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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우리 쌀밥에 존재하는 식중독 유발세균인 B. cereus group의 분포와 그의 독소 특성을 분석평가하여 쌀밥의 안전관리에 활용될 기초자료를 확보하는 것을 목적으로 하였다.
- 쌀밥에서 분리된 MYP 선택배지의 분홍색 콜로니 B. cereus group로부터 B. cereus, B. thuringiensis를 선별 동정하고자 하였다. 이는 gyrB, cry primer를 활용한 multiplex PCR을 수행하여 B.
제안 방법
- B. cereus와 B. thuringiensis에서 4개의 설사형독소와 구토형 독소유전자를 PCR로 선별동정하였다. PCR은 hblA 유전자의 검출을 위해 5 cycles로 70℃에서 1분, 72℃에서 1.
- Enterotoxin T 독소의 검출을 위해 bceT 유전자를 target으로 하는 ETF, ETR primer를 사용하였으며, PCR은 35 cycles로 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 20초를 수행하였다(27). Cytotoxin K 독소의 검출을 위해 cytK 유전자를 target으로 하는 F2, R7 primer를 사용하였으며, PCR은 30 cycles로 95℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 1분을 수행하였다(28). 구토형 독소를 검출을 위해 ces 유전자를 target으로 하는 CesF1, CesR2 primer를사용하였으며, PCR은 95℃에서 15분, 5 cycles로 95℃에서 1분, 53℃에서 75초, 72℃에서 50초, 25 cycles로 95℃에서 1분, 58℃에서 75초, 72℃에서 50초, 마지막으로 72℃에서 5분을 수행하였다(29).
- Nonhemolytic enterotoxin의 검출을 위해 nheA 유전자를 target으로 하는 nheA344S, nheB843A primer를 사용하였으며, PCR은 30 cycles로 94℃에서 15초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2분을 수행하였다(27). Enterotoxin T 독소의 검출을 위해 bceT 유전자를 target으로 하는 ETF, ETR primer를 사용하였으며, PCR은 35 cycles로 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 20초를 수행하였다(27). Cytotoxin K 독소의 검출을 위해 cytK 유전자를 target으로 하는 F2, R7 primer를 사용하였으며, PCR은 30 cycles로 95℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 1분을 수행하였다(28).
- 이 인산완충 희석액을 사용하여 10−2에서 10−6까지 10배 단계 희석하여 시료를 조제하였다. MYP 한천평판배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 단계별 희석용액 0.2 mL씩 5개에 도말하여총 접종액이 1 mL이 되게 한 후 30℃에서 24시간 배양한 후 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락을 계수하였다. 계수한 평판에서 전형적인 집락을 선별하여 PCA 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성, catalase, 긴 형태의 간균으로 확인된 균은 운동성, β-hemolysis, 혐기배양시 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시하였다(3,23).
- 일차적으로 간단한 생화학적인 특성을 분석하고 다시 분리된 균을 API CHB50, VITEK2 Rapid identification system(BioMrieux), 그리고 PCR를 사용하여 동정하였다. MYP상에서 노란색 콜로니 등을 나타내는 균체의 경우 API CHB50, VITEK2를 이용하고 분홍색 콜로니를 나타내는 균주의 경우 B. cereus group으로 간주하고 곧바로 PCR의 방법을 이용했다. API kit는 생화학테스트 결과를 API web에서 확인하였고 ID%의 경우 95%이상의 결과를 나타냈다.
- 5 μg/mL ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel로 전기영동한 후 UV transilluminator(Seolin Biotech)에서 밴드를 확인하였다. Nonhemolytic enterotoxin의 검출을 위해 nheA 유전자를 target으로 하는 nheA344S, nheB843A primer를 사용하였으며, PCR은 30 cycles로 94℃에서 15초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2분을 수행하였다(27). Enterotoxin T 독소의 검출을 위해 bceT 유전자를 target으로 하는 ETF, ETR primer를 사용하였으며, PCR은 35 cycles로 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 20초를 수행하였다(27).
- PCR 산물은 0.5% TAE buffer에 0.5 μg/mL ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel로 전기영동한 후 UV transilluminator(Seolin Biotech)에서 밴드를 확인하였다.
- PCR 산물은 0.5% TAE buffer에 0.5 μg/mL ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel로 전기영동한 후 UV transilluminator(Seolin Biotech, Suwon, Korea)에서 amplicon을 확인하였다.
- thuringiensis에서 4개의 설사형독소와 구토형 독소유전자를 PCR로 선별동정하였다. PCR은 hblA 유전자의 검출을 위해 5 cycles로 70℃에서 1분, 72℃에서 1.5분, 30 cycles로 94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 1.5분, hblCD 유전자의 검출을 위해 36 cycles로 94℃에서 30초, 54℃에서 1분, 72℃에서 1분을 각각 수행하였다(26). PCR 산물은 0.
- PCR을 이용하여 hemolysin BL(HBL), non-hemolytic enterotoxin (Nhe), enterotoxin T(BceT), cytotoxin K(CytK), emetic toxin (Ces)(Fig. 1)의 존재유무를 각각의 primer를 사용하여 분석하였다. 현재까지 설사형 식중독은 HBL, Nhe toxin이 주로 유발시키고 구토형 식중독은 Ces toxin(cerulide)이 유발하는 것으로 알려져 있다(20).
- 계수한 평판에서 전형적인 집락을 선별하여 PCA 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성, catalase, 긴 형태의 간균으로 확인된 균은 운동성, β-hemolysis, 혐기배양시 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시하였다(3,23).
- Cytotoxin K 독소의 검출을 위해 cytK 유전자를 target으로 하는 F2, R7 primer를 사용하였으며, PCR은 30 cycles로 95℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 1분을 수행하였다(28). 구토형 독소를 검출을 위해 ces 유전자를 target으로 하는 CesF1, CesR2 primer를사용하였으며, PCR은 95℃에서 15분, 5 cycles로 95℃에서 1분, 53℃에서 75초, 72℃에서 50초, 25 cycles로 95℃에서 1분, 58℃에서 75초, 72℃에서 50초, 마지막으로 72℃에서 5분을 수행하였다(29).
- 계수한 평판에서 전형적인 집락을 선별하여 PCA 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성, catalase, 긴 형태의 간균으로 확인된 균은 운동성, β-hemolysis, 혐기배양시 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시하였다(3,23). 그리고 MYP배지에서 분홍색콜로니를 제외한 나머지 균들도 분리하여 간단한 생화학적인 분석과 아울러 동정하였다. 동정은 TSA한천배지(Difco)에서 계대한 후 VITEK2TM(BioMrieux, Marcy l’Etoile, France) 혹은 API kitTM (BioMrieux)으로 동정하였다.
- 동정은 TSA한천배지(Difco)에서 계대한 후 VITEK2TM(BioMrieux, Marcy l’Etoile, France) 혹은 API kitTM (BioMrieux)으로 동정하였다.
- 5분, 마지막으로 72℃에서 7분을 수행하였다. 또한 결정체 독소를 갖고 있는 B. thuringiensis만의 특성을 이용하여 cry 유전자를 target으로 하는 K3, K5 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다(25). PCR은 gene cycler(BioRad, Hercules, CA, USA)로 25 cycles로 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 72℃에서 1.
- 쌀밥의 미생물 안전성을 평가하기 위하여 쌀을 취반한 후 세균을 분석하였다. 전국에서 생산되는 생쌀 30개를 수집하여 취반 후에 중온성 호기성균과 MYP선택배지에서 Bacillus cereus group를 분리 동정하여 그의 분포도와 독소유전자를 분석하였다.
- 이 인산완충 희석액을 사용하여 10−2에서 10−6까지 10배 단계 희석하여 시료를 조제하였다.
- cereus group를 분리하였다. 일차적으로 간단한 생화학적인 특성을 분석하고 다시 분리된 균을 API CHB50, VITEK2 Rapid identification system(BioMrieux), 그리고 PCR를 사용하여 동정하였다. MYP상에서 노란색 콜로니 등을 나타내는 균체의 경우 API CHB50, VITEK2를 이용하고 분홍색 콜로니를 나타내는 균주의 경우 B.
- 쌀밥의 미생물 안전성을 평가하기 위하여 쌀을 취반한 후 세균을 분석하였다. 전국에서 생산되는 생쌀 30개를 수집하여 취반 후에 중온성 호기성균과 MYP선택배지에서 Bacillus cereus group를 분리 동정하여 그의 분포도와 독소유전자를 분석하였다. 취반 직후의 쌀밥 27%에서 1-3 log CFU/g정도의 총 중온성 호기균과거의 같은 정도로의 Bacillus spp.
- 전기밥솥에서 취반을 한 후 밥을 상온에서 약 1-2시간 식힌 후 총균수와 B. cereus group의 분포를 분석하였다. 30개의 쌀밥시료로 부터 미생물을 12시간 이상 배양한 배지에서 검출한 결과 균이 검출되지 않은 것부터 최대 3 log 규모까지 균수가 나타났다.
- 멸균 spatula로 쌀밥 25 g을 골고루 무균백에 무균적으로 채취하고, buffered peptone water(BPW) 225 mL(Oxoid, Hamlshire, UK)를 넣어 균질기(IUL, Barcelona, Spain)로 교반하였다. 총 균수를 계수하기 위하여 plate count agar(PCA) (Oxoid)에 101,3,5까지 멸균 인산완충 희석액으로 희석하여 도말한후 37℃ 항온조에서 12-24시간 배양한 후 콜로니를 계수하였다.
대상 데이터
- 본 연구를 수행하기 위하여 전국에서 생산되고 있는 쌀 30종을 수집하였다. 경기도 8종, 강원도 2종, 충북 2종, 충남 3종, 전북 7종, 전남 5종, 경북 3종 등이었으며 품종별로는 일반계 11종, 고시히카리 4종, 추청 7종, 새추청 1종, 기타 7종이었다.
- 이들은 모두 도정미(9분도)이었고 3-4월에 수집하였다. 전국 각지에서 수집된 쌀을 수돗물로 2회 고르게 수세한 후 일반 취반기로 취반 하였다. 취반 직후 밥통을 외부로 옮겨서 1-2시간 상온에 방치하여 온도를 낮추었다.
성능/효과
- cereus group의 분포를 분석하였다. 30개의 쌀밥시료로 부터 미생물을 12시간 이상 배양한 배지에서 검출한 결과 균이 검출되지 않은 것부터 최대 3 log 규모까지 균수가 나타났다. 30개의 쌀밥중 8개의 시료(27%)에서 총균수가 1-3 log CFU/g 규모로 검출되었고 22개의 시료에서는 균이 검출되지 않았다.
- 30개의 쌀밥시료로 부터 미생물을 12시간 이상 배양한 배지에서 검출한 결과 균이 검출되지 않은 것부터 최대 3 log 규모까지 균수가 나타났다. 30개의 쌀밥중 8개의 시료(27%)에서 총균수가 1-3 log CFU/g 규모로 검출되었고 22개의 시료에서는 균이 검출되지 않았다. 그리고 B.
- pumilus, Brevibacillus laterosporus에서 관찰되었다. 37개의 분리 균주 중 50%이상인 20개(54%)의 분리주가 B. thuringiensis로 나타났고 그 다음으로 9개(27%) 분리주는 B. cereus이였다. 그리고 3균주(8%)의 B.
- cereus group으로 간주하고 곧바로 PCR의 방법을 이용했다. API kit는 생화학테스트 결과를 API web에서 확인하였고 ID%의 경우 95%이상의 결과를 나타냈다. VITEK2의 경우 얻어낸 결과 중 ID%가 최소 85% 이상인 결과만을 선정하여 다음 실험으로 이어 진행했다.
- licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Brevibacillus laterosporus이였다. B. thuringiensis는 모두에서 non-hemolytic toxin gene(nhe)을 가지고 있었고 9개의 B. cereus중 7균주가 emetic toxin 유전자를 함유하고 있었다. 따라서 쌀밥에는 B.
- 본 연구를 수행하기 위하여 전국에서 생산되고 있는 쌀 30종을 수집하였다. 경기도 8종, 강원도 2종, 충북 2종, 충남 3종, 전북 7종, 전남 5종, 경북 3종 등이었으며 품종별로는 일반계 11종, 고시히카리 4종, 추청 7종, 새추청 1종, 기타 7종이었다. 이들은 모두 도정미(9분도)이었고 3-4월에 수집하였다.
- cereus group 선택배지 MYP에서의 계수결과도 8개의 시료 (27%)에서 균이 검출되었으며 1-3 log 규모의 Bacillus가 분포가 되어 있는 것으로 분석되었다. 그러나 MYP에서 균이 검출되지 않은 시료들도 증균한 후에는 Bacillus 균들이 검출되었는데 약 80%의 시료인 23개에서 Bacillus가 분포하고 있는 것을 알 수가 있었다. 그리고 총균수 계수 결과와 B.
- cereus이였다. 그리고 3개(8%)의 B. valismortis와 각각 1개(3%)의 B. pumilus, B. coagulans, B. licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Brevibacillus laterosporus이였다. B.
- 30개의 쌀밥중 8개의 시료(27%)에서 총균수가 1-3 log CFU/g 규모로 검출되었고 22개의 시료에서는 균이 검출되지 않았다. 그리고 B. cereus group 선택배지 MYP에서의 계수결과도 8개의 시료 (27%)에서 균이 검출되었으며 1-3 log 규모의 Bacillus가 분포가 되어 있는 것으로 분석되었다. 그러나 MYP에서 균이 검출되지 않은 시료들도 증균한 후에는 Bacillus 균들이 검출되었는데 약 80%의 시료인 23개에서 Bacillus가 분포하고 있는 것을 알 수가 있었다.
- cereus중 7균주가 emetic toxin 유전자를 함유하고 있었다. 따라서 쌀밥에는 B. thuringiensis가 B. cereus보다더 높은 빈도로 분포되어 있고 B. cereus는 설사형 독소유전자 보다는 구토형 독소를 더 많이 가지고 있었다. 취반 후 쌀밥을 상온에서 보관하여 발생되는 B.
- thuringiensis로 확인되었다(37). 본 연구에서는 B. thuringiensis가 B. cereus보다 약 2배나 더 많이 검출되었는데 국가별 혹은 식품별 B. cereus와 B. thuringiensis간의 상대적인 분포비율은 차이가 있는 것으로 보인다. 이러한 B.
- valismortis와 나머지 균들은 1개(3%)씩으로 동정되었다. 분리 균주 대부분이 B. cereus group으로 식중독을 유발할 수 있는 세균으로 분석되었고 분리된 B. cereus 9균주중 B. cereus 16번 균주만 다른 분리 B. cereus와 다른 당자화성을 보여주었다(Table 4). B.
- licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Brevibacillus laterosporus 등으로 나타났다. 분리 균주중 20개(54%)의 분리주가 B. thuringiensis로 나타났고 그 다음으로 9개(27%)의 B. cereus이였다. 그리고 3개(8%)의 B.
- 이들 30개의 쌀밥으로부터 MYP배지에서 37균주를 분리하였고 이 분리균주를 동정하였는데, 이들은 B. thuringiensis, B. cereus, B. valismortis, B. pumilus, B. coagulans, B. licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Brevibacillus laterosporus 등으로 나타났다(Table 3). 이들은 모두 Gram(양성), catalase(양성) 이었고 용혈활성은 B.
- 가 분포하고 있는 것을 알 수 있었다. 이들 시료로부터 37개의 분리하여 동정한 균주는 B. thuringiensis, B. cereus, B. valismortis, B. pumilus, B. coagulans, B. licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Brevibacillus laterosporus 등으로 나타났다. 분리 균주중 20개(54%)의 분리주가 B.
후속연구
- 그러므로 이러한 Bacillus에 대한 적절한 정보의 확보는 Bacillus 유발 식중독의 제어와 쌀밥의 안전관리에 기여할 것으로 보인다. 우리는 세계적으로 몇 되지 않은 B.
- 따라서 식중독 유발 Nhe 독소를 많이 함유하고 있는 것으로 보인다. 본 연구의 분리균주중 많은 비율을 차지하고 있는 B. thuringiensis도 식중독유발 유전자 nhe 등을 가지고 있어서 이 유전자가 발현되어 독소가 일정수준 이상 생성되면 식중독을 유발할 수 있을 것으로 보인다.
- 그러므로 이러한 Bacillus에 대한 적절한 정보의 확보는 Bacillus 유발 식중독의 제어와 쌀밥의 안전관리에 기여할 것으로 보인다. 우리는 세계적으로 몇 되지 않은 B. cereus 식품기준규격을 가지고 있는 나라인데 2005년 생식류 등에 B. cereus의 규정이 새롭게 제정(3)된 이후에 이들을 관리하고 있는데 현재 규정되어 있는 법규가 효력을 발휘하기 위해서는 시급히 B. cereus group의 분리동정, 더 정확한 PCR 선별분류와 보다 더 정밀한 생리화학적인 특성을 근거로 한 첨단 기법의 개발 적용이 요구된다.
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