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문제 정의
- 따라서 본 연구는 같은 종간의 다양성 및 유전적 변이를 분석할 수 있는 RAPD기법(Michael et al., 1990; Williams et al., 1990; Meunier et al., 1993)과 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms)기법(Kemp & Teale, 1994; Smith et al., 1996)을 활용하여 우리나라 토종 유전자원인 칡소의 DNA를 이용하여 Polymorphism을 분석한 후 유효성이 있는 유전자의 단편을 감별하고, 칡소 특이적인 유전자를 분석하여 그 유의성을 통해 칡소와 한우가 다른 품종임을 증명하여 추후 칡소 유전자원의 감별의 단초를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 분석된 target fragment의 sequence에서 해당 enzyme site를 찾은 후 그 크기를 확인하였고, total fragments의 sequence와 enzyme에 의해 찾아진 특이적 유전자의 sequence를 전부 이용하여 BLAST의 sequence 검사를 하였다. BLAST 검사는 human과 mouse에서 1차 검사를 하였고, 소의 DNA 상에 sequence의 관계를 확인하기 위해 Site Sequence의 검증을 Bos taurus에서 검증하였다. 이후 특이적 유전자의 sequence를 재분석하여 상동성이 가장 많은 결과를 사용하였다.
- BLAST에서 sequence를 분석하기 위해서 먼저 target fragment의 sequence를 분석하였다. 분석된 target fragment의 sequence에서 해당 enzyme site를 찾은 후 그 크기를 확인하였고, total fragments의 sequence와 enzyme에 의해 찾아진 특이적 유전자의 sequence를 전부 이용하여 BLAST의 sequence 검사를 하였다.
- Polymorphism-PCR 분석은 Random-Primer(63종) 및 URP-Primer(12종)를 이용하여 분석하였으며(강등, 2000)(Table 1), 1차적으로 각 종별 DNA를 섞어 RAPD 방법으로 분석한 후 특이적 band가 형성된 primer을 선택하여 각 축종별 8두의 DNA의 다양성을 비교분석하였다. PCR 증폭(Table 2)을 위한 Master Mixture로는 총 25 ㎕에 반응액 1 ㎕의 DNA에 10X PCR-mix buffer(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P-40, 50% Glycerol), 10 pmol RAPD-Primer, 2.5 mM dNTP 및 rTag DNA polymerase(Toyobo, Japan)를 멸균수와 함께 혼합하여 사용하여 Table 2와 같이 PCR하여 증폭하였다. 모든 실험은 최소 3회 반복하여 각 실험군의 재현성을 확인하였다.
- Plasmid DNA의 추출은 cloning된 형질전환 대장균에서 PLASMID Kit(Toyobo, Japan)를 이용하여 추출하였다. 추출된 10 ㎕ 이상의 plasmid-product에 EcoR I 10 U/㎕로 37℃에서 2시간 제한효소로 처리하여 Insert된 gene의 위치를 확인한 다음 확인이 끝난 Plasmid DNA에 5× Buffer와 BIG-Dye(3.
- 각 혈액 샘플은 DNA Extraction Kit(Toyobo, Japan)를 이용하여 분리하고, 자성 bead를 사용하여 멸균수에 녹여 실험에 공시하였다. Polymorphism-PCR 분석은 Random-Primer(63종) 및 URP-Primer(12종)를 이용하여 분석하였으며(강등, 2000)(Table 1), 1차적으로 각 종별 DNA를 섞어 RAPD 방법으로 분석한 후 특이적 band가 형성된 primer을 선택하여 각 축종별 8두의 DNA의 다양성을 비교분석하였다. PCR 증폭(Table 2)을 위한 Master Mixture로는 총 25 ㎕에 반응액 1 ㎕의 DNA에 10X PCR-mix buffer(20 mM Tris-HCl pH 8.
- RAPD분석으로 얻어진 DNA 다양성 band를 제한효소(Table 3)를 이용하여 더욱 세분화된 차이점을 분석하였다. 실험은 각 다양성이 확인된 RAPD 산물 1 ㎍/㎕당 5 unit을 사용하여 37℃에서 각각 3시간, 4시간, 6시간 동안 제한효소로 처리한 후 4℃에서 정지시켰고, 3% agarose gel에서 50 V로 3시간 동안 천천히 전기영동하였다.
- 각 혈액 샘플은 DNA Extraction Kit(Toyobo, Japan)를 이용하여 분리하고, 자성 bead를 사용하여 멸균수에 녹여 실험에 공시하였다. Polymorphism-PCR 분석은 Random-Primer(63종) 및 URP-Primer(12종)를 이용하여 분석하였으며(강등, 2000)(Table 1), 1차적으로 각 종별 DNA를 섞어 RAPD 방법으로 분석한 후 특이적 band가 형성된 primer을 선택하여 각 축종별 8두의 DNA의 다양성을 비교분석하였다.
- BLAST에서 sequence를 분석하기 위해서 먼저 target fragment의 sequence를 분석하였다. 분석된 target fragment의 sequence에서 해당 enzyme site를 찾은 후 그 크기를 확인하였고, total fragments의 sequence와 enzyme에 의해 찾아진 특이적 유전자의 sequence를 전부 이용하여 BLAST의 sequence 검사를 하였다. BLAST 검사는 human과 mouse에서 1차 검사를 하였고, 소의 DNA 상에 sequence의 관계를 확인하기 위해 Site Sequence의 검증을 Bos taurus에서 검증하였다.
- RAPD분석으로 얻어진 DNA 다양성 band를 제한효소(Table 3)를 이용하여 더욱 세분화된 차이점을 분석하였다. 실험은 각 다양성이 확인된 RAPD 산물 1 ㎍/㎕당 5 unit을 사용하여 37℃에서 각각 3시간, 4시간, 6시간 동안 제한효소로 처리한 후 4℃에서 정지시켰고, 3% agarose gel에서 50 V로 3시간 동안 천천히 전기영동하였다.
- 유전자의 염기서열을 분석하기 위하여 특이적인 band로 확인된 유전자를 agarose gel에서 재 추출한 후 O/D값이 1.8 이상의 된 산물 2 ㎕에 2X ligase buffer 5 ㎕, T4 DNA ligase 2 ㎕, T-easy vector 1 ㎕를 혼합하여 실온에서 2시간 동안 ligation을 유도하였다. Ligation 산물 10 ㎕와 component cell 50 ㎕(DH5α Toyobo, Japan)를 혼합하여 4℃에서 20분간 안정화 시킨 후 42℃에서 1분 30초간 vector 삽입을 유도한 후, SOC 100 ㎕에 섞어 37℃에서 1시간 30분 동안 1차 배양을 실시하였다.
- BLAST 검사는 human과 mouse에서 1차 검사를 하였고, 소의 DNA 상에 sequence의 관계를 확인하기 위해 Site Sequence의 검증을 Bos taurus에서 검증하였다. 이후 특이적 유전자의 sequence를 재분석하여 상동성이 가장 많은 결과를 사용하였다.
- 정제된 product는 Capillary방식의 3730XL Sequencer(ABI, USA)로 분석하여 SequmenⅡ Program을 이용하여 각각의 염기서열을 분석하였다.
- 추출된 10 ㎕ 이상의 plasmid-product에 EcoR I 10 U/㎕로 37℃에서 2시간 제한효소로 처리하여 Insert된 gene의 위치를 확인한 다음 확인이 끝난 Plasmid DNA에 5× Buffer와 BIG-Dye(3.1V) 그리고 T7 Primer를 첨가하여 denaturation은 96℃에서 10초간, annealing은 50℃에서 5초간, extention은 60℃에서 4분으로 35 cycle를 Big-dye solution으로 증폭하였다.
대상 데이터
- 1), MC1R-PCR 판별방법을 이용하여 한우 판별이 완료된 8개체를 선발하였다. 또한 한우는 농진청 개통 인증이 확인된 8 개체를 선발하였고(Fig. 2), 젖소는 Holstein 경산우 8개체를 무작위로 선발하여 각 축종별 혈액 Heparin이 첨가된 혈액 tube에 넣어 4℃로 보관하여 실험에 공시하였다.
- 본 실험에 공시된 축종은 칡소, 젖소, 한우이며, 칡소의 경우 외모 형태학적으로 호랑이 무늬가 명확하고(Fig. 1), MC1R-PCR 판별방법을 이용하여 한우 판별이 완료된 8개체를 선발하였다. 또한 한우는 농진청 개통 인증이 확인된 8 개체를 선발하였고(Fig.
성능/효과
- 3). 12개의 URP를 이용한 PCR의 결과는 Fig. 4와 같으며, band pattern은 칡소 119개, 한우 127개, 젖소 121개로 관찰되어 RAPD와 마찬가지로 칡소, 한우, 젖소의 DNA 다양성을 확인할 수 있었다.
- 5). 1차 실험에서 특이 band가 검출된 25개의 forward primer와 4개의 reverse primer를 이용해 개체별 DNA 다양성을 분석한 결과에서 칡소는 130개의 다양성 band 중 7개, 한우는 127개의 다양성 band 중 13개, 젖소는 109개의 다양성 band 중 8개로 서로 다른 표지 유전자를 확인할 수 있었다(Table 4). 축종별 특이적 표지인자로 볼 수 있는 band의 경우 칡소에서는 10개, 한우·젖소에서는 각각 2개씩 발견되었다(Fig.
- DNA 다양성 분석을 통해 얻어진 산물 중 재 PCR 결과에서 확인된 유전자 조각을 enzyme으로 분석한 결과, 550 bp의 칡소 표지 인자를 분석할 수 있었다(Fig. 6). 이후 염기서열 분석을 통하여 Table 5와 같이 371 bp의 칡소 표지인자의 염기서열을 확인하였다.
- 소의 genome 상에서 특이 band sequence와 가장 상이성이 높은 sequence를 찾고자 NCBI BLAST를 통해 Bos taurus에서 Gene을 탐색한 결과 총 12개의 matching 결과가 나왔다. 대부분이 작은 단편으로 낮은 일치율을 보인 반면 그 ref|NW_001492809.2|Bt10_WGA 1116_4 Bos taurus chromosome 10 genomic contig, reference assembly로 등록된 shut gun sequence는 98%의 높은 identity를 나타내고 있었으며 Matching Score(bit)가 645 bits로 가장 높은 결과를 보였다(Fig. 7). 이를 통해 이 칡소 특이 band sequence는 Bos Chromosome 10번에서 위치한 것으로 아직 그 기능과 특징이 알려져 있지 않은 unknown gene이라는 것을 알 수 있었다.
- 이를 통해 이 칡소 특이 band sequence는 Bos Chromosome 10번에서 위치한 것으로 아직 그 기능과 특징이 알려져 있지 않은 unknown gene이라는 것을 알 수 있었다. 또한 이 sequence를 통해 계통 분석을 한 결과, 이는 포유류 중에서도 발굽 동물인 소의 DNA 상에서 가장 특이적으로 발견되는 것을 알 수 있었다(Fig. 8).
- 5 mM dNTP 및 rTag DNA polymerase(Toyobo, Japan)를 멸균수와 함께 혼합하여 사용하여 Table 2와 같이 PCR하여 증폭하였다. 모든 실험은 최소 3회 반복하여 각 실험군의 재현성을 확인하였다. DNA 증폭 결과, 확인을 위하여 3% agarose gel에서 100 V로 2시간 동안 전기 영동하였다.
- 이 등(2002), 이 등(2007)의 핵형에 따른 연구 결과에서 보고한 바와 같이 칡소가 차별화된 품종임을 시사하고 있지만, 칡소만의 표지인자 구축에 대한 연구 결과는 많이 발견되지 못하고 있는 실정이다. 본 연구결과에서는 칡소의 표지인자 구축을 위하여 칡소와 한우 그리고 홀스타인의 DNA 다양성분석을 한 결과, RAPD-PCR분석을 통하여 유요 표지인자를 구축할 수 있었으며, 그 중 칡소에서 특이적으로 발견된 550 bp 위치의 유전자를 발견하였고, 371 bp의 염기서 열을 분석할 수 있었다. 칡소 특이적 유전자의 염기서열은 NCBI에 등록된 ref|NW_ 001492809.
- 소의 genome 상에서 특이 band sequence와 가장 상이성이 높은 sequence를 찾고자 NCBI BLAST를 통해 Bos taurus에서 Gene을 탐색한 결과 총 12개의 matching 결과가 나왔다. 대부분이 작은 단편으로 낮은 일치율을 보인 반면 그 ref|NW_001492809.
- 7). 이를 통해 이 칡소 특이 band sequence는 Bos Chromosome 10번에서 위치한 것으로 아직 그 기능과 특징이 알려져 있지 않은 unknown gene이라는 것을 알 수 있었다. 또한 이 sequence를 통해 계통 분석을 한 결과, 이는 포유류 중에서도 발굽 동물인 소의 DNA 상에서 가장 특이적으로 발견되는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 본 연구결과에서는 칡소의 표지인자 구축을 위하여 칡소와 한우 그리고 홀스타인의 DNA 다양성분석을 한 결과, RAPD-PCR분석을 통하여 유요 표지인자를 구축할 수 있었으며, 그 중 칡소에서 특이적으로 발견된 550 bp 위치의 유전자를 발견하였고, 371 bp의 염기서 열을 분석할 수 있었다. 칡소 특이적 유전자의 염기서열은 NCBI에 등록된 ref|NW_ 001492809.2|Bt10_WGA 1116_4 Bos taurus chromosome 10 genomic contig, reference assembly로 확인되었으며(Elsik 등 2009), Bos Chromosome 10번에서 위치한 것으로 아직 그 기능과 특징이 알려져 있지 않은 unknown gene이며, 계통학적 분석에서 발굽 동물인 소의 DNA 상에서 가장 특이적으로 발견되는 것임을 확인하였다(Fig. 7, 8). 본 연구 결과를 통해 칡소의 DNA 다양성은 황우 및 홀스타인과 다르게 분포되고 있음을 시사할 수 있었으며, 칡소의 종 특이적 표지인자의 발굴 및 표지마커 개발에 중요한 역할을 할 것이라 사료된다.
- 칡소, 젖소, 한우의 DNA 다양성을 관찰하기 위한 RAPD-PCR, URP-PCR 결과(Fig. 3, 4), DNA 염기 서열을 가장 많이 cover 할 수 있는 fragment는 500 bp 이상으로써 본 실험에서는 500 bp 이상이 69%, 이하가 31%로 나타났다(Fig. 5). 1차 실험에서 특이 band가 검출된 25개의 forward primer와 4개의 reverse primer를 이용해 개체별 DNA 다양성을 분석한 결과에서 칡소는 130개의 다양성 band 중 7개, 한우는 127개의 다양성 band 중 13개, 젖소는 109개의 다양성 band 중 8개로 서로 다른 표지 유전자를 확인할 수 있었다(Table 4).
- 칡소의 감별을 위하여 DNA 다양성 분석을 통한 결과에서 칡소에서 나타나는 유전자의 양상과 황우 및 홀스타인종에서 나타나는 양상은 2000년 손 등의 연구결과와 같이 변이품종이 아닌 한우의 다른 종인을 확인할 수 있었다. 또한 한우 감별 분석으로 사용된 melanocortin 1 receptor(MC1R) 유전자(Klungland 등, 1995; Joerg 등, 1996; Rouzaud 등, 2000)를 통한 한우 감별에서도 한우의 종으로 확인할 수 있었으며, 이 등(2008)의 선행연구결과에서 수정란 이식 후 모색의 발현 빈도를 통하여 칡소가 한우의 타종임을 증명하였다.
후속연구
- 7, 8). 본 연구 결과를 통해 칡소의 DNA 다양성은 황우 및 홀스타인과 다르게 분포되고 있음을 시사할 수 있었으며, 칡소의 종 특이적 표지인자의 발굴 및 표지마커 개발에 중요한 역할을 할 것이라 사료된다.
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