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문제 정의
- 특히, 밀을 주원료로 가공한 라면, 빵, 국수는 2005년 국민영양조사에 따른 다소비식품으로 분류되며, 어린이, 청소년과 같은 특정집단에서 주로 섭취되는 과자류 또한 밀, 옥수수 등으로 제조되므로 그 원료에 대한 안전관리가 강조된다. 따라서 본 연구에서는 제랄레논 오염이 우려되는 식품군인 과자, 빵, 떡 및 면류 등을 대상으로 HPLC 형광검출기 분석법을 이용하여 오염실태를 조사하고자 하였다.
제안 방법
- 0 mm×250 mm, 5 µm), 이동상은 acetonitrile:methanol:water(10:55:35, v/v/v)로 분석하였다(Table 1). 또한 제랄레논이 검출된 시료는 LC-MS/MS(UPLC ACQUITYTM/Micromass Quattro Premier XE API triple-quadrupole mass spectrometer(Micromass, Manchester, UK))를 이용하여 확인시험을 하였다. ESI negative ion mode로 설정하여 con voltage 45 collision energy 25로 분석하였다.
- 정량분석을 위하여 3023 pump, 3023 autoinjector 그리고 형광검출기가 장착된 HPLC(Shiseido SI-2, Tokyo, Japan) 및 ultra performance liquid chromatography(UPLC) ACQUITY™/Micromass Quattro Premier XE API triple-quadrupole mass spectrometer(UPLC-MS/MS, Micromass, Manchester, UK)를 사용하였다. 시료분쇄기, 균질기(OMNI International, Vernon, USA), 원심분리기, vacuum system 등으로 시료를 전처리하였다.
- 시중 유통 중인 과자류, 빵, 떡류, 면류 및 선식 등 432건을 immunoaffinity column으로 정제하여 HPLC-FLD로 제랄레논에 대한 오염실태를 조사하였다. 제랄레논의 검량선은 결정계수(R2)가 0.
- 정량분석을 위하여 3023 pump, 3023 autoinjector 그리고 형광검출기가 장착된 HPLC(Shiseido SI-2, Tokyo, Japan) 및 ultra performance liquid chromatography(UPLC) ACQUITY™/Micromass Quattro Premier XE API triple-quadrupole mass spectrometer(UPLC-MS/MS, Micromass, Manchester, UK)를 사용하였다.
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표준용액 조제
제랄레논 표준품 25 mg을 acetonitrile 10 mL에 녹여 표준원액으로 하고 최종 농도가 5, 10, 25, 50, 75, 100 ng/mL가 되도록 75% acetonitrile로 희석하여 검량선용 표준용액으로 사용하였다.
- 제랄레논을 추출하기 위하여 포장단위(0.5 kg 또는 1 kg)별로 분쇄하여 균질화한 시료 25 g과 sodium chloride 2 g에 75% acetonitrile 추출용액 100 mL를 가하여 균질기로 10,000 rpm에서 20분간 추출하였다. 다만, 지방함량이 높은 시료는 헥산으로 지방을 제거하여 추출액으로 하였다.
- 76 µg/kg 검출되었다. 침출차는 식품 특성상 그대로 섭취하는 것이 아니라 티백을 일정량의 물에 침지시킨 후 그 물을 음용하기 때문에 실질적으로 물에 얼마나 제랄레논이 용출되는 지를 분석하였다. 검출된 침출차를 대상으로 침출시간(5-30분)별, 침출횟수(1-4회)별로 제랄레논을 분석한 결과 모두 검출되지 않았다.
- 칼럼은 Capcellpak C18 UG120(3.0 mm×250 mm, 5 µm), 이동상은 acetonitrile:methanol:water(10:55:35, v/v/v)로 분석하였다(Table 1).
대상 데이터
- 시료 정제용 Immunoaffinity column(ZearalaTest, Watertown, MA, USA)을 Vicam으로부터 구입하였다. 정량분석을 위하여 3023 pump, 3023 autoinjector 그리고 형광검출기가 장착된 HPLC(Shiseido SI-2, Tokyo, Japan) 및 ultra performance liquid chromatography(UPLC) ACQUITY™/Micromass Quattro Premier XE API triple-quadrupole mass spectrometer(UPLC-MS/MS, Micromass, Manchester, UK)를 사용하였다.
- 식품 중 제랄레논 오염실태조사를 위해 2008년 4월부터 10월까지 서울, 부산, 대전, 대구, 광주, 인천광역시 및 원주시 백화점, 대형 할인마트 및 재래시장에서 빵류(도넛, 식빵, 케이크 기타 빵류), 떡류, 면류(유탕면류, 건면류, 생면류, 숙면류 등 5품목), 과자류(스낵과자류, 비스킷류, 파이류), 밀가루, 맥주, 선식, 음료, 전분 및 시리얼류 등 총 432건을 구입하였다. 모든 시료는 포장단위로 균질화하여 −20℃ 냉동 보관하면서 사용하였다.
- 제랄레논 정량분석을 위해 fluorescence detector(Excitation 275 nm, Emission 450 nm)가 장착된 Shiseido SI-2 시스템을 사용하였다. 칼럼은 Capcellpak C18 UG120(3.
성능/효과
- 검체별 회수율을 검토하기 위해 제랄레논에 오염되지 않은 스낵, 비스킷, 빵 및 케이크에 최종농도가 5, 25, 50, 250, 500 µg/kg이 되게 제랄레논을 첨가하여 각 시료에 대한 회수율을 측정한 결과, 스낵 및 비스킷에서 각각 86.2-98.4%, 88.7-94.7%로 나타났고 빵 및 케이크는 각각 80.2-93.7%, 81.7-94.5%이었다.
- 침출차는 식품 특성상 그대로 섭취하는 것이 아니라 티백을 일정량의 물에 침지시킨 후 그 물을 음용하기 때문에 실질적으로 물에 얼마나 제랄레논이 용출되는 지를 분석하였다. 검출된 침출차를 대상으로 침출시간(5-30분)별, 침출횟수(1-4회)별로 제랄레논을 분석한 결과 모두 검출되지 않았다. 이는 제랄레논이 물에 대한 용해성이 떨어지기 때문이라고 생각되며 본 연구결과 중 음료와 맥주에서 제랄레논이 검출되지 않은 결과와 일치하였다.
- 제랄레논이 검출된 시료를 확인하기 위해 LC/MS/MS로 분석한 결과 product ion 175 m/z, 131 m/z 및 273 m/z를 MRM(Multiple Reaction Monitoring) mode로 분석하여 과자류 5건, 기타식품(밀가루, 침출차, 전분, 선식 등) 33건에서 product ion 175 m/z, 131 m/z 및 273 m/z을 확인하였다. 따라서 검출 시료 36건 모두 제랄레논임을 확인하였고 LC/MS/MS 표준용액 크로마토그램 및 검출시료 크로마토그램을 Fig. 2으로 나타냈다.
- 면류, 빵류 및 떡류에서는 제랄레논이 검출되지 않았으며 침출차 14건에서 최고 53.76 µg/kg 검출, 선식 24건 중 16건에서 가장 높은 검출율(66.7%)을 나타내었다.
- 면류, 빵류 및 떡류에서는 제랄레논이 모두 검출되지 않았고 기타식품 중 침출차 34건 중 14건(검출율 41.1%)에서 6.38-53.76 µg/kg 검출되었다.
- 본 연구에서 아침식사대용 시리얼류 및 빵류에서 제랄레논이 검출되지 않았으나 영국 연구보고에서는 시리얼류에서 유럽연합 기준을 초과하는 오염수준을 보였다. 본 연구결과에서 제랄레논 검출빈도가 높은 선식의 경우 곡류뿐 아니라 두류, 유지식물류 등 다양한 곡물을 혼합하여 만든 제품으로 국내외 모니터링 결과와 직접적으로 비교는 어려우나 제품의 특성이 유사한 보리 및 옥수수가루와 비교한 결과 그 오염수준 다소 낮음을 확인하였다. 따라서 본 모니터링의 제랄레논 오염수준은 유럽연합(곡류분말: 75 µg/kg, 빵, 비스킷, 스낵, 아침식사대용 시리얼류: 50 µg/kg, 영아 및 유아용 시리얼류: 20 µg/kg)의 기준 이하로 오염수준이 높지 않았으나 지구 온난화로 기후변화에 민감한 곰팡이독소와 같은 자연독소의 발생 증가가 우려되므로 선제적으로 대응하는 안전관리가 요구된다.
- 본 연구에서 구한 검출한계는 Urraca 등(19)의 검출한계(3-6 µg/kg), Mateo 등(20) 및 Jimenez와 Mateo(21)가 제시한 4 µg/kg이나 3 µg/kg보다 낮은 검출한계를 보였다.
- 8 µg/kg)에서는 각각 50, 30%로 높은 검출율을 보여 본 연구결과의 비스킷보다 다소 높 았으며 스낵류는 대체적으로 낮은 수준이었다. 본 연구에서 아침식사대용 시리얼류 및 빵류에서 제랄레논이 검출되지 않았으나 영국 연구보고에서는 시리얼류에서 유럽연합 기준을 초과하는 오염수준을 보였다. 본 연구결과에서 제랄레논 검출빈도가 높은 선식의 경우 곡류뿐 아니라 두류, 유지식물류 등 다양한 곡물을 혼합하여 만든 제품으로 국내외 모니터링 결과와 직접적으로 비교는 어려우나 제품의 특성이 유사한 보리 및 옥수수가루와 비교한 결과 그 오염수준 다소 낮음을 확인하였다.
- 시중 유통되는 식품인 과자류(스낵과자류, 비스킷류, 파이류) 141건, 빵류(도넛, 식빵, 케이크 기타 빵류) 55건, 떡류 4건, 면류(유탕면류, 건면류, 생면류, 숙면류, 개량숙면류) 135건 및 기타식품(밀가루, 맥주, 선식, 음료, 전분 및 시리얼류 등) 101건으로 총 432건을 대상으로 제랄레논 오염량을 분석한 결과, 과자류 중 스낵과자류 3건(총 66건, 검출율: 4.5%)에서 6.02-11.82 µg/kg 검출되었고 비스킷 2건(총 71건, 검출율: 2.8%)에서 14.78-17.83 µg/kg 검출되었다.
- 연구결과 곡류가공품에 대한 제랄레논 오염수준은 높지 않았으나 지구 온난화로 기후변화에 민감한 곰팡이독소와 같은 자연독소의 발생 증가가 우려되므로 선제적으로 대응하는 안전관리가 요구된다.
- 제랄레논 모니터링 결과, 과자류 중 스낵과자류 66건 중 3건에서 6.02-11.82 µg/kg 검출되었고 비스킷 71건 중 2건에서는 14.78-17.83 µg/kg 검출되었다.
- 제랄레논의 검량선은 결정계수(R2)가 0.999 이상으로 양호한 직선성을 보였고 검출한계 및 정량한계는 각각 2.0, 6.0 µg/kg, 회수율 80.2-98.4%이었으며 RSD가 0.82-6.40%로 양호한 재현성을 나타내었다.
- 제랄레논이 검출된 시료를 확인하기 위해 LC/MS/MS로 분석한 결과 product ion 175 m/z, 131 m/z 및 273 m/z를 MRM(Multiple Reaction Monitoring) mode로 분석하여 과자류 5건, 기타식품(밀가루, 침출차, 전분, 선식 등) 33건에서 product ion 175 m/z, 131 m/z 및 273 m/z을 확인하였다. 따라서 검출 시료 36건 모두 제랄레논임을 확인하였고 LC/MS/MS 표준용액 크로마토그램 및 검출시료 크로마토그램을 Fig.
- 최종 농도가 5, 10, 25, 50, 75, 100 µg/kg 농도가 되게 제랄레논 표준용액을 비스킷에 첨가하여 하루에 5번 반복 실험하여 정밀성(%, RSD로 표시)을 검토한 결과 상대표준편자가 4.38% 이하를 나타냈다(Table 3).
- 표준용액을 5, 10, 25, 50, 75, 100 ng/mL 농도로 조제하여 검량선을 구한 결과, 결정계수(R2)가 0.999 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다. 검출한계(limit of detection)는 signal 대 noise 비가 3대 1일 때의 농도로 하였고 정량한계(limit of quantification)는 LOD×3일 때의 농도로 구하여 각각 2, 6 µg/kg이었다.
후속연구
- 따라서 본 모니터링의 제랄레논 오염수준은 유럽연합(곡류분말: 75 µg/kg, 빵, 비스킷, 스낵, 아침식사대용 시리얼류: 50 µg/kg, 영아 및 유아용 시리얼류: 20 µg/kg)의 기준 이하로 오염수준이 높지 않았으나 지구 온난화로 기후변화에 민감한 곰팡이독소와 같은 자연독소의 발생 증가가 우려되므로 선제적으로 대응하는 안전관리가 요구된다.
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