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문제 정의
- 본 연구에서는 뽕잎으로부터 분리한 H. pylori 억제물질이 건강기능식품으로 산업화되기 위한 전제조건으로 in vivo실험에서 이들 유용성분의 일반 독성평가와 면역 독성평가를 실시하여 안전성 여부를 검토하였다.
- 1과 같이 200 μg/100 μL의 농도에서 clear zone을 형성하여 저해활성을 나타내었다. 이러한 결과로 보아 위장 내에서 위궤양을 일으키는 원인균인 Helicobacter pylori의 억제제로 산업화에 적용시킬 수 있는 source로 활용이 가능할 것이라 판단되어, 청목노상 뽕잎을 이용한 Helicobacter pylori에 대한 항균제로써 활용하기 위한 전단계로 식품에 적용하기 위하여 동물 생체 내에서의 독성검사를 수행하였다.
- 대식세포에서 생성되는 NO는 체내 방어기능 등 다양한 생리기능을 가지고 있으며, NO의 생성은 박테리아나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하기도 하지만 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발시키므로 NO의 적절한 억제로 인해 면역증강 효과를 기대할 수 있다(14-16). 이로써 뽕잎 추출물이 복강 대식세포의 NO생성을 억제시켜 면역증강 효과의 가능성을 제시하는 것으로 판단된다.
제안 방법
- 뽕잎으로부터 분리한 유용성분을 투여하고 20시간 후에 분리한 macrophage를 4, 20, 30, 40시간 동안 더 배양한 후, 상등액 100 μL만을 취하여 96 well plate에 옮긴 후 100 μL Griess reagent를 넣고 10분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader를 사용하여 540 nm 흡광도에서 측정하였다. Sodium nitrite의 검량선으로부터 macrophage가 분비하는 nitric oxide를 계산하였다.
- 개의 세포를 넣고 effector cell로 이용하였다. Target cell로는 YAC1 세포를 이용하였으며 effector cell과 target cell의 비율을 50:1로 하여 함께 배양한 후 20시간 후에 MTT-assay를 실시하였다. in vitro 방법은 뽕잎으로부터 분리한 유용성분을 100, 10, 1 μg/mL 농도로 처리하고, 암세포와 함께 20시간 배양하였다.
- in vitro 방법은 뽕잎으로부터 분리한 유용성분을 100, 10, 1 μg/mL 농도로 처리하고, 암세포와 함께 20시간 배양하였다.
- 값은 각각 4000 mg/kg을 상회할 것으로 판단되었다. 만성 독성을 관찰하기 위하여 13주 반복 독성검사를 수행하였으며 시험기간 동안 수컷에서는 대조군과 투여군 모두에서 사망동물이 관찰되지 않았으나, Table 1에서와 같이 암컷의 약물 투여군에서는 투여량 4000 mg/kg의 투여군에서 모두 사망함을 관찰하였으며, 사망 관찰시점은 시험 시작 4주에서 8주 사이로 사망동물을 확인하였다. 암컷 투여군이 모두 사망한 이후에 13주 반복독성 평가에서는 암수 모두가 생존한 투여량 2000 mg/kg에서 약물을 투여하였으며, 이후 암수 구분을 하지 않고 대조군 실험의 관찰을 수행하였다.
- 투여직전에 멸균한 증류수와 DMSO를 매체로 하여 시험물질을 조제하였다. 매체 대조군의 동물에는 매체인 20% DMSO만을 투여하였다. 투여는 투여 전 하룻밤을 절식시킨 후 경구투여용 주사기를 이용하여 조제시험물질을 강제 경구투여 하였다.
- 본 시험 물질들은 식물 추출물로 알려져 있으나, 혼합하여 사용되어진 예가 없어 투여액량은 150 μL/head로 고정하고 용량을 2000, 3000, 4000 mg/kg로 하여 매체를 투여하는 매체 대조군만을 두었다.
- 체중측정은 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여개시전과 투여 후 2 또는 3일 간격으로 급성독성은 10일간, 만성독성은 13주 동안 측정하였다. 부검은 생존동물을 ether 마취 후 개복하여 방혈치사 시킨 후 육안적으로 내부 장기를 관찰하였다.
- 뽕잎 정제물이 LPS 처리에 의해 활성화된 대식세포로부터의 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 각 약물을 농도별로 24시간 처리한 Raw 264.7 cell line, 그리고 급성독성(10일), 만성독성(13주) 동안 경구투여로 사육한 마우스의 대식 세포로부터 생성되는 NO의 양을 Griess reagent를 사용하여 측정하였다. Raw 264.
- 또한 항원을 처리하여 T 및 B 세포에 전달하는 과정에 탐식이 선행되어야 하기 때문에 탐식 능은 대식세포의 항미생물 기능 및 항암기능의 기본적인 지표이다. 뽕잎에서 분리한 약물을 13주 동안 경구투여로 사육하여 그 대식세포의 탐식능을 측정하였다. 대조군(O.
- 뽕잎에서 분리한 약물을 농도별로 10일, 13주 동안 경구투여로 섭취한 실험동물에서 비장 세포를 분리하여 NK 세포의 활성을 측정하였다. Fig.
- 뽕잎으로부터 분리한 유용성분을 투여하고 20시간 후에 분리한 macrophage를 4, 20, 30, 40시간 동안 더 배양한 후, 상등액 100 μL만을 취하여 96 well plate에 옮긴 후 100 μL Griess reagent를 넣고 10분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader를 사용하여 540 nm 흡광도에서 측정하였다.
- 뽕잎으로부터 분리한 유용성분을 투여하고 20시간 후에 분리한 mice thymocyte를 96 well plate에 well 당 5×105개의 세포로 넣고 10 μg/mL lipopolysaccharide(LPS)와 2.5μg/mL concanavalin A(ConA)를 첨가하여 각각 lymphocyte의 증식력을 측정하였다.
- 세포 증식을 알아보기 위해 MTT(2 μg/mL) 25μL를 가하고 4시간 동안 더 배양한 후, 생성된 formazan을 DMSO로 녹이고 ELISA reader로 540 nm에서 측정하였으며, NK cell 활성은 Alive Yac-1/(Alive Yac-1＋Dead Yac-1)×100으로 나타내었다.
- 시험기간 중 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전 8시∼오후 8시) 및 조도 150∼300 Lux로 설정하여 사육하였고, 실험자들은 모두 고압증기멸균(121℃, 20분)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다.
- 시험물질은 Cho 등(12)이 청목노상 뽕잎으로부터 H. pylori 억제 물질로 분리하여 보고한 caffeic acid, rosamarine acid,chlorogenic acid을 냉장보관하며 경구투여 하였다. 투여직전에 멸균한 증류수와 DMSO를 매체로 하여 시험물질을 조제하였다.
- 실험재료인 청목노상 뽕잎으로부터 분리한 Helicobacter pylori 억제물질(12)인 caffeic acid, rosamarinic acid,chlorogenic acid를 1:1:1(w/w/w)로 혼합하여 이용하였으며 Helicobacter pylori 최적배지 plate(액체배지 50 mL당 special pepton 0.5 g, agar 0.75 g, NaCl 0.25 g, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic acid 0.025 g)에Helicobacter pylori 균 100 μL를 분주하여 멸균 유리봉으로도말한 다음, 멸균된 disc paper(Φ 8 mm)를 올리고 0.45 μm membrane filter로 제균한 억제물질 혼합액(200 μg/100 μL)을 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 37℃의미호기성 조건에서 24시간 동안 incubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.
- 만성 독성을 관찰하기 위하여 13주 반복 독성검사를 수행하였으며 시험기간 동안 수컷에서는 대조군과 투여군 모두에서 사망동물이 관찰되지 않았으나, Table 1에서와 같이 암컷의 약물 투여군에서는 투여량 4000 mg/kg의 투여군에서 모두 사망함을 관찰하였으며, 사망 관찰시점은 시험 시작 4주에서 8주 사이로 사망동물을 확인하였다. 암컷 투여군이 모두 사망한 이후에 13주 반복독성 평가에서는 암수 모두가 생존한 투여량 2000 mg/kg에서 약물을 투여하였으며, 이후 암수 구분을 하지 않고 대조군 실험의 관찰을 수행하였다.
- 일반증상 및 사망동물의 관찰은 투여 첫날은 투여 후 6시간 후에 관찰하였고 다음 날부터는 아침, 점심, 저녁, 매일 3회씩 일반 증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 체중측정은 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여개시전과 투여 후 2 또는 3일 간격으로 급성독성은 10일간, 만성독성은 13주 동안 측정하였다.
- 전체 배양 부피는 200 μL로 하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양 후 각각 MTT를 가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 일반증상 및 사망동물의 관찰은 투여 첫날은 투여 후 6시간 후에 관찰하였고 다음 날부터는 아침, 점심, 저녁, 매일 3회씩 일반 증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 체중측정은 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여개시전과 투여 후 2 또는 3일 간격으로 급성독성은 10일간, 만성독성은 13주 동안 측정하였다. 부검은 생존동물을 ether 마취 후 개복하여 방혈치사 시킨 후 육안적으로 내부 장기를 관찰하였다.
- 투여는 투여 전 하룻밤을 절식시킨 후 경구투여용 주사기를 이용하여 조제시험물질을 강제 경구투여 하였다. 투여는 급성독성은 10일간, 만성독성은 13주 동안 같은 시간에 개체별로 투여하였으며, 투여를 시작한 첫날에 측정된 체중을 기준으로 하여 투여액량을 계산하였다.
- 매체 대조군의 동물에는 매체인 20% DMSO만을 투여하였다. 투여는 투여 전 하룻밤을 절식시킨 후 경구투여용 주사기를 이용하여 조제시험물질을 강제 경구투여 하였다. 투여는 급성독성은 10일간, 만성독성은 13주 동안 같은 시간에 개체별로 투여하였으며, 투여를 시작한 첫날에 측정된 체중을 기준으로 하여 투여액량을 계산하였다.
- pylori 억제 물질로 분리하여 보고한 caffeic acid, rosamarine acid,chlorogenic acid을 냉장보관하며 경구투여 하였다. 투여직전에 멸균한 증류수와 DMSO를 매체로 하여 시험물질을 조제하였다. 매체 대조군의 동물에는 매체인 20% DMSO만을 투여하였다.
대상 데이터
- 사용된 실험동물은 8～12주령의 C57BL/6(SPF) 마우스를 오리엔트바이오 주식회사(경기도 성남시 소재)로부터 구입하여 사용하였고, 마우스는 실험 전 약 1주일간 순환시켰으며 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 이용하였다. 시험기간 중 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전 8시∼오후 8시) 및 조도 150∼300 Lux로 설정하여 사육하였고, 실험자들은 모두 고압증기멸균(121℃, 20분)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다.
- 실험재료는 뽕잎의 한 종류인 청목노상 뽕잎을 경북상주 소재의 잠사시험장에서 수확하여 추출물을 제조하고, Sephadex LH-20과 MCI gel CHP-20 등의 column chromatography로 정제한 다음 Helicobacter pylori 억제효과가 뛰어난 caffeic acid, rosamarinic acid, chlorogenic acid 등 3가지 물질을 동정하여 동물실험을 위한 시료로 사용하였다(12).
이론/모형
- 뽕잎으로부터 분리한 유용성분이 대식세포의 탐식능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 zymosan particle 도입방법을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 매체 대조군과 투여군 쥐의 대식세포를 1×105 cells/well의 농도로 각각 넣고 zymosan을 5×106 particles/mL이 되도록 가한 후 NBT 0.
성능/효과
- 4%). 13주 반복 독성검사에서는 YAC-1 세포에 대한 NK cell 의 활성을 FACS를 이용하여 측정한 결과 Fig. 7-B에서와같이 시험물질 투여군에서 세포독성능이 감소된 것으로 확인하였다. 따라서 뽕잎에서 분리한 약물은 세포 독성이 없는 것으로 판단되었다.
- 6-A와 B에서와 같이 3000, 4000 mg/kg 투여한 암컷군에서는 LPS와 Con A에 의해 세포가 약간 증식되었으나 나머지 군에서는 변화가 없는 것을 확인하였다. 13주 반복 독성검사에서는 동일한 방법으로 72시간 동안 처리하여 세포증식을 측정한 결과 Fig. 6-C에서와 같이 LPS와 Con A 첨가 48시간 후에 비장세포가 증식하는 것을 확인하였으나, 72시간 처리 시 대조군과 큰 차이를 보이지 않아 비장세포의 증식에 영향을 주지 않았다. 따라서 뽕잎에서 분리한 약물은 면역독성이 없는 것으로 판단된다.
- 3-A, B 및 C에서와 같이 장기 무게의 변화는 수컷이나 암컷 mouse 모두에게서 나타나지 않았다. 13주 반복 독성검사에서도 부검 결과 수컷 mouse의 모든 시험군에서 육안으로 이상소견은 관찰되지 않았으나, 부검 후 장기 무게를 측정한 결과 Fig. 3-D에서와 같이 신장(대조군: 1.72%, 약물투여군:0.43%)과 간(대조군: 4.32, 약물투여군: 4.89%)의 무게가 다소 차이가 있었다. 신장과 간은 세포 면역반응에 중요한 역할을 담당하는 장기이므로 몇 가지 중요한 면역반응 실험들을 실시하였다.
- 따라서 T 세포의 증식능은 그 기능 수행에 있어 매우 중요하며 이에 대한 영향은 면역 독성의 중요지표로 사용될 수 있다. T 세포의 활성을 증폭을 유도하기 위해 비장세포를 분리하여 LPS 또는 ConA와 투여물질을 첨가한 후 24시간 배양 후에 세포증식을 측정한 결과, 급성독성 검사에서는 Fig. 6-A와 B에서와 같이 3000, 4000 mg/kg 투여한 암컷군에서는 LPS와 Con A에 의해 세포가 약간 증식되었으나 나머지 군에서는 변화가 없는 것을 확인하였다. 13주 반복 독성검사에서는 동일한 방법으로 72시간 동안 처리하여 세포증식을 측정한 결과 Fig.
- 뽕잎에서 분리한 약물을 13주 동안 경구투여로 사육하여 그 대식세포의 탐식능을 측정하였다. 대조군(O.D=0.053)에 비해 약물 투여군(O.D=0.082)에서 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과는 뽕잎에서 분리한 약물이 대식세포의 활성을 증가시키는 것으로 판단된다.
- 13주 반복 독성검사에서도 수컷군의 시험물질 투여 3일 후부터 피부의 털에서 이상이 발생되었으나 이도 매체에 의한 증상으로 보였으나, 시험물질 투여 6주가 지난 후에는 매체대조군과 같은 상태로 유지되었다. 또한 시험물질 투여군의 mouse들이 대조군보다 더 활발히 움직이는 것을 관찰할 수 있었다.
- 면역세포에 대한 영향은 약물 투여 시 매체 대조군에 비해 대식세포의 독성 물질인 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 암컷군에서 48시간에서만이 LPS와 Con A에 의해 비장세포가 약간 증식되었을 뿐 다른 실험군에서는 대조구와 비슷한 수치를 나타내었으며, 자연살해세포의 세포독성은 감소되었다. 뽕잎에서 분리한 유용성분인 caffeic acid, rosemarinic acid와 chlorogenic acid가 H.
- pylori 의 감염에 영향을 받을 수 있는 위의 무게 역시 대조군과의 차이를 확인할 수 없었다. 면역세포에 대한 영향은 약물 투여 시 매체 대조군에 비해 대식세포의 독성 물질인 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 암컷군에서 48시간에서만이 LPS와 Con A에 의해 비장세포가 약간 증식되었을 뿐 다른 실험군에서는 대조구와 비슷한 수치를 나타내었으며, 자연살해세포의 세포독성은 감소되었다.
- 또한 암컷군에서 48시간에서만이 LPS와 Con A에 의해 비장세포가 약간 증식되었을 뿐 다른 실험군에서는 대조구와 비슷한 수치를 나타내었으며, 자연살해세포의 세포독성은 감소되었다. 뽕잎에서 분리한 유용성분인 caffeic acid, rosemarinic acid와 chlorogenic acid가 H. pylori의 감염환자의 치료용 또는 예방의 목적으로 임상적으로 사용할 경우 아무런 독성이 없을 것으로 판단되어 뽕잎을 건강기능성 식품으로 개발하는데 있어서 안전성 문제는 없는 것으로 판단되었다.
- 뽕잎에서 분리한 유효성분의 혼합물에 대한 안전성을 확인하기 위하여 경구 투여하여 시험한 결과, 투여량 4000 mg/kg에서 암수 mouse 모두가 생존하여 급성독성은 없을 것으로 판단하였으며, 13주 반복 독성 시험에서도 투여량 2000mg/kg에서 암수 mouse 모두가 생존하여 약물의 독성에 의한 문제는 없을 것으로 판단되었다. 육안으로는 대조군과 비교 시 이상이 확인되지 않았으며 부검 후 H.
- 사망율 및 LD50값은 시험 물질 뽕잎에서 추출한 유용 성분인 caffeic acid, rosamarinic acid와 chlorogenic acid의 혼합물의 경구투여에 의한 독성을 조사하기 위하여 C57BL/6 마우스를 암수 각각의 용량에 5마리씩 10일간 같은 양을 경구투여 하여 10일간의 사망률을 관찰한 결과, Table 1에서와같이 시험물질에 의한 사망례는 암수의 대조군 및 고용량 4000 mg/kg 투여군에서 시험기간을 통하여 사망동물은 관찰되지 않았으며, 암수동물에 대한 본 시험물질의 급성독성에 대한 LD50값은 각각 4000 mg/kg을 상회할 것으로 판단되었다. 만성 독성을 관찰하기 위하여 13주 반복 독성검사를 수행하였으며 시험기간 동안 수컷에서는 대조군과 투여군 모두에서 사망동물이 관찰되지 않았으나, Table 1에서와 같이 암컷의 약물 투여군에서는 투여량 4000 mg/kg의 투여군에서 모두 사망함을 관찰하였으며, 사망 관찰시점은 시험 시작 4주에서 8주 사이로 사망동물을 확인하였다.
- 암수의 모든 시험군에서 투여 기간 동안 2일 간격으로 각 농도별로 체중변화를 확인한 결과 급성독성 검사의 경우, Fig. 2-A에서와 같이 10일 투여 후 암컷과 수컷 mouse 모두 투여 후 체중변화가 큰 차이는 보이지 않았고, 13주 반복 독성검사의 경우, Fig. 2-B에서와 같이 대조군과 약물 투여군 모두 체중이 증가되는 것을 확인하였다. 대조군은 3.
- 일반증상은 table화하기 어려워 결과를 제시하지 않았으나 급성독성 검사 시 수컷군의 투여 3일 후부터 피부의 털이 윤기가 떨어져 거칠어지는 현상 등 이상이 약간 발생되었으나 이는 매체 시험물질에서도 나타나는 것으로 보아 시험물질들의 투여에 따른 이상소견이라기보다는 매체에 의한 증상으로 보였으며, 암컷군에서는 이상 증상이 발견되지 않았다. 13주 반복 독성검사에서도 수컷군의 시험물질 투여 3일 후부터 피부의 털에서 이상이 발생되었으나 이도 매체에 의한 증상으로 보였으나, 시험물질 투여 6주가 지난 후에는 매체대조군과 같은 상태로 유지되었다.
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