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문제 정의
- 본 연구에서는 데옥시니발레놀 분석 시 오차요인의 영향을 감소시킨 분석법 확립에 도움이 되게 하고자, 분석에 영향을 미치는 여러 가지 불확도 요인들을 평가하였다. 즉, 밀에 오염된 데옥시니발레놀을 면역친화컬럼으로 정제한 다음 HPLC-자외선검출기로 검출하는 분석법에 있어 각 단계마다 실험오차에 영향을 미치는 요인들을 알아보고, 관계식을 설정한 다음 요인별 측정값으로부터 표준불확도, 합성불확도 및 확장불확도를 산정하였다.
- 본 연구에서는 밀 시료에서 면역친화컬럼을 이용한 HPLC분석법으로 데옥시니발레놀을 분석함에 있어서 발생될 수 있는 측정불확도를 GUM 지침에 따라 산정하였다. 분석과정에서의 불확도 요인은 시료량 측정, 최종 시료부피, 보관표준용액, 작업표준용액, 표준용액, 기기, 매질, 검량선 작성으로 구분하였다.
가설 설정
- 1)This effectively means that values falling within these ranges may be regarded as being of the same analytical population.
제안 방법
- STD1000 용액의 불확도는 STDW의 불확도와 0.2와 3.8 mL의 마이크로피펫의 불확도를 고려하여 구하였다. 0.
- STD100는 STD500용액을 0.8 mL 취하여 4 mL로 희석하여 조제하였고 STD100 용액의 불확도는 STD500의 불확도와 0.8 mL와 3.2 mL 마이크로피펫의 불확도를 고려하였다. 보관표준용액 제조시 불확도에서 언급한 바와 같이 0.
- STD500 용액의 불확도는 STD1000 용액의 불확도와 1 mL 마이크로피펫의 2회 사용에 대한 불확도를 고려하여 구하였다. STD1000의 불확도는 0.
- 각 요인이 전체 불확도에 끼치는 영향을 막대그래프로 표현하였다(Fig. 3). 포함된 불확도인자의 상대불확도가 최종 시험결과 값에 미치는 영향을 살펴보면 시료무게(0.
- 검량선은 25, 50, 100, 500, 1,000 ng/mL의 표준용액을 각각 6회씩 반복 측정하여 작성하였다. 그 결과 상관계수(R2)는 0.
- 데옥시니발레놀 분석법은 영국 식품기준청(FSA)의 방법을 다소 변형하여 사용하였다(16). 즉, 구입한 시료 2-2.
- 000135 g이 된다. 무게를 반복 측정할 때 발생하는 불확도는 시료의 무게에 해당하는 20 g의 분동을 저울로 5일에 걸쳐 5회 반복 측정하여 얻은 값을 식 (5)와 (6)을 적용하여 얻었으며 표준불확도(Urepeatability, (u(WRp)) 0.000110 g을 구하였다. 또한, 저울의 분해능은 0.
- 보관표준용액 25 µg/mL를 시료 20 g에 240 µL를 첨가하여 시료에서 데옥시니발레놀 오염농도가 300 µg/kg이 되도록 처리하여 10회 반복 측정하였다.
- 본 연구에서는 밀 시료에서 면역친화컬럼을 이용한 HPLC분석법으로 데옥시니발레놀을 분석함에 있어서 발생될 수 있는 측정불확도를 GUM 지침에 따라 산정하였다. 분석과정에서의 불확도 요인은 시료량 측정, 최종 시료부피, 보관표준용액, 작업표준용액, 표준용액, 기기, 매질, 검량선 작성으로 구분하였다. 불확도 요인의 구성요인은 저울의 안정성, 분해능, 재현성, 표준물질의 순도, 분자량, 농도, 표준용액 희석, 검량선, 회수율 및 분석기기의 재현성 등이 작용하였다.
- 시료의 기질에 대한 불확도는 반복 측정과 회수율 불확도의 상대불확도를 합성하여 구하였다. 밀의 공시료에 300 µg/kg을 첨가한 실험을 10회 반복 측정한 결과값은 255.
- 8 mL acetonitrile에 녹여 약 25 µg/mL로 제조하고 이 용액의 흡광도를 측정하여 250 µg/mL 용액의 농도를 보정하였다. 이 과정에 포함되는 각 마이크로피펫(0.2, 1, 5 mL)의 교정성적서 상의 불확도와 각 부피의 반복 측정 시 불확도, 표준품의 분자량 불확도를 고려하여 보관표준용액의 불확도를 구하였다(Table 2). 0.
- 이용액을 다시 200 µL 취하여 1.8 mL acetonitrile에 녹여 25 µg/mL로 만든 용액의 흡광도(220 nm)를 측정하여 보정함으로써 250µg/mL 용액의 농도를 보정하였다.
- 여러 번 측정하여 구한 평균값을 해당 요인의 측정값으로 사용할 경우, 평균값의 표준편차는 식 (4)를 적용하여 A type 표준불확도로 구하였다. 저울과 플라스크, 피펫 등의 교정시험검사결과를 사용하는 경우나 반복 측정하지 않은 경우는 B type 표준불확도로 평가하였고 반복시험에 대한 불확도는 공통(pooled) 실험표준편차 방법에 따라 식 (5)과 (6)을 적용하여 A type 불확도를 구하였다.
- 본 연구에서는 데옥시니발레놀 분석 시 오차요인의 영향을 감소시킨 분석법 확립에 도움이 되게 하고자, 분석에 영향을 미치는 여러 가지 불확도 요인들을 평가하였다. 즉, 밀에 오염된 데옥시니발레놀을 면역친화컬럼으로 정제한 다음 HPLC-자외선검출기로 검출하는 분석법에 있어 각 단계마다 실험오차에 영향을 미치는 요인들을 알아보고, 관계식을 설정한 다음 요인별 측정값으로부터 표준불확도, 합성불확도 및 확장불확도를 산정하였다.
- 표준용액은 보관표준용액 25µg/mL를 최종농도가 25, 50, 100, 500, 1,000 ng/mL가 되도록 희석하여 제조하였다.
- 확장불확도는 합성표준불확도 35.81 µg/kg에 포함인자(k=2, 신뢰수준 95%)를 곱하여 산출하였다.
대상 데이터
- 실험결과 검증을 위한 인증표준물질(CRM: Certified Reference Material) BCR-379(Community Bureau for Reference, the Former reference materials programme of the European Commission)은 Institute for Reference Materials and Measurements로부터 구입하여 사용하였다. Immunoaffinity column DONtest WB와 유리섬유여과지 GF/B는 각각 VICAM사(Watertown, MA, USA)와 Whatman사(Maidstone, UK)에서 구입하였다. 데옥시니발레놀의 보관표준용액은 표준물질 5 mg에 acetonitrile 4 mL를 넣어 1.
- 데옥시니발레놀의 표준품은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 acetonitrile, methanol 및 water는 Burdick & Jackson(Muskegon, MI, USA)사에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 acetonitrile, methanol 및 water는 Burdick & Jackson(Muskegon, MI, USA)사에서 구입하였다. 실험결과 검증을 위한 인증표준물질(CRM: Certified Reference Material) BCR-379(Community Bureau for Reference, the Former reference materials programme of the European Commission)은 Institute for Reference Materials and Measurements로부터 구입하여 사용하였다. Immunoaffinity column DONtest WB와 유리섬유여과지 GF/B는 각각 VICAM사(Watertown, MA, USA)와 Whatman사(Maidstone, UK)에서 구입하였다.
- 컬럼은 C18 reverse phase Synergi Hydro RP(250 mm×4.6 mm, 4 µm)를 이용하였고 오븐온도는 40°C로 설정하였다.
데이터처리
- 여러 번 측정하여 구한 평균값을 해당 요인의 측정값으로 사용할 경우, 평균값의 표준편차는 식 (4)를 적용하여 A type 표준불확도로 구하였다. 저울과 플라스크, 피펫 등의 교정시험검사결과를 사용하는 경우나 반복 측정하지 않은 경우는 B type 표준불확도로 평가하였고 반복시험에 대한 불확도는 공통(pooled) 실험표준편차 방법에 따라 식 (5)과 (6)을 적용하여 A type 불확도를 구하였다.
이론/모형
- HPLC는 JASCO HPLC system을 이용하였다. 컬럼은 C18 reverse phase Synergi Hydro RP(250 mm×4.
- 확장불확도는 포함인자 k와 계산된 합성표준불확도를 곱하여 식 (8)을 이용하여 구하였다. 이 때, 포함인자 k의 값은 EURACHEM/CITAC Guide(10)의 방법에 따라 95% 신뢰수준에서 포함인자 k값을 2로 기준하여 확장불확도를 계산하였다.
- 측정결과가 여러 개의 다른 입력량으로부터 구해질 때 이 측정결과의 표준불확도를 합성표준불확도라고 하며, 불확도 전파의 법칙(law of propagation of uncertainty)(7)을 이용하여 구하였다.
성능/효과
- 2, 1, 5 mL)의 교정성적서 상의 불확도와 각 부피의 반복 측정 시 불확도, 표준품의 분자량 불확도를 고려하여 보관표준용액의 불확도를 구하였다(Table 2). 0.2 와1 mL 마이크로피펫의 교정성적서 불확도는 각각 0.008, 5 mL 마이크로피펫의 교정성적서 불확도는 0.006 mL이었다. 이 피펫을 이용하여 0.
- 005이다. 3.2 mL 마이크로피펫은 합성표준불확도는 0.003 mL이고 상대표준불확도는 0.000938이다. STD100용액의 불확도는 0.
- HPLC를 이용하여 시료를 6회 반복 분석한 결과 평균값은 40960.5이고 상대표준편차는 0.778%였다. A type의 표준오차로 산출된 표준불확도는 표준편차를 #으로 나눈 값 0.
- 000938이다. STD100용액의 불확도는 0.8 mL와 3.2 mL 마이크로피펫의 불확도인 0.004와 0.005의 제곱값, STD500용액 불확도인 0.029723의 제곱값을 합하여 제곱근을 구한 값인 0.030152이었다. STD50용액은 STD500용액 제조 시와 마찬가지로 STD100용액을 1 mL를 취하여 2배 희석하여 만들었다.
- STD25용액은 STD50용액과 같은 방법으로 만들었으므로 2회 사용된 1 mL 마이크로피펫의 상대표준불확도인 0.004와 STD50용액의 불확도인 0.030725의 제곱합의 제곱근을 구한 결과, STD25용액의 합성상대표준불확도는 0.031315이었다.
- 753677×10−8 )로 나타났다. 가장 큰 영향을 끼치는 요인으로 매질의 반복측정임을 알 수 있었고 그 다음으로 검량선 작성, 표준물질의 제조였다. 매질에 의한 불확도는 회수율의 재현성 불확도와 회수율 불확도의 상대 불확도를 합성하여 구한 것으로 매질에 따른 불확도의 차이가 있으리라 예상되며 분석함에 있어 회수율 재현성을 높이기 위해 노력해야 할 것이다.
- 공시료에 데옥시니발레놀 300 µg/kg 을 첨가하여 분석한 결과 255.29±71.62 µg/kg으로 측정되었다.
- 002323이었다. 그러므로 STDW의 합성상대표준불확도는 보관표준용액의 불확도 0.020718, 1 mL 피펫의 불확도 0.004, 10 mL 정용플라스크의 불확도 0.002323의 제곱합의 제곱근인 0.021229이었다.
- 81 µg/kg에 포함인자(k=2, 신뢰수준 95%)를 곱하여 산출하였다. 밀에서 데옥시니발레놀을 분석함에 있어 불확도에 영향을 주는 주요인자는 시료의 회수율과 검량선 작성인 것으로 파악되었다. 따라서 밀 시료에서 데옥시니발레놀 분석의 정밀성을 높이기 위해서는 회수율과 검량선 작성에 영향을 끼칠 수 있는 면역친화컬럼에 의한 시료의 정제과정과 표준물질의 희석과정에 주의를 기울이고 주기적으로 마이크로피펫을 교정하는 등 세심한 관리가 필요할 것으로 판단된다.
- 밀의 공시료에 300 µg/kg을 첨가한 실험을 10회 반복 측정한 결과값은 255.29 µg/kg이었고 상대 표준편차는 2.038%, 회수율은 85%였다.
- 시험결과의 소급성 유지를 위해 인증표준물질(CRM)인 BCR379(wheat, 673±20 µg/kg)을 이용하여 같은 방법으로 분석한 결과 683 µg/kg으로 검출되었고 회수율은 101%였으며, 실험에 사용된 표준인증물질의 보증범위에 속하는 결과값으로 나타나 본 실험결과의 소급성을 확인할 수 있었다.
- 즉, 시료량(Ws ) 0.000017, 최종부피(Vf ) 0.008, 보관 표준용액(STD) 0.020718, 표준용액(STDW) 0.021229, STD10000.029177, STD500 0.029723, STD100 0.030152, STD50 0.030725, STD25 0.031315, 검량선(Lc ) 0.062371, 매질(Rm) 0.101385, 기기(I) 7.753677×10−8의 제곱합의 제곱근인 0.140291이었다(Table 3).
- 포함된 불확도인자의 상대불확도가 최종 시험결과 값에 미치는 영향을 살펴보면 시료무게(0.000017), 최종전량(0.008), STD(0.020718), STDw(0.021229), STD1000(0.029177), STD500 (0.029723), STD100(0.030152), STD50(0.030725), STD25(0.031315), 검량선(0.062371), 매질(0.101385), 기기(7.753677×10−8 )로 나타났다.
- 합성표준불확도에 포함인자 k=2값을 곱하여 확장불확도를 계산한 결과 확장불확도는 71.62 µg/kg으로 산정되어, 최종결과값은 255.29±71.62 µg/kg으로 표현되었다.
후속연구
- 밀에서 데옥시니발레놀을 분석함에 있어 불확도에 영향을 주는 주요인자는 시료의 회수율과 검량선 작성인 것으로 파악되었다. 따라서 밀 시료에서 데옥시니발레놀 분석의 정밀성을 높이기 위해서는 회수율과 검량선 작성에 영향을 끼칠 수 있는 면역친화컬럼에 의한 시료의 정제과정과 표준물질의 희석과정에 주의를 기울이고 주기적으로 마이크로피펫을 교정하는 등 세심한 관리가 필요할 것으로 판단된다.
- 가장 큰 영향을 끼치는 요인으로 매질의 반복측정임을 알 수 있었고 그 다음으로 검량선 작성, 표준물질의 제조였다. 매질에 의한 불확도는 회수율의 재현성 불확도와 회수율 불확도의 상대 불확도를 합성하여 구한 것으로 매질에 따른 불확도의 차이가 있으리라 예상되며 분석함에 있어 회수율 재현성을 높이기 위해 노력해야 할 것이다.
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