에 현탁하여 1×106 cells/ml로 하였다.
데이터처리
- Each value were compared with control at * p<0.001, **p<0.005, ***p<0.01 by Student t-test.
- 본 연구에서 실험값의 통계는 SPSS package program 의 paired t-test로 검정하였으며 모든 실험값은 평균±표준편차(Mean±standard deviation)로 나타내었다.
이론/모형
- 항산화 활성 측정 방법의 하나인 DPPH radical 소거 능 측정법을 이용하여, S. maxima 추출물의 DPPH radical 소거 활성을 Fig. 3에 나타내었다. S.
성능/효과
- maxima 시료와 LPS를 단독 및 병합 투여한 처리군의 결과를 보면 시료를 단독 투여한 경우 대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다. LPS와 혼합 처리 시에는 LPS 단독 처리보다 월등히 높은 NO 생성량을 보였으며, 초고압 15분 동안 추출물의 경우가장 높은 NO 생성량을 보였다. 이런 결과는 불가사리 유래 콜라겐 펩타이드를 이용한 연구의 NO 생성능 확인한 연구결과 20.
- 8 µM로써 가장 높은 NO 생성량을 보였다. 그러므로 PGE2가 감소함에 따라 NO 생성능은 증가하여 면역 증진을 가져오며, 항산화 활성 역시 높아 피부 면역 증진이 높았다.
- maxima의 모든 추출물은 농도 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있다. 대부분 높은 활성을 보인 초고압 조건의 경우 최대 투여 농도인 1.0 mg/ml에서 93%의 DPPH radical 소거 활성을 보인 5분 처리 시 보다 15분 처리 시 5% 더 높은 활성을 나타내어초고압 처리 시, 처리 시간이 유용 물질의 용출에 미치는 영향을 확인 할 수 있었다.
- 대식세포를 이용한 NO 생성이 염증 억제 작용을 일으키는 것을 확인하기 위해 S. maxima 시료와 LPS를 단독 및 병합 투여한 처리군의 결과를 보면 시료를 단독 투여한 경우 대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다. LPS와 혼합 처리 시에는 LPS 단독 처리보다 월등히 높은 NO 생성량을 보였으며, 초고압 15분 동안 추출물의 경우가장 높은 NO 생성량을 보였다.
- 0 mg/ml에서 1,010 pg/ml으로 가장 낮은 PGE2 값을 나타내었다. 대조군의 자외선 조사 시 세포에서 생합성 되는 PGE2의 양이 자외선 영향이 없는 군에 비해 약 3배 이상 증가하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 UV로 인한 IL-1과 TNF와 같은 cytokine의 분비를 S.
- maxima의 향장 원료로서 피부 면역에 미치는 효능은 시료 무첨가 대조군에 비해 낮은 PGE2 발현도를 나타내었으며, 이 중 초고압 추출물의 경우에 최대농도에서 가장 낮은 PGE2 생성량을 나타내었다. 또한 UV를 조사한 경우에도 시료 무 첨가 대조군에 비해 상대적으로 낮은 PGE2 생성량을 나타냈으며, 초고압 추출물에서 가장 낮은 PGE2 값을 나타내었다. 무첨가 대조군의 세포에서 3배 이상 증가하여 생합성되는 PGE2의 비교 양은 UV로 인한 IL-1과 TNF와 같은 cytokine의 분비를 S.
- 또한 UV를 조사한 경우에도 시료 무 첨가 대조군에 비해 상대적으로 낮은 PGE2 생성량을 나타냈으며, 초고압 추출물에서 가장 낮은 PGE2 값을 나타내었다. 무첨가 대조군의 세포에서 3배 이상 증가하여 생합성되는 PGE2의 비교 양은 UV로 인한 IL-1과 TNF와 같은 cytokine의 분비를 S. maxima의 유용활성 물질이 저해함을 역설적으로 나타낸다. 또한, 불가사리 유래 콜라겐 펩타이드를 이용한 연구에서는 UV를 조사하지 않은 경우와 한 경우 각각 553 pg/ml, 1100 pg/ml으로써, 상대적으로 낮은 PGE2를 나타낸 S.
- 인간 fibroblast에 Spirulina maxima 추출물을 처리하고 세포 독성 측정한 결과를 보면 각 추출 조건에 따라 전체 추출물이 농도 의존적으로 세포 독성이 증가하는 모습을 확인 할 수 있었다. 반면 100℃와 같은 고온 열수 추출시, 조직의 물러짐과 동시에 독성을 나타내는 물질 또한 용출되어 추출물의 독성이 상승되었다. 특히 100℃ 열수 추출물에 비해 초고압 추출물의 경우에는 10.
- (2002)은 씀바귀가 대식세포를 활성화하여 NO를 생성시켜 면역세포 활성에 의한 면역증강 작용으로 강한 효과를 나타내며, 항산화 작용과의 관련성을 잘 나타냈다고 보고 하였다. 본 연구 결과 역시 PGE2이 감소함에 따라 NO 생성능은 증가하여 면역 증진을 가져오며, 항산화 활성 역시 높아 피부 면역 증진이 높았다. 이는 저온·고압 처리 방법 하에서 단백질의 변성, 세포막의 비가역적 분해 등으로막 투과성이 증가되어 물질 이동이 용이해 용매가 세포안으로 들어가 수율 증진과 함께 보다 많은 유용 성분이 세포 밖으로 쉽게 용출되어 나오기 때문으로 판단된다.
- maxima의 수소결합, 전기적 결합, 반데르발스 결합의 약화로 높은 항산화 물질이 용출이 가능하였음을 확인 할 수 있는 것이다. 앞선 PGE2의 생성 억제 패턴과 반대로 활성 산소를 제거하는 항산화 활성은 증가하는 반비례 관계를 확인 할 수 있었다. 이는 항산화 기능이 세포의 항상성을 유지하게 하는 면역력이 증가됨을 입증하는 결과(Chung et al.
- 앞선 연구 결과 S. maxima는 향장 원료로써 가치가 매우 높음을 확인하였으며, 특히, 기존 고온 열수 추출보다 저온 초고압추출 기술에 의한 유용 생리 활성 물질의 추출물 수율 증가에 의한 면역 및 항산화 활성 증진에 따른 피부 면역 증진을 나타내었으며, 이는 Fig. 5의 HPLC를 통해 확인 할 수 있다. Fig.
- 이러한 추출기법의 연구결과 중, S. maxima로부터 용출된 물질의 활성 정도의 증거로서 세포독성, 자외선으로 인한 Prostaglandin E2(PGE2)생성량 측정, DPPH radical 소거 활성, Macrophage를 이용한 nitric oxide (NO) 생성량 측정 등을 통해 S. maxima의 향장 원료로서 매우 높은 가치를 결과로서 입증하였다. 또한 기존의 추출방법보다 향상된 유용 생리활성물질의 추출물 수율 증가 등을 HPLC 분석법 등을 통해 증명하였다.
- 2009). 이번 연구로 기존의 열수 추출 방법으로는 용출되어지지 않았던 성분들이 초고압 처리에 의해 조직과 세포막의 변형으로 용매 침투가 쉬워짐으로써 단시간 내에 용출량이 증가한 것으로 판단된다. 그러므로 저온·고압 추출을 통해 이러한 결합들이 분리되어 신물질의 용출이 가능한 것으로 보인다.
- 이번 연구에서 DPPH radical 소거능 측정에 의한 항산화 활성 측정 결과를 보면 S. maxima의 모든 추출물은 농도 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있었고, 대부분 높은 활성을 보인 초고압 조건의 경우 5분 처리 시 보다 15분 처리 시 5% 더 높은 활성을 나타내어 처리 시간이 유용물질의 용출에 미치는 영향을 확인 할 수 있었다. S.
- 그러나 아직 세포내 어떤 경로를 통해 증식이 억제되는지 알려진 바가 없다. 이번 연구에서 S. maxima의 향장 원료로서 피부 면역에 미치는 효능은 시료 무첨가 대조군에 비해 낮은 PGE2 발현도를 나타내었으며, 이 중 초고압 추출물의 경우에 최대농도에서 가장 낮은 PGE2 생성량을 나타내었다. 또한 UV를 조사한 경우에도 시료 무 첨가 대조군에 비해 상대적으로 낮은 PGE2 생성량을 나타냈으며, 초고압 추출물에서 가장 낮은 PGE2 값을 나타내었다.
- 이러한 구조로 인하여 종종 유용 물질의 침투를 제한하기도 하여 유용 생리 활성 물질의 용출이 어려웠다. 이번 연구에서 추출 공정에 따른 추출수율은 Table 1에서볼 수 있듯이 500 Mpa 이하의 초고압 추출 조건에서 가장 높은 추출 수율 뿐만이 아니라 추출 시간도 단축됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 S.
- 8%로써 낮은 세포독성을보였다. 이와 같이 S. maxima 시료 모두 최고 농도에서 19% 이하로, 세포수준에서 유의할만한 세포독성을 나타내지 않아, 향장 원료로써 이용 가능성을 확인하였다.
- 3% 낮은 세포독성을 보였다. 이와 같이 S. maxima 시료 모두 최고 농도에서 19% 이하로, 세포수준에서 유의할만한 세포독성을 나타내지 않아, 향장 원료로써 이용 가능성을 확인했다.
- 인간 fibroblast에 Spirulina maxima 추출물을 처리하고 세포 독성 측정한 결과를 보면 각 추출 조건에 따라 전체 추출물이 농도 의존적으로 세포 독성이 증가하는 모습을 확인 할 수 있었다. 반면 100℃와 같은 고온 열수 추출시, 조직의 물러짐과 동시에 독성을 나타내는 물질 또한 용출되어 추출물의 독성이 상승되었다.
- 향장 원료로서 Spirulina maxima의 가치를 최대한 높이기 위해 저온·초고압 처리를 통해 물질의 중요 구성 성분의 손실을 최대한 줄이고 단시간 내에 분리 가능하였다. 특히 고체화를 오랜 시간 유지 할 수 있고 불순물이 거의 없는 향상된 추출 수율 증가를 통해 고순도의 단일 성분을 간편하게 획득할 수 있었다. 그러므로 본 연구는 유용 활성 추출물의 증진에 의한 항산화 작용과 면역 증진의 관계를 규명하였다는데 그 의의가 있으며, 이는 높은 향장 활성의 유지가 피부 면역 증진의 작용을 높게 일으키는 결과로 나타났다.
- 특히, 100℃ 열수 추출물의 경우 최대 농도인 1.0 mg/ml에서 18.6%의 가장 높은 세포 독성을 나타냈으며, 5, 15분 조건의 초고압 추출물의 경우 최대 농도인 1.0 mg/ml에서 각각 16.9%, 13.8%로써 낮은 세포독성을보였다.
- 특히, 기존 고온 열수 추출보다 저온 초고압추출 기술에 의한 유용 생리 활성 물질의 추출물 수율 증가에 의한 면역 및 항산화 활성 증진에 따른 피부 면역 증진을 나타내었다. 높은 항상화 활성의 선행 연구(Jeong et al.
후속연구
- 따라서 저온·초고압 처리 시, 높은 순도의 단일 구성 성분의 추출이 단시간 내에 가능하고 세포막이 비가역적으로 분해되어 막 투과성이 증가되어 용매가 세포 안으로 들어가 보다 많은 종류의 유용 활성 성분이 용출되어 이의 활성에 의한 항산화 및 면역 증강 효과를 가져와 피부 면역 증진이 이루어졌다. 이러한 S. maxima 향장 활성 증진에 관한 연구 결과는 최초로 상당히 가치 있는 학술적, 산업적 기초연구 자료가 될 것이다.
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