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제안 방법
- 시험군에서는 생쥐의 오른쪽 dorsal skin sites에 anti-DNP IgE를 주사하였고, 대조군에서는 생쥐의 왼쪽 skin sites에 생리식염수를 사용하였다. 48 hr 후에 모든 동물에 evans blue 염료가 주사된 DNP-HSA으로 정맥내로 주사하였다. 피부 알레르기 반응은 염료의 extravasation에 의하여 육안으로 관찰할 수 있게 된다.
- Compound 48/80-induced systemic anaphylaxis 반응의 억제를 평가하기 위하여, 각 시험군 그룹의 각 생쥐에는 생리식염수에 용해시킨 PF-E30를 7일간 0.01-0.5 g/kg BW 로 투여하였으며, 대조군 그룹의 생쥐에는 생리식염수만을 투여하였다. 그리고 각 그룹의 생쥐는 Kim 등(19)의 설명에 따라서 compound 48/80을 8 mg/kg BW로 하여 복막 내 주사를 하였다.
- IgE-dependent cutaneous reaction은 anti-DNP IgE를 피부 내에 주사하여 피부를 감작(sensitizing)시켜 유도하였고, 48시간 뒤에 DNP-HAS를 생쥐 꼬리의 정맥에 주사하였다. 즉, 생쥐에는 PBS에 희석한 0.
- PF-E30 투여에 의한 compound 48/80-induced plasma histamine 방출에 끼치는 능력을 조사하였다. Compound 48/80을 주사하기 1시간 전까지 PF-E30를 7일간 0.
- PF-E30의 in vivo 실험에서 antigens-induced IgE 생산에 미치는 효과를 시험하기 위하여, Bordetella pertussis vaccine(2×109 cell/mouse), ovalbumin(500 µg/mouse) 및 alum(1 mg/mouse)으로 구성된 200 µL antigens으로 면역시킨 후, 생쥐에게 7일동안 PF-E30을 0.01-0.5 g/kg BW으로 투여하였다.
- 각 생쥐에는 꼬리 정맥을 통해 4% Evans blue(1:1)을 함유하는 PBS에 용해한 1 mg DNP-HAS를 주사하였다. challenge하기 전에 PF-E30(0.01-0.5 g/kg BW)를 7일간 투여하였다. 그리고 challenge 30분 후에, 각 생쥐를 희생시키고 dorsal skin을 제거하여 색소 면적을 측정하였다.
- Compound 48/80(8 mg/kg BW)을 전신 systemic fatal allergic reaction inducer로 사용하였다(19). compound 48/80을 생쥐의 복막에 주사한 후, 1 hr동안 모니터링하여 사망율을 평가하였다. Table 2에서 볼 수 있듯이, 100% fatal shock는 대조구로서 200 µL의 생리식염수를 복막내 주사하여 유도되었다.
- 1 µg anti-DNP IgE를 48시간 전에 면도한 4 dorsal skin site 내에 주사하였으며, 각 피부 부위는 지용성 잉크 펜으로 표시하였다. 각 생쥐에는 꼬리 정맥을 통해 4% Evans blue(1:1)을 함유하는 PBS에 용해한 1 mg DNP-HAS를 주사하였다. challenge하기 전에 PF-E30(0.
- 각 혈액은 혼합 antigen을 주사 7일 후에 희생시킨 생쥐의 각 심장으로부터 회수하고, IgE은 4℃에서 15분동안 1500×g에서 원심분리하여 얻은 혈장으로부터 측정하였다.
- 5 g/kg BW)를 7일간 투여하였다. 그리고 challenge 30분 후에, 각 생쥐를 희생시키고 dorsal skin을 제거하여 색소 면적을 측정하였다. Katayama 등(20)의 방법을 근거로 해서, 이 염료를 0.
- 생쥐는 대조군 그룹과 시험군 그룹으로 나누어 10마리씩을 한 실험군으로 하였다. 대조군 그룹에는 생리식염수를, 시험군 그룹에는 생리식염수에 용해시킨 소엽추출물(PF-E30)을 구강 투여하였다.
- 본 연구는 소엽 주정추출물의 로즈마린산 함량을 측정하고, 1형 알레르기 동물실험모델 중 하나인 compound 48/80-induced system 알레르기 및 anti-IgE antibody-induced PCA 반응으로 생쥐에 소엽-30%주정추출물 분말(PF-E30)을 투여하여 항알레르기 효과를 평가하였다. 또한 compound 48/80이나 anti-DNP IgE에 의한 혈장 히스타민 량과 복강 비만세포로부터의 히스타민 방출, 그리고 antigen-induced IgE에 대한 효과를 분석하였다.
- 로즈마린산 정량계산은 표준용액 로즈마린산을 5-1,000 µg/mL으로 하여 구한 검량선을 이용하여 산출하였다.
- 로즈마린산(rosmarinic acid, RA)의 크로마토그래피 피크는 acetonitrile과 2% acetic acid을 이동상으로 사용하여 표준물질의 RT(retention time)와 UV spectra을 비교하여 확인하였다. Fig.
- 본 연구는 소엽 주정추출물의 로즈마린산 함량을 측정하고, 1형 알레르기 동물실험모델 중 하나인 compound 48/80-induced system 알레르기 및 anti-IgE antibody-induced PCA 반응으로 생쥐에 소엽-30%주정추출물 분말(PF-E30)을 투여하여 항알레르기 효과를 평가하였다. 또한 compound 48/80이나 anti-DNP IgE에 의한 혈장 히스타민 량과 복강 비만세포로부터의 히스타민 방출, 그리고 antigen-induced IgE에 대한 효과를 분석하였다.
- 실험은 정해진 규정에 의하여 다루었다. 생쥐는 대조군 그룹과 시험군 그룹으로 나누어 10마리씩을 한 실험군으로 하였다. 대조군 그룹에는 생리식염수를, 시험군 그룹에는 생리식염수에 용해시킨 소엽추출물(PF-E30)을 구강 투여하였다.
- 생쥐에 Bordetella pertussis vaccine(2×109 cell/mouse), ovalbumin(500 µg/mouse)과 alum(1 mg/mouse)으로 구성된 200 µL의 혼합 antigen을 복막내 주사하였다.
- 소엽추출물과 로즈마린산 표준물질은 50%(v/v) ethanol에 용해하여, 0.45 µm filter로 여과하고, PDA 검출기가 장착된 HP1100 Series HPLC system(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)으로 분석하였다.
- 01%였다. 시스템의 정확성을 평가하기 위하여 주변온도에 보관한 시료용액을 일일 3회 및 7일 이상 3회씩 측정하였다. 시험결과로부터 일중 정확성(intra-day precision)은 0.
- Local extravasation는 intravenous antigen challenge을 수반하는 anti-DNP IgE의 피부 주사로 유도하였다. 시험군에서는 생쥐의 오른쪽 dorsal skin sites에 anti-DNP IgE를 주사하였고, 대조군에서는 생쥐의 왼쪽 skin sites에 생리식염수를 사용하였다. 48 hr 후에 모든 동물에 evans blue 염료가 주사된 DNP-HSA으로 정맥내로 주사하였다.
- 알레르기 반응계에서 PF-E30 투여의 영향을 생쥐의 systemic allergy 반응으로 평가하였다. Compound 48/80(8 mg/kg BW)을 전신 systemic fatal allergic reaction inducer로 사용하였다(19).
- 그리고 각 그룹의 생쥐는 Kim 등(19)의 설명에 따라서 compound 48/80을 8 mg/kg BW로 하여 복막 내 주사를 하였다. 이후 과민성 쇼크를 유도한 후 생쥐를 1시간 동안 관찰하고 사망률을 확인하였다.
- 생쥐의 복막 비만세포는 Jippo-Kanemoto 등(21)이 설명한 방법과 같이 분리하였다. 즉, 생쥐를 에테르로 마취시키고 30 mL tyrode buffer B(137 mM NaCl, 5.3 mM glucose, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 0.3 mM NaH2PO4)을 복막강에 주사하고, 복부를 약 90초 동안 부드럽게 마사지하였다. 복막강을 조심스럽게 열고 복막세포를 함유하는 Tyrode buffer B 용액을 파스테르 피펫으로 흡입하여 회수하였다.
- 즉, 생쥐에는 PBS에 희석한 0.1 µg anti-DNP IgE를 48시간 전에 면도한 4 dorsal skin site 내에 주사하였으며, 각 피부 부위는 지용성 잉크 펜으로 표시하였다.
- 처리구의 세포는 PF-E30으로 37℃에서 10분동안 예비 배양시켜 DNP-HAS(1 µg/mL)을 challenge하였다.
- 염료의 흡광도는 UV-1201 spectrophotometer(Shimadzu, Tokyo, Japan)로 620 nm에서 측정하였다. 표준곡선은 Evans blue를 표준용액으로 하여 검량선을 작성하여 산출하였다.
- 혈액을 400×g에서 10분동안 원심분리하여 혈장을 빼낸 후, 히스타민은 Shore 등(23)의 OPA spectroflurometry 방법으로 측정하였다. 형광강도(fluorescent intensity)는 353 nm에서 exciting시키고 438 nm에서 RF-5301 PC spectrofluorometer(Shimadzu, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 정제된 복강 비만세포를 Tyrode buffer A에 재현탁시키고 세포현탁액(2×l05 cells/mL)을 anti-DNP IgE(10 µg/mL)로 6시간동안 감작시켰다.
대상 데이터
- 6주령된 수컷 ICR 생쥐는 Oriental Bio(Seongnum, Korea)에서 구입하여, 일주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 온도와 습도가 조절되는 환경(22±2℃, 상대습도 55±5%, 12 hr light-dark cycle)하에서 시판 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하게 하였다.
- 기질로서 2,2'-azino-bis(3-thylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)를 사용하였다.
- 76 mg/g)보다 높았다. 따라서, 이후 진행되는 실험은 수율이 높게 나온 30% 에탄올로 추출한 샘플(PF-E30)을 사용하였다.
- 로즈마린산 표준물질, anti-DNP IgE, anti-DNP IgE 항체, bovine serum albumin(BSA), DNP-human serum albumin(HSA), a-minimal essential medium(a-MEM), ortho-phthaldialdehyde(OPA), metrizamide, avidineperoxidase, 그리고 Bordetella pertussis vaccine은 Sigma-Adrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. An IgE ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) kit는 BD Bioscience(San Jose, CA, USA)에서, Anti-IgE-capture mAb 및 biotinylated anti-IgE detecting mAb은 PharMingen(San Diego, CA, USA)에서 공급받았다.
- 분리용 용매는 acetonitrile(eluent A)과 2%(v/v) acetic acid(eluent B)를 22:78 비율로 사용하였고 유속은 1.0 mL/min이며, 주입량은 10 µL였다.
- 소엽(Perilla frutescens, PF)은 국내 경상북도 지역에서 재배된 것으로 경동시장(Seoul, Korea)에서 건조한 것을 구입하여, Ball Mill(MM-200, Lab. Corperation, Seoul, Korea) 분쇄기로 분쇄하였고, 80℃에서 10배(1:10 w/v)의 0-70% 주정으로 8시간씩 3회 추출하였다. 각 추출물은 0.
- 각 동결 건조한 소엽추출분말은 사용하기 전까지 −20℃에 보관하였다. 소엽추출분말은 in vivo 또는 in vitro 실험시에는 생리식염수나 Tyrode buffer A(10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin)에 용해하여 사용하였다.
- 컬럼은 260×4.6 nm, 5 µm particle size의 Symmetry 300Å C18(Waters, Milford, MA, USA)으로 30℃에 유지하였고 검출파장은 330 nm으로 하였다.
데이터처리
- 각 실험 결과의 통계분석은 SPSS(statistical package social science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였으며, 모든 결과는 각 실험군의 mean±SD 로 표시하였고, 각 군의 p<0.05 수준으로 ANOVA와 LSD test에 의하여 검정하였다.
이론/모형
- 생쥐의 복막 비만세포는 Jippo-Kanemoto 등(21)이 설명한 방법과 같이 분리하였다. 즉, 생쥐를 에테르로 마취시키고 30 mL tyrode buffer B(137 mM NaCl, 5.
- 각 혈액은 혼합 antigen을 주사 7일 후에 희생시킨 생쥐의 각 심장으로부터 회수하고, IgE은 4℃에서 15분동안 1500×g에서 원심분리하여 얻은 혈장으로부터 측정하였다. 즉, IgE의 정량은 Kim 등(24)이 제시한 방법으로 mouse IgE에 captured goat monoclonal antibody와 biotine이 결합된 mouse IgE에 대한 goat monoclonal antibody와의 결합에 의해 측정되는 biotine/avidine sandwich ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로, PBS/BSA(1%)로 희석한 avidineperoxidase(1/400)가 첨가된 후， 15분 방치 후에 발색 정도를 Titertek Multiscan MC 340(Flow Lab., Helsinki, Finland)을 이용하여 405 nm에서 홉광도를 측정하였다. 기질로서 2,2'-azino-bis(3-thylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)를 사용하였다.
- 혈액을 400×g에서 10분동안 원심분리하여 혈장을 빼낸 후, 히스타민은 Shore 등(23)의 OPA spectroflurometry 방법으로 측정하였다.
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