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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 감마선 조사 타락죽의 산업화를 위해 안전성을 검토할 목적으로 멸균 환자식 적용에 적합한 30 kGy 조사된 타락죽을 ICR 마우스에 3개월간 섭취시킨 다음 독성평가를 수행하였다.
- 본 연구는 타락죽의 안전성을 확보하기 위해서 30 kGy 감마선 조사된 타락죽을 ICR 마우스에 3개월간 섭취시킨 다음 독성평가를 수행하였다. 비조사 타락죽 및 30 kGy 조사 타락죽을 암수 마우스에 투여를 한 결과 시험기간 동안 시험물질에 의한 임상증상이나 폐사 동물을 나타나지 않았으며, 체중변화, 사료섭취량 및 주요 장기 무게도 대조군에 비해 차이를 보이지 않았다.
제안 방법
- 1 PBq, Co-60 감마선 조사시설(IR-70 gamma irradiator, MDS Nordion, Montreal, Canada)을 이용하였다. 감마선 조사는 시간당 10 kGy의 선량율로 30 kGy의 흡수선량이 되도록 처리하였다. 조사 후 총 흡수선량 확인은 alanine dosimeter(Oeric cerous dosimeter, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였다.
- 부검당일에 cardiac puncture를 통해 EDTA-2K가 코팅된 튜브(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 혈액을 채취한 후 자동혈구계측장치(HEMA VET 950, Drew Inc, Cumbria, UK)를 이용하여 총 백혈구(white blood cell, WBC), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호염구(basophil) 수를 측정하였다. 나아가, 총 적혈구 수(red blood cell, RBC), 헤모글로빈 함량(hemoglobin, Hb), 혈중 적혈구 비율(hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 헤모글로빈 함유량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 헤모글로빈 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 적혈구 크기 분포폭(red blood cell distribution width, RDW), 혈소판 수(platelet, PLT)도 측정하였다.
- 타락죽 투여 시작일부터 90일까지 매주 3회 모든 동물에 대해 일정 시간에 일반 증상 및 중독 증상, 사망의 유무를 관찰하였다. 동물의 체중도 투여 개시 전부터 투여 후 90일까지 매주 1회 측정하였다. 사료 섭취량은 사료의 공급량과 잔량을 일주일간씩 측정하여 통계분석 하였다.
- 무작위법으로 암수 각 10마리씩 3개 군으로 나누었다. 즉, AIN-93G 식이를 기본으로 투여한 대조군과 감마선 비조사(0 kGy) 타락죽 투여군, 감마선 조사(30 kGy) 타락죽 투여군으로 구성하였다.
- 부검 당일 채취된 혈액에서 분리한 혈청을 혈액생화학 분석기기(KoneLab 20, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Finland)를 이용하여 albumin(ALB), alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), blood urea nitrogen(BUN), cholesterol(CHOL), creatinine(CREA), bilirubin direct(D-BIL), total bilirubin(T-BIL), glucose(GLUC), triglycerides(TG), total protein(TP)을 측정하였다.
- 부검당일에 cardiac puncture를 통해 EDTA-2K가 코팅된 튜브(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 혈액을 채취한 후 자동혈구계측장치(HEMA VET 950, Drew Inc, Cumbria, UK)를 이용하여 총 백혈구(white blood cell, WBC), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호염구(basophil) 수를 측정하였다. 나아가, 총 적혈구 수(red blood cell, RBC), 헤모글로빈 함량(hemoglobin, Hb), 혈중 적혈구 비율(hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 헤모글로빈 함유량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 헤모글로빈 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 적혈구 크기 분포폭(red blood cell distribution width, RDW), 혈소판 수(platelet, PLT)도 측정하였다.
- 분쇄기(HMF-1000A, Hanil electric, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 120 mesh의 체를 통과시킨 분말 200 g을 150℃의 볶음 용기(∅30 cm)에서 10분간 볶고, 400 g의 증류수를 첨가한 다음, 100℃에서 2분간 가열하였다.
- 동물의 체중도 투여 개시 전부터 투여 후 90일까지 매주 1회 측정하였다. 사료 섭취량은 사료의 공급량과 잔량을 일주일간씩 측정하여 통계분석 하였다.
- 즉, AIN-93G 식이를 기본으로 투여한 대조군과 감마선 비조사(0 kGy) 타락죽 투여군, 감마선 조사(30 kGy) 타락죽 투여군으로 구성하였다. 사료는 각각의 필수영양소들을 AIN-93G 규격에 맞게 혼합하여 pellet를 만들어 3개월간 자유로이 섭취시켰고, 필터와 유수 살균기를 이용하여 여과･살균된 정제수를 자유급식 시켰다. 타락죽의 일반성분 분석 결과, 탄수화물, 지방, 단백질 함량이 건물량(dry basis) 기준으로 각각 73.
-
동물의 부검, 장기무게 및 조직학적 검사
사육이 끝난 실험동물을 12시간 동안 절식시키고 에테르로 마취하여 혈액을 채취한 다음 간, 비장, 신장, 폐, 심장을 즉시 적출하고 육안으로 각종 장기의 소견을 관찰하였다. 적출한 장기를 생리식염수로 세척하고 여과지로 표면의 수분을 제거한 다음 무게를 측정하였다.
- 찹쌀의 2배에 해당하는 물을 찹쌀과 함께 20℃에서 6시간 동안 수침하였고, 이후 흐르는 물에 2회 수세하였다. 수세된 찹쌀은 체를 이용하여 10분간 물기를 제거한 후, 햇빛이 없는 실내(20℃)에서 16시간 동안 건조하였다. 분쇄기(HMF-1000A, Hanil electric, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 120 mesh의 체를 통과시킨 분말 200 g을 150℃의 볶음 용기(∅30 cm)에서 10분간 볶고, 400 g의 증류수를 첨가한 다음, 100℃에서 2분간 가열하였다.
- 실험동물은 온도 20.9～22.6℃, 상대습도 45～55%, 환기회수 및 방식 10～15회/시간, 전배기방식, 조명시간 12시간(08:00～20:00) 및 조도 150～300 Lux로 설정된 사육환경에서 폴리카보네이트 사육상자(278×420×200 mm, ㈜쓰리사인, 금산)에 4～5마리씩 수용하였다.
- 병리학적 조직검사를 위해 우선 장기를 육안으로 관찰한 결과 모든 동물에서 장기의 형태, 크기, 색조, 경도 및 기타 병변 등의 육안적 이상 소견을 관찰할 수 없었다. 이에 따라 간장(liver) 및 신장(kidney)를 채취하여 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정 후 조직을 관찰하였다. 간의 경우 대조군, 비조사 타락죽 투여군 및 30 kGy 조사 타락죽 투여군 모두에서 염증, 괴사, bilirubin 침착 및 iron 침착 등의 병적인 변화를 보이지 않았고, 간세포의 구조도 모두 정상이었다(Fig.
- 사육이 끝난 실험동물을 12시간 동안 절식시키고 에테르로 마취하여 혈액을 채취한 다음 간, 비장, 신장, 폐, 심장을 즉시 적출하고 육안으로 각종 장기의 소견을 관찰하였다. 적출한 장기를 생리식염수로 세척하고 여과지로 표면의 수분을 제거한 다음 무게를 측정하였다. 조직학적 검사를 위하여 간과 신장을 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정시킨 후, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매를 하였다.
- 감마선 조사는 시간당 10 kGy의 선량율로 30 kGy의 흡수선량이 되도록 처리하였다. 조사 후 총 흡수선량 확인은 alanine dosimeter(Oeric cerous dosimeter, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였다. Dosimetry 시스템은 국제원자력기구(IAEA)의 규격에 준용하여 표준화한 후 사용하였으며, 총 흡수선량의 오차는 2% 이내였다.
- 적출한 장기를 생리식염수로 세척하고 여과지로 표면의 수분을 제거한 다음 무게를 측정하였다. 조직학적 검사를 위하여 간과 신장을 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정시킨 후, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매를 하였다. 포매된 각 조직은 마이크로톰(Lecia RM2255, Lecia, Wetzlar, Germany)으로 7 μm 박절한 후 hematoxylin & eosin 염색을 실시하여 광학현미경(Axio-imager M1, Carlzeiss, Niedersachsen, Germany)으로 관찰하였다.
- 무작위법으로 암수 각 10마리씩 3개 군으로 나누었다. 즉, AIN-93G 식이를 기본으로 투여한 대조군과 감마선 비조사(0 kGy) 타락죽 투여군, 감마선 조사(30 kGy) 타락죽 투여군으로 구성하였다. 사료는 각각의 필수영양소들을 AIN-93G 규격에 맞게 혼합하여 pellet를 만들어 3개월간 자유로이 섭취시켰고, 필터와 유수 살균기를 이용하여 여과 최대 2 g/kg으로 공비 3으로 급성독성시험을 시험한 결과, 모든 용량에서 급성독성이 나타나지 않아 하루 한 끼 타락죽을 먹는 것으로 설정하여 사료 내 타락죽의 첨가 함량을 30%로 하여 3개월간 독성시험을 실시하였다(Table 1).
- 타락죽 투여 시작일부터 90일까지 매주 3회 모든 동물에 대해 일정 시간에 일반 증상 및 중독 증상, 사망의 유무를 관찰하였다. 동물의 체중도 투여 개시 전부터 투여 후 90일까지 매주 1회 측정하였다.
- 0pt">･살균된 정제수를 자유급식 시켰다. 타락죽의 일반성분 분석 결과, 탄수화물, 지방, 단백질 함량이 건물량(dry basis) 기준으로 각각 73.03, 10.79, 16.18 g/100 g으로 확인되었으므로 타락죽 투여 시험군의 경우에는 타락죽을 30% 투여하는 대신 AIN-93G 식이를 기본으로 casein, corn starch 및 soybean oil의 양을 감소시켜 총 열량을 동일하게 조성한 pellet를 만들어 사용하였다(Table 1).
- 포매된 각 조직은 마이크로톰(Lecia RM2255, Lecia, Wetzlar, Germany)으로 7 μm 박절한 후 hematoxylin & eosin 염색을 실시하여 광학현미경(Axio-imager M1, Carlzeiss, Niedersachsen, Germany)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- Animal, Inc, Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 7일간의 검역 및 순화과정을 거친 후 체중감소가 없는 건강한 동물을 선별하여 시험에 사용하였다. 실험동물은 온도 20.
- 방사선 조사는 선원 11.1 PBq, Co-60 감마선 조사시설(IR-70 gamma irradiator, MDS Nordion, Montreal, Canada)을 이용하였다. 감마선 조사는 시간당 10 kGy의 선량율로 30 kGy의 흡수선량이 되도록 처리하였다.
- 실험동물은 5주령의 특정병원체 부재(specific pathogen free)의 ICR 계열 마우스를 중앙실험동물(주)(Jung-Ang Lab. Animal, Inc, Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 7일간의 검역 및 순화과정을 거친 후 체중감소가 없는 건강한 동물을 선별하여 시험에 사용하였다.
- 타락죽 제조에 사용된 재료는 찹쌀(2010년산, 일반계, 영농조합 참좋은, 정읍), 우유(서울우유, 양주, 경기도)이다. 찹쌀의 2배에 해당하는 물을 찹쌀과 함께 20℃에서 6시간 동안 수침하였고, 이후 흐르는 물에 2회 수세하였다.
데이터처리
- 이상의 실험에서 얻어진 결과는 Statistical Package for Social Sciences 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 one way ANOVA 분석을 하였으며, 시료간의 유의성은 Duncan’s multiple range test로 p＜0.05 수준에서 비교하였다.
이론/모형
- 조사 후 총 흡수선량 확인은 alanine dosimeter(Oeric cerous dosimeter, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였다. Dosimetry 시스템은 국제원자력기구(IAEA)의 규격에 준용하여 표준화한 후 사용하였으며, 총 흡수선량의 오차는 2% 이내였다.
성능/효과
- 30 kGy 조사 타락죽 투여군의 총 백혈구(WBC, white blood cell), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil) 및 호염구(basophil) 수는 대조군 및 타락죽 비조사 투여군과 비교해 유의적 차이를 나타내지 않았다(p<0.05, Table 4).
- 30 kGy 감마선 조사 및 비조사 타락죽을 ICR 마우스에 섭취시키면서 측정한 체중 변화와 사료 섭취량 결과를 Table 2에 나타내었다. 30 kGy 조사 타락죽을 3개월간 투여한 모든 시험군에서 정상적인 체중증가가 관찰되었으며, 대조군 및 타락죽 비조사 투여군과 비교하여 감마선 조사 타락죽 투여에 의한 체중변화 및 식이섭취량은 암수 모두 통계적 유의성을 나타내지 않았다. 주요 장기에 미치는 영향을 조사하기 위해 부검한 후, 각 장기의 무게를 측정한 결과는 Table 3과 같다.
- 혈액학적 검사 및 혈청학적 검사 모두 정상범위 내의 수치를 나타내었으며, 병리조직학적 검사 역시 간 및 신장 모두 염증, 괴사 등의 유의할 만한 병적 변화 없는 정상적인 구조를 유지하고 있었다. 따라서 30 kGy로 감마선 조사된 타락죽을 암수 마우스에 3개월간 섭취시켜도 본 시험조건에서는 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 본 연구는 타락죽의 안전성을 확보하기 위해서 30 kGy 감마선 조사된 타락죽을 ICR 마우스에 3개월간 섭취시킨 다음 독성평가를 수행하였다. 비조사 타락죽 및 30 kGy 조사 타락죽을 암수 마우스에 투여를 한 결과 시험기간 동안 시험물질에 의한 임상증상이나 폐사 동물을 나타나지 않았으며, 체중변화, 사료섭취량 및 주요 장기 무게도 대조군에 비해 차이를 보이지 않았다. 혈액학적 검사 및 혈청학적 검사 모두 정상범위 내의 수치를 나타내었으며, 병리조직학적 검사 역시 간 및 신장 모두 염증, 괴사 등의 유의할 만한 병적 변화 없는 정상적인 구조를 유지하고 있었다.
- 암수 모두 유의성 있는 변화나 시험물질 투여로 인한 특이할 만한 부검소견은 관찰되지 않았으며 간장(liver), 비장(spleen), 신장(kidney), 폐(lung), 심장(heart)에서 유의적인 무게 증가나 감소는 관찰되지 않았다(p<0.05).
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 30 kGy 조사된 타락죽을 3개월간 암수 마우스에 섭취시켜도 본 시험조건에서 독성이 없는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 고선량으로 조사된 분말 죽의 in vivo 독성평가 결과와도 잘 일치되는 것으로 나타났다(13).
- 4%) 내에 속하므로 타락죽의 독성에 기인한 결과는 아닌 것으로 판단된다. 적혈구 암컷의 경우 적혈구(RBC), 헤모글로빈(Hb), 혈중 적혈구 비율(HCT), 평균 적혈구 용적(MCV), 평균 헤모글로빈 함량(MCH), 평균 헤모글로빈 농도(MCHC), 적혈구 크기 분포폭(RDW), 혈소판 수(PLT)에서는 유의적 차이가 나타나지 않았다(Table 5). 다만, 평균 헤모글로빈의 함량(MCH)의 경우 대조군과 유의적인 차이를 보였으나, 감마선 조사로 유도된 독성에 기인한 차이는 아닌 것으로 나타났으며, 측정치도 모두 정상범위(12.
- 30 kGy로 조사된 타락죽을 3개월간 섭취시킨 후 혈액생화학 측정기를 사용하여 혈청을 분석한 결과는 Table 6과 같다. 측정 결과 알부민, ALP, ALT, AST, BUN, 콜레스테롤, creatinine, bilirubin direct, 총 빌리루빈, 포도당, 중성지방, 총 단백질 모두 대조군과 비교해 유의적 차이를 나타내지 않았으며, 수치 또한 모두 정상범위 내에 속하여 30 kGy 조사 타락죽은 혈청 생화학적인 측면에서 문제를 야기하지 않음을 확인할 수 있었다.
- 비조사 타락죽 및 30 kGy 조사 타락죽을 암수 마우스에 투여를 한 결과 시험기간 동안 시험물질에 의한 임상증상이나 폐사 동물을 나타나지 않았으며, 체중변화, 사료섭취량 및 주요 장기 무게도 대조군에 비해 차이를 보이지 않았다. 혈액학적 검사 및 혈청학적 검사 모두 정상범위 내의 수치를 나타내었으며, 병리조직학적 검사 역시 간 및 신장 모두 염증, 괴사 등의 유의할 만한 병적 변화 없는 정상적인 구조를 유지하고 있었다. 따라서 30 kGy로 감마선 조사된 타락죽을 암수 마우스에 3개월간 섭취시켜도 본 시험조건에서는 독성이 없는 것으로 나타났다.
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