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문제 정의
- 또한 제랄레논 분석 과정 중 불확도 요인으로 시료전처리, 표준용액, 기기분석, 반복성, 재현성, 검량선작성등을 추정하여 분석결과에 미치는 영향을 알아보고자 한다.
- 본 연구는 시중 유통되고 있는 곡류가공품 중 zearalenone을 immunoaffinity column 및 LC-MS/MS를 이용해 분석하였다. 표준 용액의 검량선은 1, 10, 50, 100, 250 ng/mL농도 범위에서 상관계 수(r2) 0.
- 이에 본 연구에서는 LC-FLD보다 높은 감도와 선택성의 LC-MS/MS를 이용해 식품 중 제랄레논을 immunoaffinity column으로 정제 후 분석하였다. 이를 토대로 서울시내 유통되고 있는 곡류 가공품 중 옥수수가공품, 과자류, 침출차 및 기타영유아식품 등의 오염실태를 조사하여 식품에 대한 안전성을 확보하고 제랄레논에 관한 기초 자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
- LC-MS/MS를 이용하여 시료를 6회 반복 측정해 검출된 peak의 area의 값을 산출하였다. 반복 측정한 평균값은 317.
- 각각의 단계에서 사용된 메스플라스크와 피펫의 불확도를 계산하여 불확도 요인으로 고려하였다. 메스플라스크의 불확도는 플라스크에 표시된 교정성적서상에 대한 불확도, 시험원의 눈금 읽기에 대한 측정반복성에 대한 불확도, 온도 변화에 따른 물의 변화에 대한 불확도를 요인으로 고려해 계산하여 상대표준불확도를 구하였으며, 피펫은 피펫에 표시된 교정성적서상에 대한 불확도와 시험원의 눈금 읽기에 대한 측정반복성에 대한 불확도를 요인으로 상대표준불확도를 구하였다.
- 검량선의 불확도 측정을 위하여 보관표준용액으로부터 희석된 1, 10, 50, 100, 250 ng/mL를 3회씩 반복 LC-MS/MS로 측정하여 작성하였다. 상관계수(r2)는 보리차 미숫가루 과자 모두 0.
- 각각의 단계에서 사용된 메스플라스크와 피펫의 불확도를 계산하여 불확도 요인으로 고려하였다. 메스플라스크의 불확도는 플라스크에 표시된 교정성적서상에 대한 불확도, 시험원의 눈금 읽기에 대한 측정반복성에 대한 불확도, 온도 변화에 따른 물의 변화에 대한 불확도를 요인으로 고려해 계산하여 상대표준불확도를 구하였으며, 피펫은 피펫에 표시된 교정성적서상에 대한 불확도와 시험원의 눈금 읽기에 대한 측정반복성에 대한 불확도를 요인으로 상대표준불확도를 구하였다.
- 분석장비는 Agilent 1200 series LC(Foster City, CA, USA)가 부착된 Applied Biosystems(Foster City, CA, USA)의 Q TRAP 3200 질량분석기를 사용하였고, 분석에 사용한 컬럼은 Luna C18(150×3 mm, 3 µ, Phenomenex, CA, USA)이었으며, 시료분쇄기(Blixer, MS, USA), 균질기(Omni International, GA, USA), vacuum system(Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan) 등으로 시료를 전처리하였다.
- 시료의 기질에 대한 불확도는 반복측정과 회수율 불확도의 상대표준불확도를 합성하여 구하였다. 표준불확도는 식(2)에 의하여 계산하였으며, 41.
- 이에 본 연구에서는 LC-FLD보다 높은 감도와 선택성의 LC-MS/MS를 이용해 식품 중 제랄레논을 immunoaffinity column으로 정제 후 분석하였다. 이를 토대로 서울시내 유통되고 있는 곡류 가공품 중 옥수수가공품, 과자류, 침출차 및 기타영유아식품 등의 오염실태를 조사하여 식품에 대한 안전성을 확보하고 제랄레논에 관한 기초 자료로 활용하고자 한다.
- 제랄레논 표준품 25 mg을 acetonitrile 10 mL에 녹여 농도를 2,500 µg/mL로 하고, 최종 농도가 1, 10, 50, 100, 250 ng/mL가 되도록 75% acetonitrile로 희석하여 검량선용 표준용액으로 사용하였다.
- 제랄레논이 검출되지 않은 시료 중 보리차, 미숫가루, 과자에 최종농도가 각각 41.7, 166.7 µg/kg이 되도록 제랄레논 표준용액을 첨가하여 위와 동일하게 3회 반복 실험하였다.
- 보리차, 미숫가루, 과자에서 각 요인들의 상대표준불확도를 식 (5)를 이용하여 계산한 결과는 Table 5와 같다. 즉, 위에서 구한각 불확도 인자의 상대표준불확도들을 합성하여 상대합성불확도를 계산하고 측정값을 곱하여 합성표준불확도를 구하였다. 41.
- 표준용액의 불확도는 보관표준용액과 각각의 희석된 농도의 불확도를 이용하여 구하였다(Table 4). 보관표준용액은 제랄레논 표준품 25 mg을 acetonitrile 10 mL에 녹여 2,500 µg/mL로 제조 하였다.
대상 데이터
- Ltd.(Tokyo, Japan)제품을 사용하였고, nyron syringe filter는 Chemco Scientific(Osaka, Japan)사 제품을 사용하였다. 정제용 immunoaffinity column은 zearala test(Vicam, MA, USA)를 이용하였다.
- 2011년 서울지역에서 유통되고 있는 곡류가공품 중 옥수수가공품, 과자류, 침출차, 기타영유아식, 찹쌀가루 및 기타곡류가공품을 총 89건을 구입하여 제랄레논 분석에 사용하였다. 모든 시료는 포장단위로 균질화 하여 −20℃ 냉동 보관하였다.
- 시중에 유통되고 있는 곡류가공품 중 옥수수가공품, 과자류, 침출차, 기타영유아식, 찹쌀가루 및 기타곡류가공품 등 총 89건을 대형마트에서 구입하여 제랄레논의 오염도를 조사하였다. 그 결과는 Table 3과 같다.
- 제랄레논 표준품은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 및 분석에 사용된 acetonitrile, methanol 은 Fisher Scientific(Basingstoke, UK)제품을 사용하였고, sodium chloride(Merck Co.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 및 분석에 사용된 acetonitrile, methanol 은 Fisher Scientific(Basingstoke, UK)제품을 사용하였고, sodium chloride(Merck Co., Darmstadt, Germany), Tween 20(Junsei, Tokyo, Japan) 등 분석에 사용된 모든 시약 및 용매는 특급 및 그 이상의 수준으로 구입하여 사용하였다. 여과지는 Toyo Roshi Kaisha.
데이터처리
- 반복 측정한 평균값을 측정값으로 사용한 경우, 평균값을 표준불확도를 적용하여 A type 표준불확도 식(2)로 평가하였다. 반복 시험에 대한 불확도는 합동(pooled)표준편차 방법에 따라 식(3)과 (4)를 적용하여 A type 불확도를 구하였으며, 플라스크, 피펫, 저울 등의 교정성적서상의 결과를 사용하는 경우와 반복 측정하지 않는 경우는 B type 표준불확도로 평가하였다.
- 자유도는 KOLAS에서 발간한 측정 결과의 불확도 산정 및 표현을 위한 지침에 따라 구하였다(18). 즉, 반복 측정시 자유도는 n-1로 계산하였고, 최소제곱방법에 의하여 직선의 절편과 기울기를 결정하기 위해 n개의 독립적인 관측값이 사용된 경우에는 절편 또는 기울기에 대한 표준불확도의 자유도를 n-2로 계산하였다.
이론/모형
- 999였다. 검정곡선은 선형 최소제곱법을 이용하여 산출하였으며 검정 곡선의 불확도는 (9)-(12)의 식을 이용하여 계산하였다. 41.
- 반복 측정한 평균값을 측정값으로 사용한 경우, 평균값을 표준불확도를 적용하여 A type 표준불확도 식(2)로 평가하였다. 반복 시험에 대한 불확도는 합동(pooled)표준편차 방법에 따라 식(3)과 (4)를 적용하여 A type 불확도를 구하였으며, 플라스크, 피펫, 저울 등의 교정성적서상의 결과를 사용하는 경우와 반복 측정하지 않는 경우는 B type 표준불확도로 평가하였다. 자유도는 KOLAS에서 발간한 측정 결과의 불확도 산정 및 표현을 위한 지침에 따라 구하였다(18).
- 반복 시험에 대한 불확도는 합동(pooled)표준편차 방법에 따라 식(3)과 (4)를 적용하여 A type 불확도를 구하였으며, 플라스크, 피펫, 저울 등의 교정성적서상의 결과를 사용하는 경우와 반복 측정하지 않는 경우는 B type 표준불확도로 평가하였다. 자유도는 KOLAS에서 발간한 측정 결과의 불확도 산정 및 표현을 위한 지침에 따라 구하였다(18). 즉, 반복 측정시 자유도는 n-1로 계산하였고, 최소제곱방법에 의하여 직선의 절편과 기울기를 결정하기 위해 n개의 독립적인 관측값이 사용된 경우에는 절편 또는 기울기에 대한 표준불확도의 자유도를 n-2로 계산하였다.
- (Tokyo, Japan)제품을 사용하였고, nyron syringe filter는 Chemco Scientific(Osaka, Japan)사 제품을 사용하였다. 정제용 immunoaffinity column은 zearala test(Vicam, MA, USA)를 이용하였다.
- 확장불확도는 포함인자 k를 곱하여 식(8)에 의해 계산하였다. 포함인자 k는 자유도가 10보다 클 경우 2로 계산하였으며, 그 이하일 경우 t-분포표에 따라 계산하였다. 식 (6,7)의 따라 계산된 포함인자는 41.
- 확장불확도는 포함인자 k와 계산된 합성표준불확도를 곱하여 식(8)을 이용해 구하였다. 포함인자 k는 측정결과의 불확도 산정 및 표현을 위한 지침(14) 및 EURACHEM/CITAC Guide(17)의 방법에 따라 측정의 자유도가 식(6,7)을 이용해 계산하였을때 10 보다 클 경우 95% 신뢰수준에서 k의 값은 2를 채택하였으며, 그 이하일 경우는 t-분포표를 이용하였다.
- 합성표준불확도는 측정결과가 여러개의 다른 입력량으로부터 구해질 때 이 측정결과의 표준불확도이며, 합성은 불확도 전파의 법칙(law of propagation of uncertainty) 식(5)를 이용하여 구하였다.
성능/효과
- Product ion 283 m/z으로 정량하여 분석 한 결과 과자류 21건 중 1건(4.8%) 2.3 µg/kg, 옥수수가공품 9건 중 2건(22.2%) 1.6-8.5 µg/kg, 기타곡류가공품 14건 중 선식 1건 (7.1%)에서 3.4 µg/kg이 검출되었다.
- 7 µg/kg이었다. 검출시료 12건은 product ion 187 m/z으로 모두 제랄레논임을 확인하였다. 제랄레 논을 측정하는 과정 중 불확도 인자를 파악하여 측정 불확도를 추정 한 결과 41.
- 검출한계(limit of detection)는 3.3 σ(표준편차)/S(검량선의기울기), 정량한계(limit of quantification) 10 σ/S로 구한 결과 각각 0.3, 1.0 µg/kg이었다.
- 미숫가루가 19건 중 6건 (31.6%)이 검출되어, 최고 검출율을 나타냈으며, 1.1-29.7 µg/kg의 검출농도를 나타내어 다른 곡류가공품에 비해 높은 수준이었다.
- 본 연구에서 구한 검출한계는 Lindner 등(10)의 검출한계 0.5 µg/ kg 보다 낮은 수준이었으며, 기존 연구에서 보고된 LC-FLD의 검출한계 Moren-Bondi 등(20) 6 µg/kg, Mateo 등(21)의 4 µg/kg보다 10배 이상의 낮은 검출한계를 보였다.
- 본 연구에서도 다양한 곡물을 볶아서 분말화한 제품인 미숫가루에서 57.9%의 가장 높은 검출율과 검출농도를 나타낸 것과도 일치하는 결과라 할 수 있을 것이다.
- 6%로 나타났다. 분석법의 정밀도 지표로 나타내는 RSD값은 각각 보리차 3.9, 1.5%, 미숫가루 10.4, 6.7% 과자는 12.8, 4.3%를 나타내었다(Table 2).
- 0002이 된다. 저울 안정성은 분동 25 g을 이용하여 10회 반복 측정한 값의 표준편차 0.00326 g을 표준불확도로 구하였으며, 저울의 분해능은 0.0001 g이며, 분해능에 대한 표준불확도는 0.000029이었다. 저울의 합성 표준불확도는 각 표준불확도에 대한 제곱합의 제곱근으로 0.
- 제랄레 논을 측정하는 과정 중 불확도 인자를 파악하여 측정 불확도를 추정 한 결과 41.7, 166.7 µg/kg일때 보리차는 각각 44.9±5.0 µg/ kg(95% 신뢰수준 약 k=2), 128.7±7.9 µg/kg(95% 신뢰수준 약 k=2), 미숫가루는 각각 30.7±5.8 µg/kg(95% 신뢰수준 약 k=2), 173.7±14.9 µg/kg(95% 신뢰수준 k=2.26), 과자는 37.2±7.4 µg/kg (95% 신뢰수준 k=2.31), 151.0±10.4 µg/kg(95% 신뢰수준 약 k=2) 를 나타내었다.
- 제랄레논 최종농도가 41.7, 166.7 µg/kg인 각 시료에 대한 회수율을 검토한 결과 보리차는 각각 107.8, 77.2%, 미숫가루는 73.6, 104.2%, 과자는 89.1, 90.6%로 나타났다.
- 총 시료 89건 중 10건 검출되어 11.2%의 검출율을 보였고 과자류에서는 21건 중 1건에서 2.3 µg/kg, 옥수수가공품 9건 중 2건에서 1.2-7.7 µg/kg, 기타곡류가공품 14건 중 선식에서 1건 3.4 µg/kg이 검출되었다.
- 총 시료 89건 중 10건에서 제랄레논이 검출되어 11.2%의 검출율 을 보였고, 오염수준은 1.1-29.7 µg/kg이었다.
- 표준 용액의 검량선은 1, 10, 50, 100, 250 ng/mL농도 범위에서 상관계 수(r2) 0.999 이상으로 양호한 직선성을 보였고, 검출한계 및 정 량한계는 각각 0.3, 1.0 µg/kg이었다.
후속연구
- 여러 가지 곡물 들을 원료로 하는 국내산 및 수입산의 다양한 영유아용 곡류조제식 제품이 유통되고 있어, 선택성과 높은 감도를 가지는 LC-MS/MS 방법 등을 이용한 지속적인 품질검사가 이루어져야 할 것이다.
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