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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 톳으로부터 인간 간암세포(HepG2 cell) 증식 억제 효능을 가진 당단백질을 추출하였으며 apoptotic pathway에 초점을 맞춰 그 작용 기전을 살펴보고자 한다.
- 본 연구에서는 톳 당단백질에 의한 인체 간암세포주인 HepG2 세포의 증식저해 및 apoptosis 유발의 기전을 밝히고자 HFGP를 분리하였다(Fig. 1). HFGP는 silver staining으로 15 kDa의 분자량의 단백질임을 band로 확인하였으며(Fig.
- (2005)는 cyclin D의 과발현에 의해 G1/S기로 세포주기가 빠르게 진행되어 암 발생을 유도한다고 보고하였다. 세포주기 조절인자의 조절에 의해 손상된 DNA의 합성과 세포분열을 억제하고 암세포의 세포증식을 저해하여 궁극적으로 apoptosis를 유도할 수 있으므로 본 실험에서는 G1/S기로 넘어가는 중요 세포주기 조절자인 cyclin과 cdk의 발현 변화에 따라 HFGP에 의한 HepG2 세포성장을 저해하는지 확인하였다. 단백질 발현을 분석한 결과, HFGP를 25 µg/mL 농도로 처리시 cyclin D의 경우 25.
제안 방법
- HFGP 처리에 따른 HepG2 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 96-well plate에 2×104 cells/well로 세포를 분주한 후 HFGP를 0, 6.25, 12.5, 25 μg/mL 농도로 배지에 희석하여 배양하였다.
- HFGP 처리에 따른 세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 HFGP 를 0, 6.25, 12.5, 25 μg/mL 로 24시간 처리하였으며, 이후에 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하여 위상차현미경(Olympus IX51, Japan)을 이용하여 400배 배율로 관찰하였다.
- HFGP 처리에 의하여 apoptosis가 유발된 HepG2세포들의 정량적 비교를 위하여 준비된 HepG2 세포를 회수하고 PBS로 세척한 후 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI) 염색을 실시하였다. 염색 후 DNA flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 이용하여 형광반응에 따른 histogram을 각 처리 농도로 분석하였다.
- 세포가 손상을 입게 되면 세포분열을 하기 전에 G1 세포주기에 머물면서 apoptosis 유도로 갈 것인지, 혹은 손상을 회복한 후 재분열 할 것인지를 결정하게 된다(Kohn, 1999). HFGP 처리에 의한 HepG2 세포의 증식억제가 apoptosis 유도에 의한 것인지를 확인하기 위해 flow cytometry를 이용하여 sub-G1에 속하는 세포의 빈도를 측정하여 apoptosis의 정량화를 실시하였다. 분석 결과, 세포의 사멸을 의미하는 sub-G1비율이 대조군에서 2.
- 5)]에서 blocking 과정을 거친 후에 1차 항체를 TBS-T 에 1:1,000비율로 희석하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 2차 항체를 TBS-T에 1:10,000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰으며 super signal west pico stable peroxide solution과 super signal west pico luminol/enhancer solution(Rockford, IL, USA)을 사용하여 KODAK X-ray film에 감광시켜 나타나는 밴드로 단백질 활성을 관찰하고 단백질 발현 수준을 densitometer (FujiFilm, JAPAN)로 나타내었다.
- 단백질 발현 변화를 관찰하기 위해 HFGP를 농도별로 처리한 세포에 RIPA lysis buffer [50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1 mM Na3VO4, 1 μ g/mL aprotinin, 1 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL pepstatin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 0.25% sodium deoxycholate]를 첨가하여 단백질을 회수하였다.
- HFGP 처리에 의하여 apoptosis가 유발된 HepG2세포들의 정량적 비교를 위하여 준비된 HepG2 세포를 회수하고 PBS로 세척한 후 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI) 염색을 실시하였다. 염색 후 DNA flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 이용하여 형광반응에 따른 histogram을 각 처리 농도로 분석하였다.
- 이 후 silver staining solution (1 g/L silver nitrate, 0.15 mL/L 37% formaldehyde)을 30분간 처리하여 염색하고 develop solution (30 g sodium carbonate, 20 μL 0.4 M sodium thiosulfate, 1.5 mL/L 37% formaldehyde)에서 band가 확인될 때까지 반응시켰으며 stop solution (40% methanol, 10% acetic acid)으로 반응을 정지시켜 최종 확인하였다.
- 이상에서 추출한 HFGP 내 단백질의 존재를 확인하기 위해 silver staining을 실시하였다. 15% SDS-gel에 전기영동 후 fixing solution (40% methanol, 10% acetic acid)에 20분간 고정 후 증류수로 5분씩 2회 세척하였다.
대상 데이터
- 2)로 걸러내어 당을 제거하였으며 최종농도 80% (w/v)가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하여 4℃에서 24시간동안 교반하여 당단백질을 흡착시켰다. 당 단백질에 흡착된 ammonium sulfate는 투석막(Spectra/Por membrane MWCO 3,500, CA, USA)을 이용하여 제거하였으며 0.1 M NaIO4를 25℃, 4시간 동안 처리한 후 20% ethylene glycol을 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤, 감압농축기(EYELA N-N series, Tokyo rikakikai co., LTD, JAPAN) 와 동결건조기(EYELA FDU-2100, Tokyo rikakikai co., LTD, JAPAN)를 사용하여 회수한 분말을 실험에 사용하였다(Fig. 1).
- 본 실험에 사용된 톳은 전라남도 완도 톳 양식장에서 구입하여 사용하였으며, 톳 당단백질(H. fusiformis glycoprotein, HFGP)을 얻기 위해 환류 냉각장치가 장착된 추출기를 이용하여 톳 분말 40 g 당 증류수 1 L를 가하여 80℃에서 3시간 동안 추출하였다. 이를 원심분리기(Supra-22K, Hanil, Korea)를 사용하여 4,416 g, 4℃, 30분 조건에서 분리하고 상층액 3배 부피의 95% ethyl alcohol 을 첨가하여 4℃, overnight 후 whatman filter paper (No.
- 본 실험에 사용한 HepG2 (#HB-8065) 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Gaitherberg, MD, USA)과 100 units/mL의 penicilin-streptomyocin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 minimum essential medium eagle (MEM; Sigma Chemical Co.
- 본 실험에 사용한 HepG2 (#HB-8065) 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Gaitherberg, MD, USA)과 100 units/mL의 penicilin-streptomyocin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 minimum essential medium eagle (MEM; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 조건에서 confluence 80% 배양 시 실험을 진행하였다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험분석 결과는 평균과 표준편차(mean± S.D.)로 나타내었으며, SPSS (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 ANOVA test로 검증한 후, 유의적인 차이가 있는 항목에 대하여P<0.05수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 평균값 간의 차이에 대한 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- (A) The glycoprotein extracted Hizikia fusiformis was loaded with SDS-PAGE and stained with silver staining. 1, protein marker; 2, H. fusiformis glycoprotein (HFGP) (B) The glycoprotein extracted H. fusiformis was measured with sulfate-phenol method. 1.
성능/효과
- 25 µg/mL 처리 시 5.61%, 7.88%, 10.45% 농도 의존적인 비율 증가를 보였다(Table 1).
- 1). HFGP는 silver staining으로 15 kDa의 분자량의 단백질임을 band로 확인하였으며(Fig. 2A), 황산페놀을 이용하여 당의 함량을 측정한 결과 톳 열수추출물(36.7%)에 비하여 32.3% 감소한 4.5%의 당이 존재하였다(Fig. 2B). 따라서 본 실험에 사용된 HFGP는 4.
- HepG2 세포의 증식에 HFGP가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 세포생존율을 분석한 결과, Fig. 3A에서 나타난 바와 같이 HFGP 6.25 μg/mL에서 60.47±3.85%, 12.5 μg/ mL에서 59.05±5.17%, 25 μg/mL에서 52.36±2.37%의 농도의존적 증식 억제를 하는 것으로 나타났다.
- 단백질 발현을 분석한 결과, HFGP를 25 µg/mL 농도로 처리시 cyclin D의 경우 25.9%, cyclin E는 65.4%, cdk4는 62.2% 발현 감소를 나타내었다(Fig. 4).
- 따라서 Bcl-2 family에 속하는 유전자들 간의 조절이 HFGP에 의해 유발되는 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지 확인한 결과, 세포생존에 관여하는 anti-apoptotic member인 Bcl-2 발현의 감소 및 세포사멸에 관여하는 pro-apoptotic member인 Bax와 Bad는 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 5B).
- Tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily에 속하는 Fas에 FasL가 결합하면 Fas-associated death domain protein(FADD) 및 procaspase-8에 의해 death-inducing signaling complex (DISC)를 형성하게 되며, caspase-8의 활성화에 의한 caspases cascade에 의하여 apoptosis가 유발된다(Jeong and Seol, 2008). 따라서 HFGP 처리에 의한 apoptosis 유도에 death receptor pathway에 속하는 단백질들이 관여하는지를 확인하기 위하여 연관성이 매우 높은 몇 가지 단백질들의 발현 변화를 western blot analysis로 확인하였으며, 그 결과 Fas, FADD, caspase-8의 활성화가 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 5A).
- 한편 세포에 DNA 손상이 일어나면 p53 암 억제 단백질에 의해 p21 단백질의 발현이 촉진되고 cdk를 억제하여 Rb 인산화를 억제함으로써 세포의 G1기 비율이 증가하게 된다. 따라서 cyclin과 cdk 단백질 발현 감소에 따른 G1기의 분포 증가와 연관성 있는 p53과 p21의 발현을 확인한 결과, HFGP 처리 시 단백질 수준이 농도의존적으로 증가함을 확인하였으며, Sub-G1기의 비율에 관여하는 Rb의 인산화 정도는 감소함을 나타내었다. 세포분열 억제 단백질 중 하나인 p27의 경우 cdk의 활성을 억제시켜 G1기 비율을 증가시키고 세포분열을 차단하는 역할을 하며 본 연구결과 역시 HFGP에 의한 농도 의존적 발현 증가를 보였다(Fig.
- 2B). 따라서 본 실험에 사용된 HFGP는 4.5%의 당을 함유하는15 kDa의 톳 당단백질임을 확인하였다.
- Caspase-9의 활성화는 미토콘드리아에서 유리된 cytochrome c에 의해서 형성된 apoptosome에 의하여 유발되며 활성화된 caspase-9은 caspase-3을 활성화하여 apoptosis를 일으키는 것으로 보고되었다(Nataga, 1997). 따라서 본 연구에서 caspase cascade 발현 및 활성에 미치는 HFGP의 영향을 western blot analysis로 확인한 결과, HFGP 처리에 의하여 intrinsic pathway에 관여하는 것으로 알려진 caspase-3의 활성화를 확인하였고, 그 상위기전인 caspase-9 역시 caspase-3의 발현 경향과 마찬가지로 활성형 단백질의 발현이 증가하며 caspase-3 활성화에 의하여 기질인 PARP (116 kDa)의 발현감소 및 단편화 현상이 HFGP 농도의존적으로 관찰되었다(Fig. 5B). 이는 anti-apoptosis 단백질인 Bcl-2에 의해 하위기전인 caspase-9와 caspase-3가 활성화되어 apoptosis의 유도가 이루어지는 것으로 보여진다.
- 이러한 결과로 볼 때 톳으로부터 분리한 HFGP는 HepG2 세포주기 중 Sub-G1 비율을 증가시키고 G1/S기로의 진행을 조절하는 인자인 cyclin D와 E의 발현을 억제시키고 p53, p27, p21 단백질을 활성화 시킴과 동시에 pRb 작용을 억제하여 세포주기를 조절함으로써 암세포 증식을 억제한 것으로 추정된다. 또한 HFGP에 의한 HepG2 세포의 apoptosis 유발은 intrinsic 및 extrinsic pathway를 통한 caspases 활성화와 직접 관련이 있음을 확인하였다.
- Smac은 미토콘드리아 내부에 격리되어 있으나 apoptosis가 시작되면 세포질로 유리되어 IAPs (inhibitors of apoptosis)에 결합하여 caspase를 활성화함으로써 apoptosis가 진행된다. 본 연구에서도 cytochrome c의 방출을 유도하는 Bax와 Bad의 단백질 발현이 증가하고 cytochrome c의 방출을 억제하는 Bcl-2의 발현이 감소함으로써(Fig. 5B) cytochrome c의 세포질 내 방출이 진행됨을 확인하였다(Fig. 5C). 또한 세포질내의 Apaf-1, Smac 단백질의 발현이 HFGP 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하는것으로 보아 이를 통해 apoptosis가 일어나는 것으로 보여진다(Fig.
- HFGP 처리에 의한 HepG2 세포의 증식억제가 apoptosis 유도에 의한 것인지를 확인하기 위해 flow cytometry를 이용하여 sub-G1에 속하는 세포의 빈도를 측정하여 apoptosis의 정량화를 실시하였다. 분석 결과, 세포의 사멸을 의미하는 sub-G1비율이 대조군에서 2.92%로 나타났으며, HFGP 6.25, 12.5. 25 µg/mL 처리 시 5.
- 이러한 결과로 볼 때 톳으로부터 분리한 HFGP는 HepG2 세포주기 중 Sub-G1 비율을 증가시키고 G1/S기로의 진행을 조절하는 인자인 cyclin D와 E의 발현을 억제시키고 p53, p27, p21 단백질을 활성화 시킴과 동시에 pRb 작용을 억제하여 세포주기를 조절함으로써 암세포 증식을 억제한 것으로 추정된다. 또한 HFGP에 의한 HepG2 세포의 apoptosis 유발은 intrinsic 및 extrinsic pathway를 통한 caspases 활성화와 직접 관련이 있음을 확인하였다.
- 이를 통해 Bcl-2 family의 작용기전에 의해 apoptosis가 유도됨을 확인하였다.
- 4). 이상의 결과로 HFGP에 의한 HepG2 세포의 성장 억제효과는 세포 내 p53 단백질을 활성화시켜 apoptosis를 유도하고, Sub-G1기의 증가 및 G1기의 정지를 통한 손상된 DNA 합성을 억제하여 비정상적 세포 증식을 차단하여 나타나는 결과로 사료된다.
- 4). 즉, HFGP에 의한 cyclin D, E, cdk 4의 발현 감소를 통해 세포주기 조절이 이루어지며 이로써 HepG2 세포의 성장을 억제시킨다는 결과를 보여주고 있다.
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