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문제 정의
- 11-13) 또한, 상기 lignan 성분 중 sesaminol glucoside가 β-amyloid 단백질로 유도된 알츠하이머성 치매 모델에서 개선 효과가 있으며, 이를 포함하는 참깨 추출물이 노화촉진 동물 모델에서 기억력 개선 효과가 있음이 보고된 바 있다.14,15) 하지만 흑지마를 이용한 기억력 증강 효과, 또는 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델에서의 개선 효과에 대한 보고는 아직 이루어진 바 없기 때문에 이에 대한 효과를 in vivo에서 확인하고자 본 연구를 시행하였다.
- 본 실험에서는 흑지마의 기억력 강화에 대한 효과를 수동회피 시험 (passive avoidance task)과 Y-미로 시험 (Y-maze task), 수중미로 시험 (Morris water maze task)을 통해 확인해 보고자 하였으며, 아울러 기억력 감퇴 또는 치매 모델에서의 기억력 개선 효과를 알아보기 위해 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델을 이용하여 같은 방법으로 실험하였다. 또한 흑지마의 기억력 증진효과의 기전을 알아보기 위해 western blot을 이용하여 brain-derived neurotrophic factor (BDNF)의 발현양을 조사하였다.
제안 방법
- − EBS70 및 tacrine은 10% Tween 80에 녹인 후 경구 투여하였고 (5 ml/kg), 대조군에는 10% Tween 80을 같은 용량으로 경구 투여하였다.
- − EBS70이 BDNF의 발현에 미치는 시간대별 영향을 알아보기 위해, EBS70 (200 mg/kg) 투여 30분, 1시간, 2시간, 그리고 4시간 후에 마우스를 희생시켜 대뇌를 적출 후 해마를 분리하여 western blot sample을 얻었다.
- 학습 시험 (acquisition trial)이 끝난 지 24시간 후에 장기기억에 미치는 EBS70의 효과를 확인하고자 수동회피 시험을 시행하였다. 10초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 방으로 마우스의 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간 (latency time; 머무름 시간)을 600초까지 측정하였고, scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델에서는 300초까지 측정하였다. 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.
- 19) 행동실험에서의 효과용량인 200 mg/kg의 EBS70을 마우스에게 투여하고 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 그리고 4시간 후 마우스를 희생시켜 western blot sample을 얻어 분석하였다. 실험 결과, EBS70 투여에 의해 BDNF의 발현양이 군간 유의적 차이를 나타내었으며, 특히 EBS70 투여 4시간 후의 BDNF 발현양은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다 (P<0.
- EBS70 투여에 의한 정상 쥐에서의 기억력 강화 효과 여부와 scopolamine (1 mg/kg, i.p.)을 투여한 기억력 감퇴 동물모델에서 EBS70이 기억력 손상을 억제하는 효과가 있는지 여부를 수동회피 측정 장치를 이용하여 확인하였다.
- For the study of the effect of EBS70 alone, EBS70 (200 mg/kg) was administered 1 h before each training trial sessions. For the investigation of EBS70 on the scopolamine-induced memory deficit model, mice were treated with EBS70 (200 mg/kg) or tacrine (10 mg/kg) 1 h before each training trial sessions. Memory impairment was induced by scopolamine treatment (1 mg/kg, i.
- Effects of EBS70 alone (A) and EBS70 with scopolamine (B) in the passive avoidance task. For the study of the effect of EBS70 alone, EBS70 (50, 100, 200 or 400 mg/kg) was administered 1 h before the acquisition trials. For the investigation of EBS70 on the scopolamine-induced memory deficit model, mice were treated with EBS70 (100, 200 or 400 mg/kg) or tacrine (10 mg/kg) 1 h before the acquisition trial.
- Effects of EBS70 alone (A, B) and EBS70 with scopolamine (C, D) in the Y-maze task. For the study of the effect of EBS70 alone, EBS70 (50, 100, 200 or 400 mg/kg) was administered 1 h before the test. For the investigation of EBS70 on the scopolamine-induced memory deficit model, mice were treated with EBS70 (100, 200 or 400 mg/kg) or tacrine (10 mg/kg) 1 h before the test.
- 실험 장치는 검정색의 polyvinyl plastic으로 구성하였다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이 때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다.
- − EBS70 및 tacrine은 10% Tween 80에 녹인 후 경구 투여하였고 (5 ml/kg), 대조군에는 10% Tween 80을 같은 용량으로 경구 투여하였다. 경구 투여 60분 후에 행동 실험을 실시하였는데, 단 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델을 이용하여 실험 할 때에는 추가로 경구 투여 30분 후에 증류수에 녹인 scopolamine을 1 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 방에 놓고 10초간 탐색시킨 후 길로틴문 (guillotin door)을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하였다 (Gemini Avoidance System, San Diego, USA).
- 단백질의 정량은 Western blotting ECL kit (Amersham Co., England)를 사용하여 실시하였으며, 단백질 (30 µg)을 SDS-polyacrylamide gel (12%)에 reducing condition에서 전기 영동하였다.
- 본 실험에서는 흑지마의 기억력 강화에 대한 효과를 수동회피 시험 (passive avoidance task)과 Y-미로 시험 (Y-maze task), 수중미로 시험 (Morris water maze task)을 통해 확인해 보고자 하였으며, 아울러 기억력 감퇴 또는 치매 모델에서의 기억력 개선 효과를 알아보기 위해 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델을 이용하여 같은 방법으로 실험하였다. 또한 흑지마의 기억력 증진효과의 기전을 알아보기 위해 western blot을 이용하여 brain-derived neurotrophic factor (BDNF)의 발현양을 조사하였다.
- 경구 투여 60분 후에 행동 실험을 실시하였는데, 단 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델을 이용하여 실험 할 때에는 추가로 경구 투여 30분 후에 증류수에 녹인 scopolamine을 1 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 방에 놓고 10초간 탐색시킨 후 길로틴문 (guillotin door)을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하였다 (Gemini Avoidance System, San Diego, USA). 각 방의 구획은 20×20×20 cm의 공간이다.
- 수중미로 시험은 원형 pool (직경 90 cm, 높이 45 cm)안에 물을 30 cm 높이로 채우고(23±2℃), 수조 4분면의 한 구획에 직경 10 cm의 도피대 (escape platform)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하고 검은색 식용색소를 풀어 도피대가 보이지 않게 하였다.
- 실험동물이 platform에 도달하면 5초 동안 platform에 머물도록 하였으며, 최대 시간 안에 platform을 찾지 못할 경우에는 10초 동안 platform에 머물도록 하여 platform을 기억하도록 하였다. 실험 5일째에는 원형 pool에서 platform을 제거하고, 120초동안 그것을 찾게 하는 probe test를 실시하였다. 이 test에서는 원형 pool을 네 구역으로 나눴을 때, platform이 있던 사분면 안에서 머무는 시간 (explorating time in target quadrant)을 기록하였다.
- 수중미로 시험은 원형 pool (직경 90 cm, 높이 45 cm)안에 물을 30 cm 높이로 채우고(23±2℃), 수조 4분면의 한 구획에 직경 10 cm의 도피대 (escape platform)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하고 검은색 식용색소를 풀어 도피대가 보이지 않게 하였다. 실험 첫날은 platform 없이 수조안에서 실험동물이 60초간 자유롭게 수영하도록 하였고, 4일 동안 매일 입수하는 사분면을 달리하여 기억력 증진 실험에서는 한 사분면당 1회씩, 최대 60초까지 (scopolamine 으로 유도시킨 기억력감퇴 모델에서는 최대 120초까지) 인지적응 훈련을 하였다. 실험동물이 platform에 도달하면 5초 동안 platform에 머물도록 하였으며, 최대 시간 안에 platform을 찾지 못할 경우에는 10초 동안 platform에 머물도록 하여 platform을 기억하도록 하였다.
- 실험 첫날은 platform 없이 수조안에서 실험동물이 60초간 자유롭게 수영하도록 하였고, 4일 동안 매일 입수하는 사분면을 달리하여 기억력 증진 실험에서는 한 사분면당 1회씩, 최대 60초까지 (scopolamine 으로 유도시킨 기억력감퇴 모델에서는 최대 120초까지) 인지적응 훈련을 하였다. 실험동물이 platform에 도달하면 5초 동안 platform에 머물도록 하였으며, 최대 시간 안에 platform을 찾지 못할 경우에는 10초 동안 platform에 머물도록 하여 platform을 기억하도록 하였다. 실험 5일째에는 원형 pool에서 platform을 제거하고, 120초동안 그것을 찾게 하는 probe test를 실시하였다.
- 실험 5일째에는 원형 pool에서 platform을 제거하고, 120초동안 그것을 찾게 하는 probe test를 실시하였다. 이 test에서는 원형 pool을 네 구역으로 나눴을 때, platform이 있던 사분면 안에서 머무는 시간 (explorating time in target quadrant)을 기록하였다.18)
- Trisbuffered saline/ Tween 20로 10회 세척 후 1:2000으로 희석한 peroxidase-conjugated 2차 항체로 membrane을 상온에서 1시간 동안 incubation하였다. 이후 chemiluminescence (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)으로 발광시켜 LAS-4000 mini (Fujifilm Lifescience USA, Stamford, CT) 을 이용하여 분석하였다. 이후 20% glycine 용액으로 1시간 동안 상온에서 membrane을 stripping 한 후 1:2000으로 희석한 β-actin 항체를 이용하여 상기와 같은 방법으로 실시하였다.
- 길로틴문이 열린 후 마우스가 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였으며 이를 학습 시험 (acquisition trial)이라고 정의하였다. 일단 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 기억력 증강 시험에서는 0.3 mA (scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델의 기억력 회복에 대해서는 0.5 mA)의 전기 자극을 3초 동안 grid 바닥을 통해 흐르게 하였으며 마우스가 이를 기억하도록 하였다.
- 학습 시험 (acquisition trial)이 끝난 지 24시간 후에 장기기억에 미치는 EBS70의 효과를 확인하고자 수동회피 시험을 시행하였다. 10초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 방으로 마우스의 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간 (latency time; 머무름 시간)을 600초까지 측정하였고, scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델에서는 300초까지 측정하였다.
- − 본 실험에 사용한 흑지마는 경동시장 (서울)에서 구입하였다. 흑지마를 증류수로 2회 세척하고 분쇄한 후, 70% 에탄올을 흑지마 무게의 10배 부피만큼 가한 후 60℃ 물중탕으로 추출하였다. 이를 농축하고 동결건조한 뒤 얻은 흑색 분말을 실험에 사용하였다 (수득률: 13%, 이하 EBS70이라고 함).
대상 데이터
- − 본 실험에 사용한 scopolamine과 tacrine은 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA.)의 제품을 사용하였으며, anti-BDNF 와 anti-β-actin 1차 항체, 그리고 peroxidaseconjugated anti-rabbit 2차 항체는 Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA) 에서 구입하였다.
- − 본 실험에 사용한 흑지마는 경동시장 (서울)에서 구입하였다.
- − 수컷의 ICR 마우스 5주령을 주식회사 오리엔트 (경기도 성남시 중원구 상대원동)에서 공급받아 사용하였다.
- Y-미로시험에 이용되는 기구는 3개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지 (arm)의 길이는 42 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고 세 팔이 접하는 각도는 120º 였다. 실험 장치는 검정색의 polyvinyl plastic으로 구성하였다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다.
- 실험동물은 경희대학교 약학대학 동물실에서 7일간 적응시켰으며 적응기간 동안 동물실의 온도는 23±2℃, 습도 50±10% 내외, 조명은 12시간 주기로 (07:30-19:30) 일정하게 유지 하였다.
- 흑지마를 증류수로 2회 세척하고 분쇄한 후, 70% 에탄올을 흑지마 무게의 10배 부피만큼 가한 후 60℃ 물중탕으로 추출하였다. 이를 농축하고 동결건조한 뒤 얻은 흑색 분말을 실험에 사용하였다 (수득률: 13%, 이하 EBS70이라고 함).
데이터처리
- − 모든 실험 결과는 one way analysis of variance (ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였고, 유의성이 인정될 경우 Student-Newman-Keuls Method를 이용하여 95% 신뢰수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- EBS70이 기억력 증진에 미치는 효과의 기전을 알아보기 위해, 장기 기억과 가장 밀접한 연관이 있다고 알려져 있는 인자 중 하나인 BDNF의 발현에 미치는 EBS70의 효과를 알아보기 위해서 western blot analysis를 실시하였다.19) 행동실험에서의 효과용량인 200 mg/kg의 EBS70을 마우스에게 투여하고 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 그리고 4시간 후 마우스를 희생시켜 western blot sample을 얻어 분석하였다.
성능/효과
- 18) 치매유발 물질인 scopolamine 투여군은 4일간의 반복시험으로 escape latency가 감소하지 않아 장기기억 (long-term memory)이 손상된 것을 알 수 있었다. 반면 EBS70 투여군에서는 scopolamine에 의한 기억손상이 개선되어 escape latency가 양성 대조군인 tacrine 투여군 수준으로 회복되었다.
- 22,23) 뿐만 아니라 뇌 내에서 BDNF는 학습 및 기억분야와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있는데, 특히 장기기억의 저장과 널리 연구되고 있는 학습 및 기억의 세포 모델인 long-term potentiation 의 형성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.19,24,25) 본 연구에서 EBS70의 기억력 증진 효과의 기전을 알아보기 위해서 EBS70 투여 후 시간대별 BDNF의 발현양을 조사한 결과, 투여 후 4시간에서 대조군에 비하여 유의적으로 증가하였다. EBS70의 투여에 의해 BDNF의 발현이 증가하기까지 약간의 시간이 걸리는 것은 BDNF가 대부분 extracellular signal regulated kinase 또는 cAMP-response element-binding protein 과 같은 상위 신호전달 인자들의 활성화를 통해 이루어지기 때문이라고 추측할 수 있다.
- EBS70을 50, 100, 200 및 400 mg/kg의 용량으로 경구 단회 투여 했을 시 용량 의존적으로 latency time이 증가하였으며, 특히 200 mg/kg의 용량에서 대조군의 209% 수준으로 증가하는 것을 확인하였다 (P<0.05, Fig. 1A).
- 반면 EBS70 투여군에서는 scopolamine에 의한 기억손상이 개선되어 escape latency가 양성 대조군인 tacrine 투여군 수준으로 회복되었다. 도피대를 제거한 probe test에서 scopolamine 투여군에 비하여 tacrine 투여군은 33%, EBS70 투여군은 34% 수준으로 target quadrant에 머무는 시간이 증가하였기 때문에, EBS70 투여군은 4일간의 인지훈련기간 동안 수중미로 상의 platform 위치를 인지하고 반복되는 연속적인 훈련을 통해 공간 지각력을 확실하게 기억하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 볼 때 EBS70은 scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴 동물 모델에서 장기기억 개선효과가 뛰어난 것으로 생각된다.
- 또한 EBS70의 50, 100, 200 및 400 mg/kg의 경구 단회 투여에 의하여 용량 의존적으로 latency time이 증가하였고, 200 mg/kg의 용량에서 scopolamine 단독 투여군의 241% 수준으로 회복하는 것을 확인하였다 (P<0.05, Fig. 1B).
- 본 실험을 통해 흑지마는 정상 상태의 마우스에서 단회 경구 투여했을 시 용량 의존적으로 기억력 강화 효과를 나타내고, scopolamine으로 유도된 건망증 모델에서도 역시 용량 의존적으로 기억력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
- 실험 결과, EBS70 투여에 의해 BDNF의 발현양이 군간 유의적 차이를 나타내었으며, 특히 EBS70 투여 4시간 후의 BDNF 발현양은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다 (P<0.05, Fig. 4).
- 이러한 현상은 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 동물모델에서도 동일하게 관찰되었는데, 이 실험에서 scopolamine 처리군은 시험훈련 기간 동안 escape latency 시간이 대조군에 비해 증가하였으며, 반면에 EBS70과 tacrine 투여군은 escape latency 시간이 scopolamine 투여군에 비해서 유의적으로 감소하였다 (P<0.05, Fig. 3C).
- 도피대를 제거한 probe test에서 scopolamine 투여군에 비하여 tacrine 투여군은 33%, EBS70 투여군은 34% 수준으로 target quadrant에 머무는 시간이 증가하였기 때문에, EBS70 투여군은 4일간의 인지훈련기간 동안 수중미로 상의 platform 위치를 인지하고 반복되는 연속적인 훈련을 통해 공간 지각력을 확실하게 기억하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 볼 때 EBS70은 scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴 동물 모델에서 장기기억 개선효과가 뛰어난 것으로 생각된다.
- 정상 동물에서 EBS70의 200 mg/kg 용량 투여군이 대조군에 비해서 시험훈련 3일째부터 도피대를 찾아가는 시간 (escape latency)이 유의적으로 감소하였다 (P<0.05, Fig. 3A).
- 정상 동물을 이용한 Y-미로 시험 결과, EBS70의 200 mg/kg 용량에서 spontaneous alternation이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 증가하였다 (P<0.05, Fig. 2A).
- 훈련5일째 probe test에서는 scopolamine 투여군이 대조군에 비해 target quadrant에 머무는 시간이 유의성 있게 감소하였고, 반면 EBS70과 tacrine 투여군은 target quadrant에 머무는 시간이 scopolamine 투여군에 비해서 유의적으로 증가하였다 (P<0.05, Fig. 3D).
후속연구
- 이러한 점들로 미루어 볼 때, 기억력 감퇴에 대한 개선효과 및 증진 효과가 탁월한 흑지마를 인지기능 개선제 및 기억력 증진제로 개발할 수 있음을 시사한다.
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