열, 살균소독제, 항생제에 의한 분리 Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) 제어 Biocontrol of Isolated Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) by Heat, Sanitizer, and Antibiotic원문보기
국내의 건조분말 식품에서 분리한 Cronobacter spp.의 건조내성에 따른 열, 살균소독제, 항생제에 대한 내성특성 분석하여 Cronobacter spp.을 제어하는 효과적인 방법을 연구하고자 하였다. 분리된 37개의 건조저항 균주, 7개의 건조민감 균주, 그리고 68개의 중간그룹의 균주 총 112개에 대하여 분석한 결과 건조내성을 가지고 있는 Cronobacter spp.는 열에 대해서도 저항성이 큰 것으로 나타났다. 따라서 조제분유등의 건조 스트레스에 노출되어 살아남은 Cronobacter spp.는 열 스트레스에서도 높은 내성을 보일수 있을 것으로 사료된다. 살균소독제를 이용한 Cronobacter spp.의 제어효능은 sodium hypochlorite는 15-25 ppm와 benzalkonium chloride는 5-15 ppm 농도에서 5 log CFU/mL 살균 효과가 있었다. Albumin으로 3%(w/v)오염시킨 부유세균의 살균력은 건조내성 균주와 건조민감 균주 모두에서 오염전과 비슷하여 유기물 오염상태에서도 살균소독제 효능에는 큰 영향을 주고 있지 않음을 알 수가 있었다. 그리고 항생제 내성은 $\beta$-lactam 계열의 ampicillin에 대하여 약 90% 분리주가 64-128 ppm의 농도에서 최소저해 농도를 보여 주었다. Aminoglycoside 계열의 kanamycin과 Gram(-) spectrum의 nalidixic acid에서 4 ppm의 가장 낮은 내성을 보였다. 건조민감 균주과 건조내성 균주의 최소저해농도 경우 전반적으로 모든 항생제에 대해서 건조 내성이 높은 균주가 더 큰 항생제 내성을 지니고 있는 것으로 나타났다. 따라서 분리 Cronobacter spp.의 건조내성이 열과 항생제의 저항성과 관련이 있는 것으로 보인다. 그러므로 조제분유와 같은 분말식품과 그 원료의 오염 Cronobacter spp.의 살균제어에 더 강력한 처리가 필요할 것으로 보인다.
국내의 건조분말 식품에서 분리한 Cronobacter spp.의 건조내성에 따른 열, 살균소독제, 항생제에 대한 내성특성 분석하여 Cronobacter spp.을 제어하는 효과적인 방법을 연구하고자 하였다. 분리된 37개의 건조저항 균주, 7개의 건조민감 균주, 그리고 68개의 중간그룹의 균주 총 112개에 대하여 분석한 결과 건조내성을 가지고 있는 Cronobacter spp.는 열에 대해서도 저항성이 큰 것으로 나타났다. 따라서 조제분유등의 건조 스트레스에 노출되어 살아남은 Cronobacter spp.는 열 스트레스에서도 높은 내성을 보일수 있을 것으로 사료된다. 살균소독제를 이용한 Cronobacter spp.의 제어효능은 sodium hypochlorite는 15-25 ppm와 benzalkonium chloride는 5-15 ppm 농도에서 5 log CFU/mL 살균 효과가 있었다. Albumin으로 3%(w/v)오염시킨 부유세균의 살균력은 건조내성 균주와 건조민감 균주 모두에서 오염전과 비슷하여 유기물 오염상태에서도 살균소독제 효능에는 큰 영향을 주고 있지 않음을 알 수가 있었다. 그리고 항생제 내성은 $\beta$-lactam 계열의 ampicillin에 대하여 약 90% 분리주가 64-128 ppm의 농도에서 최소저해 농도를 보여 주었다. Aminoglycoside 계열의 kanamycin과 Gram(-) spectrum의 nalidixic acid에서 4 ppm의 가장 낮은 내성을 보였다. 건조민감 균주과 건조내성 균주의 최소저해농도 경우 전반적으로 모든 항생제에 대해서 건조 내성이 높은 균주가 더 큰 항생제 내성을 지니고 있는 것으로 나타났다. 따라서 분리 Cronobacter spp.의 건조내성이 열과 항생제의 저항성과 관련이 있는 것으로 보인다. 그러므로 조제분유와 같은 분말식품과 그 원료의 오염 Cronobacter spp.의 살균제어에 더 강력한 처리가 필요할 것으로 보인다.
Tolerance against heat, sanitizers, and antibiotics of 112 Cronobacter isolates classified by desiccation was determined to permit effective biocontrol in powdered foods. The isolates were classified into three groups: dry-tolerant (n=37), dry-sensitive (n=7), and dry-intermediate (n=68). The strain...
Tolerance against heat, sanitizers, and antibiotics of 112 Cronobacter isolates classified by desiccation was determined to permit effective biocontrol in powdered foods. The isolates were classified into three groups: dry-tolerant (n=37), dry-sensitive (n=7), and dry-intermediate (n=68). The strains that were highly tolerant to drying also showed high heat tolerance that they seemed to have high tolerance to heat after dry stress in powdered foods like infant formula. Sodium hypochlorite and benzalkonium chloride concentrations necessary to achieve a 5-log reduction in viable counts (CFU/mL) were 15-25 ppm and 5-15 ppm, respectively. However, there was little difference of the efficacy of these sanitizers between dry-sensitive and -tolerant strains for planktonic cells suspended in 3% albumin. The minimal inhibition concentration (MIC) of $\beta$-lactam ampicillin was 64-128 ppm for 90% of the strains. The isolates were consistently sensitive to kanamycin and naldixic acid (MIC=4 ppm). Dry-tolerant strains displayed more antibiotic resistance than dry-sensitive strains. The results indicate that dry-tolerant Cronobacter isolates often possess heat and antibiotic resistance, indicated the need for potent sterilization treatments of powdered foods.
Tolerance against heat, sanitizers, and antibiotics of 112 Cronobacter isolates classified by desiccation was determined to permit effective biocontrol in powdered foods. The isolates were classified into three groups: dry-tolerant (n=37), dry-sensitive (n=7), and dry-intermediate (n=68). The strains that were highly tolerant to drying also showed high heat tolerance that they seemed to have high tolerance to heat after dry stress in powdered foods like infant formula. Sodium hypochlorite and benzalkonium chloride concentrations necessary to achieve a 5-log reduction in viable counts (CFU/mL) were 15-25 ppm and 5-15 ppm, respectively. However, there was little difference of the efficacy of these sanitizers between dry-sensitive and -tolerant strains for planktonic cells suspended in 3% albumin. The minimal inhibition concentration (MIC) of $\beta$-lactam ampicillin was 64-128 ppm for 90% of the strains. The isolates were consistently sensitive to kanamycin and naldixic acid (MIC=4 ppm). Dry-tolerant strains displayed more antibiotic resistance than dry-sensitive strains. The results indicate that dry-tolerant Cronobacter isolates often possess heat and antibiotic resistance, indicated the need for potent sterilization treatments of powdered foods.
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문제 정의
으로부터 열, 항생제, 살균제에 대한 내성특성 분석하여 Cronobacter spp.을 제어하는 효과적인 방법을 연구하고자 하였다.
제안 방법
110종의 분리균주와 2종의 공시균주를 4가지 계열의 8가지 항생제에 대한 최소생육저해농도(MIC)를 분석하였다. β-Lactam 계열의 항생제는 transpeptidase의 작용을 억제하여 세균의 세포벽을 구성하는 peptidoglycan layer의 합성을 저해작용을 하며 대표적으로 penicillin과 ampicillin이 있다.
7×7 cm2의 스텐인레스 스틸에 20 µL를 떨어뜨린 후 25℃, 상대습도 75%의 항온항습 인큐베이터(Daehan Scientific, Seoul, Korea)에서 건조시킨 후 0, 4, 8, 24, 48시간째에 50 µL D.W.로 20회씩 2회 pippeting 하여 건조된 균체를 회수하여 TSA(Oxoid)에 도말한 후 37℃에서 24시간동안 회복 및 배양을 하여 형성된 집락을 계수하였다.
각 시험 균주는 Muller-Hinton(MH) broth(Oxoid, Hampshire, England)에서 37℃전 배양 시켰다. MH 한천배지(MHA)에 각 항생제를 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ppm으로 단계별로 희석하여 첨가한 항생제배지를 만들고 각 시험균액을 tooth-picking하여 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 최소 생육저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 각각의 항생제가 첨가된 배지에서 균주가 증식하지 않는 최소 농도로 결정하였다.
각각 1 mL씩 1.5 mL tube에 나누어 담은 후 60℃ 항온수조에서 5분간 incubation시킨 후 4℃ ice bath로 냉각시킨 후 100 µL를 취해 TSA(Oxoid)에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 회복 및 배양을 하여 형성된 집락을 계수하였으며 초기 균수와의 차이를 log로 표기하였으며 각 그룹 간 평균과 표준편차를 계산하여 표기하였다.
건조 특성에 따라 분류된 7종의 건조민감 균종과 37종의 건조내성 균주의 항생제 MIC 비교하였다. Neomycin의 경우 그룹간의 가장 큰 차이를 보였으나 전반적으로 모든 항생제에 대해서 건조내성이 균주가 높은 항생제 내성을 지니고 있는 것을 보아 환경 스트레스에 강한 저항성이 서로 연결되어 있는 것으로 보인다(Fig.
건조내성 3균주와 건조민감 3균주를 염소계 살균소독제인 차아염소산나트륨 용액(sodium hypochlorite solution)과 4급암모늄계(QACs)인 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)에 대한 살균소독력을 비교측정하였다. Sodium hypochlorite와 benzalkonium chloride은 살균소독제 유효성분 중 실제 제품수와 사용량이 가장 많은 것으로 알려져 있다(Lee, 2005).
최소 생육저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 각각의 항생제가 첨가된 배지에서 균주가 증식하지 않는 최소 농도로 결정하였다. 그리고 건조 내성균주 37주와 건조민감 균주 7주를 별도로 분리하여 각각의 항생제에 대한 내성을 비교하였다.
이 중화반응 혼합액 1 mL씩을 2개의 petri dish(SPL, Korea)에 각각 넣고 TSA를 12-13 mL씩 분주하여 잘 섞은 후 36±1℃에서 24시간 배양하여 발생한 집락수로부터 살균 소독력을 계산하였다. 시험 검증법으로 시험조건 검증시험, 중화제 독성 검증시험, 희석 중화 검증시험은 Fig. 1와 같은 방법으로 수행하였다. 또한 살균소독력 평가를 위한 시험균주로 Gram(-)와 Gram(+)를 대표하는 Escherichia coli O157:H7 NCTC 1949와 Staphylococcus aureus ATCC 12103을 사용하였다.
이 중화반응 혼합액 1 mL씩을 2개의 petri dish(SPL, Korea)에 각각 넣고 TSA를 12-13 mL씩 분주하여 잘 섞은 후 36±1℃에서 24시간 배양하여 발생한 집락수로부터 살균 소독력을 계산하였다.
, 2009). 이들 각각의 균을 60℃ 항온수조에서 사멸정도를 측정하였다. 전 배양한 초기균주는 7 Log CFU/mL 수준이었으며 사멸정도를 보았을 때 건조민감 그룹은 평균 5 Log scale이 사멸되었으며 평균 3 Log scale이 사멸한 건조저항 그룹보다 높은 사멸을 보였다.
를 건조내성에 따라 세 그룹으로 나누었다. 이들을 37개의 건조저항 균주, 7개의 건조민감 균주, 그리고 68개의 중간그룹으로 분류하여 연구를 수행하였다(Lee et al., 2009). 이들 각각의 균을 60℃ 항온수조에서 사멸정도를 측정하였다.
5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ppm으로 단계별로 희석하여 첨가한 항생제배지를 만들고 각 시험균액을 tooth-picking하여 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 최소 생육저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 각각의 항생제가 첨가된 배지에서 균주가 증식하지 않는 최소 농도로 결정하였다. 그리고 건조 내성균주 37주와 건조민감 균주 7주를 별도로 분리하여 각각의 항생제에 대한 내성을 비교하였다.
대상 데이터
45 µm membrane filter로 여과하여 사용하였다. 간섭물질로 albumin(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo, USA)용액(청정조건: 3 g/L, 오염조건 30 g/L)을 여과 멸균하여 사용하였다. 시험 중 모든 시약, 시험균, 시험액은 항온수조에서 20±1℃로 유지하였다.
공시균주인 C. muytjensii ATCC 51329과 C. sakazakii KCTC 2949를 포함하여 112개의 건조분말 식품유래 분리균주를 대상 시험균주로 정하였다. 7×7 cm2의 스텐인레스 스틸에 20 µL를 떨어뜨린 후 25℃, 상대습도 75%의 항온항습 인큐베이터(Daehan Scientific, Seoul, Korea)에서 건조시킨 후 0, 4, 8, 24, 48시간째에 50 µL D.
대상 항생제로는 네 가지 계열의 항생제가 사용되었는데 β-lactam 계열의 ampicillin, aminoglycoside 계열의 kanamycin, streptomycin와 neomycin, broad spectrum 계열의 chloramphenicol와 tetracycline이, Gram negative spectrum 계열의 rifampicin, nalidixic acid가 사용되었다. 대상 균주는 분리된 110개의 야생균주와 두 개의 표준 균주로 총 112개의 Cronobacter spp.가 시험 균주로 사용되었다.
대상 항생제로는 네 가지 계열의 항생제가 사용되었는데 β-lactam 계열의 ampicillin, aminoglycoside 계열의 kanamycin, streptomycin와 neomycin, broad spectrum 계열의 chloramphenicol와 tetracycline이, Gram negative spectrum 계열의 rifampicin, nalidixic acid가 사용되었다.
1와 같은 방법으로 수행하였다. 또한 살균소독력 평가를 위한 시험균주로 Gram(-)와 Gram(+)를 대표하는 Escherichia coli O157:H7 NCTC 1949와 Staphylococcus aureus ATCC 12103을 사용하였다.
살균소독력 시험은 Kim(2005) 등의 살균소독력 시험법에 따랐다. 사용된 희석액은 trypton, pancreatic digest of casein(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo, USA) 1 g과 8.5 g NaCl을 증류수 1 L에 녹인 후 멸균하여 사용하였다. 중화제는 polysorbate 80(Fulka chemie, Swizerland) 30 g과 lecithin(Sigma-Aldrich Co.
를 대표적으로 3균주씩 선별하여 TSB에서 37℃, 24시간동안 전배양한 후 2차 계대하여 사용하였다. 살균소독력 시험에 사용된 살균소독제는 그 유효성분 중 실제 제품수와 사용량이 가장 많은 것으로 알려진 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)과 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)를 이용하였다(Lee et al., 2005). 살균소독력 시험은 Kim(2005) 등의 살균소독력 시험법에 따랐다.
, 2009). 생화학적, 생리학적 특성을 비교하기 위해 공시균주인 C. muytjensii ATCC 51329와 C. sakazakii KCTC 2949를 사용하였으며 사용되는 시약은 특급시약을 사용하였다.
, 2005). 살균소독력 시험은 Kim(2005) 등의 살균소독력 시험법에 따랐다. 사용된 희석액은 trypton, pancreatic digest of casein(Sigma-Aldrich Co.
분리한 Cronobacter spp.의 항생제 감수성은 한천 희석방법을 이용하여 수행하였다(Zarazaga, 1999). 대상 항생제로는 네 가지 계열의 항생제가 사용되었는데 β-lactam 계열의 ampicillin, aminoglycoside 계열의 kanamycin, streptomycin와 neomycin, broad spectrum 계열의 chloramphenicol와 tetracycline이, Gram negative spectrum 계열의 rifampicin, nalidixic acid가 사용되었다.
성능/효과
β-lactam 계열의 ampicillin의 경우 8 ppm에서 256 ppm의 분포를 보이며 약 90%가 64-128 ppm의 높은 농도에서 저해되었고 256 ppm 이상의 농도에서도 생육하는 분리균주가 확인되어 높은 내성이 있는 것으로 확인되었다(Fig. 5).
의 제어 시에는 sodium hypochlorite 보다 benzalkonium chloride가 저 농도에서 효과적으로 작용할 것으로 사료된다. Albumin으로 3%(w/v) 오염시킨 후에의 살균력은 건조내성 균주와 건조 민감균주 모두 2가지의 살균소독제가 크게 영향을 주고 있지 않음을 알 수가 있었다. Cronobacter spp.
의 제어효능은 sodium hypochlorite는 15-25 ppm와 benzalkonium chloride는 5-15 ppm 농도에서 5 log CFU/mL 살균 효과가 있었다. Albumin으로 3%(w/v)오염시킨 부유세균의 살균력은 건조내성 균주와 건조민감 균주 모두에서 오염전과 비슷하여 유기물 오염상태에서도 살균소독제 효능에는 큰 영향을 주고 있지 않음을 알 수가 있었다. 그리고 항생제 내성은 β-lactam 계열의 ampicillin에 대하여 약 90% 분리주가 64-128 ppm의 농도에서 최소저해농도를 보여 주었다.
Aminoglycoside 계열의 항생제는 세균의 ribosome에 작용하여 RNA가 정상적 결합을 차단해 단백질 합성 저해하는 작용을 하며 대표적으로 kanamycin, streptomycin neomycin 등이 있다. Aminoglycoside 계열로 분류되는 kanamycin, streptomycin, neomycin에 대한 연구결과로 kanamycin의 MIC는 0.5 ppm에서 16 ppm의 범위를 보였으며 주로 4 ppm에서 많은 균주가 저해됨을 보였고 streptomycin, neomycin의 경우 1 ppm에서 16 ppm의 분포를 보였고 주로 8 ppm에서 저해되는 것으로 확인되었다(Fig. 6). 이는 β-lactam계열의 항생제를 aminoglycoside 계열보다 32배 이상의 높은 농도로 처리해야 Cronobacter spp.
Broad spectrum을 보이는 tetracycline은 tetracycline 계열 항생제로 세균의 ribosome에 작용하여 t-RNA의 전사를 방해하여 단백질의 합성을 억제하여 항균작용을 한다. Broad spectrum을 보여주는 항생제인 chloramphenicol 과 tetracycline의 경우 대부분이 16 ppm의 농도에서 저해됨을 확인하였으며(Fig. 7) 또한 Gram(-) 세균에서 주로 저해를 보여 주는 rifampicin과 nalidixic acid는 각각 16 ppm, 4 ppm에서 대부분 균들이 저해를 보였다(Fig. 8).
로 개명하도록 제안되었다. DNA-DNA 혼성화, 표현형에 의하여 Cronobacter sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii, C. dublinensis 등의 5종으로 재분류되었다. 이 균은 그램 음성, 운동성이 있고, 포자를 형성하지 않는 Enterobacteriaceae과의 간균으로 물, 토양 등의 환경과, 여러 가지 가공식품 및 신선식품 등에 존재한다(Friedemann, 2007).
Aminoglycoside 계열의 kanamycin과 Gram(-) spectrum의 nalidixic acid에서 4 ppm의 가장 낮은 내성을 보였다. 건조민감 균주과 건조내성 균주의 최소저해농도 경우 전반적으로 모든 항생제에 대해서 건조내성이 높은 균주가 더 큰 항생제 내성을 지니고 있는 것으로 나타났다. 따라서 분리 Cronobacter spp.
Sodium hypochlorite는 두 그룹 대부분 15-25 ppm의 범주에 속하였고 각 건조내성 그룹간의 큰 구별성은 없었다. 그리고 청정조건과 오염조건에서 5 ppm 가량의 차이를 보이는 것을 확인하였으나 오염정도가 살균력에 크게 반영되지는 않는 것으로 보인다(Fig. 3). 반면 QACs인 benzalkonium chloride는 살균 농도가 5-15 ppm 으로 sodium hypochlorite보다 낮은 농도에서 저해됨을 나타냈으며 각 그룹에 따라 5 ppm의 차이를 보이는 것으로 나타났다(Fig.
Albumin으로 3%(w/v)오염시킨 부유세균의 살균력은 건조내성 균주와 건조민감 균주 모두에서 오염전과 비슷하여 유기물 오염상태에서도 살균소독제 효능에는 큰 영향을 주고 있지 않음을 알 수가 있었다. 그리고 항생제 내성은 β-lactam 계열의 ampicillin에 대하여 약 90% 분리주가 64-128 ppm의 농도에서 최소저해농도를 보여 주었다. Aminoglycoside 계열의 kanamycin과 Gram(-) spectrum의 nalidixic acid에서 4 ppm의 가장 낮은 내성을 보였다.
5). 따라서 ampicillin에 약한 내성 그룹과 강한 그룹으로 분리되었으며 내성이 있는 균주들이 더 많은 것으로 나타났다. 일부 Cronobacter spp.
3). 반면 QACs인 benzalkonium chloride는 살균 농도가 5-15 ppm 으로 sodium hypochlorite보다 낮은 농도에서 저해됨을 나타냈으며 각 그룹에 따라 5 ppm의 차이를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 4). 청정조건과 오염조건에 따라서는 건조내성 균주중 한 균주만 차이를 보여 오염조건과 살균력의 상관관계는 크지 않은 것으로 보인다.
이들 각각의 균을 60℃ 항온수조에서 사멸정도를 측정하였다. 전 배양한 초기균주는 7 Log CFU/mL 수준이었으며 사멸정도를 보았을 때 건조민감 그룹은 평균 5 Log scale이 사멸되었으며 평균 3 Log scale이 사멸한 건조저항 그룹보다 높은 사멸을 보였다. 중간그룹의 경우 위의 건조실험에서 건조저항 그룹에 가까운 것으로 나타는데 평균 2 Log scale의 낮은 사멸을 보여주었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Cronobacter spp.는 어디에 존재하는가?
dublinensis 등의 5종으로 재분류되었다. 이 균은 그램 음성, 운동성이 있고, 포자를 형성하지 않는 Enterobacteriaceae과의 간균으로 물, 토양 등의 환경과, 여러 가지 가공식품 및 신선식품 등에 존재한다(Friedemann, 2007). 이 균은 조제분유 생산공정이나 가정에서도 발견되고 있으며 Cronobacter spp.는 유아에게 치명적인 영향을 주는 급성 기회 감염균으로 주로 생후 1개월 이내의 신생아, 조산아, 저체중아, 유아에게서 수막염(neonatal meningitis), 패혈증(bacteremia), 신생아 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis) 등의 병을 일으키는 것으로 알려졌다(Arad et al.
Cronobacter spp.의 문제점은 무엇인가?
이 균은 조제분유 생산공정이나 가정에서도 발견되고 있으며 Cronobacter spp.는 유아에게 치명적인 영향을 주는 급성 기회 감염균으로 주로 생후 1개월 이내의 신생아, 조산아, 저체중아, 유아에게서 수막염(neonatal meningitis), 패혈증(bacteremia), 신생아 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis) 등의 병을 일으키는 것으로 알려졌다(Arad et al., 2001; Farmer et al.
DNA-DNA 혼성화, 표현형에 의해 Cronobacter spp.는 어떻게 재분류 되었는가?
로 개명하도록 제안되었다. DNA-DNA 혼성화, 표현형에 의하여 Cronobacter sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii, C. dublinensis 등의 5종으로 재분류되었다. 이 균은 그램 음성, 운동성이 있고, 포자를 형성하지 않는 Enterobacteriaceae과의 간균으로 물, 토양 등의 환경과, 여러 가지 가공식품 및 신선식품 등에 존재한다(Friedemann, 2007).
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