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문제 정의
- 본 연구에서는 기능성 쌀 품종인 슈퍼자미 품종의 미강을 표고버섯 균사체 및 유산균의 복합 발효로 통해 생성된 미강 발효물을 이용하여 항염증, 항알러지 및 항암 활성을 평가하였으며, 이를 활용하여 신품종 벼를 이용한 기능성 소재의 개발 자료로서 활용하고자 하였다.
- 이러한 미강은 우수한 기능성에도 불구하고 체내에서 세포벽 성분인 hemicellulose를 분해할 수 없다는 한계를 가지고 있으나, 다양한 가공 방법을 통해 이를 극복하고자 하고 있다. 본 연구에서는 색소 성분이 우수한 신규 기능성 쌀 품종인 슈퍼자미 품종의 미강을 활용하여 표고버섯 균사체 발효로 hemicellulose를 분해하는 가공공정을 통해 제조된 발효 산물이 항염, 항알러지, 항암 활성이 있음을 검증하였으며, 이를 통해 신품종 쌀을 이용한 새로운 기능성 소재의 개발 자료로서 활용하고자 한다.
- 슈퍼자미 미강 발효물의 항암 활성을 확인하기 위하여 본 연구에서는 복수암 모델과 고형암 모델의 2종을 사용하여 활성을 검증하였다. Fig.
- 슈퍼자미(SuperC3GHi) 쌀 품종은 색소 성분인 cyanidine3-glucoside(C3G)의 함량을 크게 증대시킨 품종이다. 슈퍼자미 벼품종을 활용한 새로운 기능성 소재 및 제품으로의 개발 가능성을 타진하기 위하여 본 연구에서는 슈퍼자미 벼 품종의 버섯 균사체 발효물을 이용하여 항염증, 항알러지, 항암 기능의 검증을 수행하였다.
제안 방법
- 항염증 활성의 측정은 실험동물의 내이(內耳)에 염증 유발물질을 도포한 후 염증에 의해서 증가하는 귀의 두께 등가를 측정하는 ear-edema model를 사용하여 측정하였다. 4주령의 ICR mouse의 내이의 두께를 측정한 후, 3% arachidonic acid 를 양쪽 귀에 도포하고 2분 후 왼쪽 귀에는 acetone(30 ul/ear)를 처리하고 오른쪽 귀에는 시험 시료를 처리 한 후 2시간 경과 후 다시 양쪽 귀의 두께를 측정하여 샘플 처리에 따른 저해율(inhibition rate)과 ear edema(%)를 산출하였다. 대조물질로는 NSAIDs인 indomethacin을 사용하였다.
- 또한, 실험 종료 후 실험동물로부터 심장 채혈하여 EDTA tube에 수집한 후, 혼합하여 혈구 분석기를 이용하여 RBC(red blood cell), MCV(mean corpuscular volume), HCT(hematocrit), PLT (platelet). MPV(mean platelet volume), WBC(white blood cell), HGB(hemoglobin concentration), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corppuscular hemoglobin concentration), LYME(lymph. con- centration in absolute number and percentage), GRAN(gran. concentration in absolute number and percentage), Mid (mid-sized cells(e.g. monocytes) in absolute number and percentage)를 측정하였다.
- 고형암 모델의 측정을 위해서 4주령의 C57BL/6 마우스 (male)를 1주일간 적응기를 가진 후 각 군당 7마리씩 분류하고, B16BL6 melanoma cell을 1×106 cells/head의 농도로 시험동물의 서혜부에 이식하고, 2주간 슈퍼자미 미강 발효 물을 경구투여 한 뒤 시험동물을 희생시키고, 서혜부의 고형암 조직을 분리 한 뒤 고형암의 무게를 측정하여 항암 효과를 관찰하였다.
- cells/head의 농도로 시험동물의 서혜부에 이식하고, 2주간 슈퍼자미 미강 발효 물을 경구투여 한 뒤 시험동물을 희생시키고, 서혜부의 고형암 조직을 분리 한 뒤 고형암의 무게를 측정하여 항암 효과를 관찰하였다. 또한, 실험 종료 후 실험동물로부터 심장 채혈하여 EDTA tube에 수집한 후, 혼합하여 혈구 분석기를 이용하여 RBC(red blood cell), MCV(mean corpuscular volume), HCT(hematocrit), PLT (platelet). MPV(mean platelet volume), WBC(white blood cell), HGB(hemoglobin concentration), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corppuscular hemoglobin concentration), LYME(lymph.
- 슈퍼자미 미강 발효물의 항암 활성은 고형암 모델과 복수암 모델의 두 가지 모델로 구분하여 실시하였다. 암세포를 이식한 실험동물모델을 이용하여 각 시료의 항암활성을 알아보고자 복수암 모델에서는 4주령 ICR 마우스(male)를 1주일간 적응기를 가진 후, 각 군당 7마리씩 분류하여, 복수암 암세포주인 Sarcoma-180을 1 × 106 cells/head의 농도로 실험동물의 복강 내에 이식하고, 4주간 슈퍼자미 미강 발효물을 경구투여하면서 실험동물의 체중 및 생존여부를 관찰하였다.
- , 2007). 슈퍼자미 미강의 발효 공정은 미강을 탈지한 후 발효 배지에 2%가 되도록 첨가하고 DPA(Dextrose Peptone Agar) 배지에서 배양한 표고버섯 균주인 Letinus edodes를 접종하여 28℃에서 5일간 배양한 후 회수하여 열수추출, 농축 및 멸균 공정을 거치고 동결건조하여 발효물을 얻었다.
- 암세포를 이식한 실험동물모델을 이용하여 각 시료의 항암활성을 알아보고자 복수암 모델에서는 4주령 ICR 마우스(male)를 1주일간 적응기를 가진 후, 각 군당 7마리씩 분류하여, 복수암 암세포주인 Sarcoma-180을 1 × 106 cells/head의 농도로 실험동물의 복강 내에 이식하고, 4주간 슈퍼자미 미강 발효물을 경구투여하면서 실험동물의 체중 및 생존여부를 관찰하였다.
- , 2006). 이를 이용하여 항알러지 활성을 관측하기 위해서 비만세포의 일종인 RBL-2H3 cell line을 IgE, PMA 또는 Compound 48/80과 같은 알러지 유발물질로 탈과립 현상을 유도한 후 탈과립화를 억제하는 정도를 관찰함으로서 시료의 항알러지 활성을 관측할 수 있다. Fig.
- 항염증 활성의 측정은 실험동물의 내이(內耳)에 염증 유발물질을 도포한 후 염증에 의해서 증가하는 귀의 두께 등가를 측정하는 ear-edema model를 사용하여 측정하였다. 4주령의 ICR mouse의 내이의 두께를 측정한 후, 3% arachidonic acid 를 양쪽 귀에 도포하고 2분 후 왼쪽 귀에는 acetone(30 ul/ear)를 처리하고 오른쪽 귀에는 시험 시료를 처리 한 후 2시간 경과 후 다시 양쪽 귀의 두께를 측정하여 샘플 처리에 따른 저해율(inhibition rate)과 ear edema(%)를 산출하였다.
대상 데이터
- 4주령의 ICR mouse의 내이의 두께를 측정한 후, 3% arachidonic acid 를 양쪽 귀에 도포하고 2분 후 왼쪽 귀에는 acetone(30 ul/ear)를 처리하고 오른쪽 귀에는 시험 시료를 처리 한 후 2시간 경과 후 다시 양쪽 귀의 두께를 측정하여 샘플 처리에 따른 저해율(inhibition rate)과 ear edema(%)를 산출하였다. 대조물질로는 NSAIDs인 indomethacin을 사용하였다.
- 실험에 사용된 슈퍼자미 품종은 모본인 흑진주벼에 비해 C3G 함량이 10배 이상 높도록 육성된 품종으로 한국 및 일본, 미국에 신규 품종으로 특허 출원된 것을 한국방송통신대학교 류수노 교수 연구팀으로부터 현미상태로 도정된 것을 제공받아 도정기로 도정하여 미강 성분을 분리한 뒤 시료로서 사용하였다(Ryu et al., 2007). 슈퍼자미 미강의 발효 공정은 미강을 탈지한 후 발효 배지에 2%가 되도록 첨가하고 DPA(Dextrose Peptone Agar) 배지에서 배양한 표고버섯 균주인 Letinus edodes를 접종하여 28℃에서 5일간 배양한 후 회수하여 열수추출, 농축 및 멸균 공정을 거치고 동결건조하여 발효물을 얻었다.
데이터처리
- 각 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 각 군간의 유의성 검증은 95% 신뢰도 수준에서 student t-test를 이용하여 수행하였으며, 유의성이 나타날 경우 Duncan’s multiple range test에 의해서 사후 검증을 실시하였다.
이론/모형
- 항알러지 활성의 측정은 비만세포주인 RBL-2H3 cell line에 compound 48/80으로 알러지 반응을 유발 시킨 후 나타나는 hexoaminidase의 분비량을 Schwartz 등(1979)의 방법 및 histamin의 분비량을 Shore 등(1959)의 방법으로 측정하여 항알러지 활성을 관찰하였다.
성능/효과
- 1. 슈퍼자미 미강 발효물의 항염 활성을 분석하기 위하여 ear-edema test를 수행한결과 약 35.6%의 염증 억제율을 나타내었다.
- 2. 슈퍼자미 미강 발효물의 항알러지 활성을 확인하기 위하여 비만세포인 RBL-2H3 세포의 hexoamidase 및 histamine 유리 활성을 조사한 결과 슈퍼자미 미강 발효물을 처리하였을 때 각각 약 40% 및 57%의 억제 활성을 나타내어 항알러지 활성을 확인하였다.
- 3. 슈퍼자미 미강 발효물의 항암 활성을 조사한 결과 복수암 모델 및 고형암 모델에서 모두 암세포의 증식을 억제하는 활성을 나타내었고, 혈액중 백혈구의 수치를 유의적으로 증가하는 것으로 나타나 슈퍼자미 미강 발효물이 항암 활성을 있음을 확인 할 수 있었다.
- 2는 알러지 감작 물질인 Compound 48/80으로 비만 세포주인 RBL-2H3 cell line을 자극하였을 때 나타나는 hexoamidase의 활성을 측정한 결과이다. Compound 48/80으로 알러지 반응이 유발되어 나타나는 hexoamidase의 활성을 100%로 하였을 때 음성대조군의 경우 약 8%로 나타났으며, 알러지 유발 후 슈퍼자미 미강 발효물을 각각 100 ug/mL, 250 ug/mL로 처리하였을 때 100 ug/mL 첨가군에서는 약 25%, 250 ug/mL 농도로 처리하였을 때는 약 40%정도의 hexoamidase의 활성이 감소하여 농도의존적으로 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 슈퍼자미 미강 발효물이 알러지 반응을 억제하는 기능을 가지고 있음을 추측하게 하였다.
- Histamin 분비량에의 결과도 hexoamidase 분석 결과와 유사한 경향을 나타내었다. Compound 48/80으로 자극한 RBL-2H3 cell에서 histamine의 분비는 비처리군에 비하여 약 4배 이상의 증가가 나타났다. 또한 동일 환경에서 슈퍼자미 미강 발효물을 처리하였을 때 histamine 분비량은 100 ug/mL 농도에서 약 82%, 250 ug/mL 농도에서 약 57%수준으로 나타났으며, 농도의존적으로 활성의 증가가 나타나는 것이 관찰되었다.
- 6%로 비록 양성대조군과 유의적 차이는 나타나지 않았으나 염증 유발이 억제되고 있음을 확인할 수 있었다. Fig. 1(B)와 같이 슈퍼자미 미강 발효물의 염증 억제율(edema inhibition rate)을 살펴보았을 때도 양성대조군인 indometacin을 도포한 군에서는 약 68.5%의 염증 억제율을 나타내었고, C3G-F 군에서는 35.6%의 염증 억제율을 나타내었다. 슈퍼자미 미강 발효물의 경우 비록 양성대조군인 indometacin에 비하여 상대적으로 낮은 활성을 보였으나 indometacin이 대표적인 상업용 NSAIDs 임을 감안할 때 C3G-F의 활성도 우수한 결과로 사료된다.
- 고형암 세포주를 이용한 항암 활성의 관찰은 고형암 세포 주를 시험 동물의 서혜부에 이식한 고형암의 종양 무게를 통해서 이루어지며, 종양 무게에 대한 분석 결과는 Table 1과 같이 결과를 보였다. 고형암 세포주를 이식한 후 3주가 경과 된 후 대조군(NC group)의 고형암 무게는 0.635 g으로 나타났으나, 고형암 이식과 함께 슈퍼자미 미강 발효물을 250 mg/kg body weight/day로 투여한 시험군(C3G-F)에서는 0.512 g으로 나타나 약 20%정도의 고형암 종괴 무게가 감소하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 슈퍼자미 미강 발효물이 우수한 항암 활성을 가지고 있는 결과로 사료 된다. 또한, 고형암을 유발시킨 시험동물로부터 채취한 혈액을 통해 혈액학적 검사를 수행한 결과는 Table 2와 같다.
- 4 g에 비하여 약 3배에 달하는 수치로 복수암 세포주가 복강내에서 지속적으로 성장하는 것을 보여주고 있다. 동일 조건에서 슈퍼자미 미강 발효물을 250 mg/kg body weight/day의 비율로 경구 투여한 군(C3G-F group)에서는 동일 기간에 체중증가량이 약 6.5 g으로 NC군에 비하여 약 60%정도의 체중 증가량을 나타내었으며, 복수암 세포주 이식 후 8일차 이후부터 모두 유의적인 체중 증가의 감소가 나타나고 있었고, 시간이 경과함에 따라 그 차이가 점차 커져 복수암 세포주의 증식이 저해되고 있음이 관찰되었다. 이를 통해 슈퍼자미 미강 발효물이 항암 효과를 보이고 있음을 확인 할 수 있었다.
- Compound 48/80으로 자극한 RBL-2H3 cell에서 histamine의 분비는 비처리군에 비하여 약 4배 이상의 증가가 나타났다. 또한 동일 환경에서 슈퍼자미 미강 발효물을 처리하였을 때 histamine 분비량은 100 ug/mL 농도에서 약 82%, 250 ug/mL 농도에서 약 57%수준으로 나타났으며, 농도의존적으로 활성의 증가가 나타나는 것이 관찰되었다. 이러한 비만세포주로부터 hexoamidase 와 histamine 분비량의 결과로 볼 때 슈퍼자미 미강 발효물은 비만세포의 탈과립 경로를 억제하여 알러지 반응을 억제 하는 활성이 있는 것으로 사료된다.
- 복수암 세포주인 Sarcoma-180 세포주를 시험동물의 복강에 이식하게 되면 복수내에서 증식하여 복수의 양을 증대시켜 체중이 지속적으로 증대하게 되며, 일정 기간 경과 후 시험동물이 사망에 이르게 된다. 복수암 세포주를 이식한 후 15일간 체중증가량을 관찰하였을 때 복수암 세포주만을 이식한 그룹 (NC group)에서는 15일간 체중 증가량이 약 11.8 g의 증가가 나타났다. 이는 복수암 세포주를 이식하지 않은 정상군 (Control group)에서의 체중증가량 3.
- 5%로 나타났다. 슈퍼자미 미강 발효물(C3G-F)의 경우에는 염증 유발율이 약 14.6%로 비록 양성대조군과 유의적 차이는 나타나지 않았으나 염증 유발이 억제되고 있음을 확인할 수 있었다. Fig.
- Compound 48/80으로 알러지 반응이 유발되어 나타나는 hexoamidase의 활성을 100%로 하였을 때 음성대조군의 경우 약 8%로 나타났으며, 알러지 유발 후 슈퍼자미 미강 발효물을 각각 100 ug/mL, 250 ug/mL로 처리하였을 때 100 ug/mL 첨가군에서는 약 25%, 250 ug/mL 농도로 처리하였을 때는 약 40%정도의 hexoamidase의 활성이 감소하여 농도의존적으로 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 슈퍼자미 미강 발효물이 알러지 반응을 억제하는 기능을 가지고 있음을 추측하게 하였다. 동일 세포주에서 알러지 반응을 유발하는 cytokine 성분인 histamin의 분비량을 측정한 결과는 Fig.
- 5 g으로 NC군에 비하여 약 60%정도의 체중 증가량을 나타내었으며, 복수암 세포주 이식 후 8일차 이후부터 모두 유의적인 체중 증가의 감소가 나타나고 있었고, 시간이 경과함에 따라 그 차이가 점차 커져 복수암 세포주의 증식이 저해되고 있음이 관찰되었다. 이를 통해 슈퍼자미 미강 발효물이 항암 효과를 보이고 있음을 확인 할 수 있었다.
- 측정항목 대부분의 혈액학적 수치에서 대조군과 시험군관에 유의적인 차이는 발견되지 않았으나, 백혈구(WBC)는 대조군에 비해서 시험군이 유의적으로 증가하는 모습이 관찰되었다(p<0.05).
후속연구
- 4. 이상의 결과에서 슈퍼자미 품종의 미강을 버섯 균사체 발효를 통해 얻어진 기능성 소재는 항염, 항알러지, 항암 활성을 통해서 우수한 기능성 소재로서의 개발 가능성이 매우 높다고 판단된다.
- 특히, 식품 가공 기술의 발달로 식품의 기호성 증진을 위해 곡류의 도정 과정이 과거보다 더 정교해짐에 따라 미강의 발생양은 계속 증가할 것으로 예측되고 있어 미강을 이용한 새로운 식품의 연구개발이 지속적으로 이루어지고 있다. 기능성 식품 소재로서 미강에 대한 관심은 미강내에 포함된 다양한 생리활성 물질이 규명되면서 더욱 높아지고 있는데, 이중 흑미와 같은 유색 미는 일반 쌀 품종의 미강 성분에 추가하여 다양한 생리활성을 보이고 있는 천연 색소 성분을 다량으로 함유하고 있어 일반 벼의 미강 성분보다 더 높은 기능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 본 연구에서 사용된 슈퍼자미 (SuperC3GHi) 품종은 일반 흑미에 비하여 색소 성분이 10~15배 이상 증대된 특수 기능성 쌀 품종이기 때문에 미강을 활용한 기능성 소재의 원료로서 그 활용성이 매우 높다고 할 수 있다.
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