발아 기간에 따른 벼(Oryza sativa L.)의 항산화활성과 in vitro 항암활성 Antioxidant Activity and Anticancer Effects of Rough Rice (Oryza sativa L.) by Germination Periods원문보기
발아기간에 따른 발아 벼 추출물의 항산화성분, 항산화활성 및 암세포주 성장억제효과를 살펴보았다. 발아는 0, 2, 4, 6 및 8일 동안 진행하였으며, 발아 후 70% 에탄올로 추출물을 제조하였다. 발아가 진행됨에 따라 항산화성분 및 항산화활성은 2~4일까지는 증가하였다가 그 이후에는 감소하였다. 총 폴리페놀 함량은 발아 4일차에서 4.05 mg/g으로 가장 높았으며, DPPH 라디칼 소거능은 0, 2, 4, 6 및 8일차 각각 29.25, 34.82, 31.17, 26.27 및 18.51%로 발아 2일차에 가장 높았으며, 총 항산화력은 발아기간별로 각각 3.05, 3.17, 3.84, 2.43 및 2.167 mg AA eq/100 g으로 발아 4일차에서 가장 높게 나타났다. 환원력 또한 발아 4일차에 1.25로 가장 높게 나타났다. 암세포주 성장억제효과는 위암세포주(AGS) 보다 대장암세포주(HCT-116)에서 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 생리활성 증가를 위해서 벼를 발아시킬 경우3~4일이 적당한 것으로 판단되며, 추후 새로운 물질의 생성과 생리활성 성분들에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
발아기간에 따른 발아 벼 추출물의 항산화성분, 항산화활성 및 암세포주 성장억제효과를 살펴보았다. 발아는 0, 2, 4, 6 및 8일 동안 진행하였으며, 발아 후 70% 에탄올로 추출물을 제조하였다. 발아가 진행됨에 따라 항산화성분 및 항산화활성은 2~4일까지는 증가하였다가 그 이후에는 감소하였다. 총 폴리페놀 함량은 발아 4일차에서 4.05 mg/g으로 가장 높았으며, DPPH 라디칼 소거능은 0, 2, 4, 6 및 8일차 각각 29.25, 34.82, 31.17, 26.27 및 18.51%로 발아 2일차에 가장 높았으며, 총 항산화력은 발아기간별로 각각 3.05, 3.17, 3.84, 2.43 및 2.167 mg AA eq/100 g으로 발아 4일차에서 가장 높게 나타났다. 환원력 또한 발아 4일차에 1.25로 가장 높게 나타났다. 암세포주 성장억제효과는 위암세포주(AGS) 보다 대장암세포주(HCT-116)에서 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 생리활성 증가를 위해서 벼를 발아시킬 경우3~4일이 적당한 것으로 판단되며, 추후 새로운 물질의 생성과 생리활성 성분들에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
This study was conducted on the antioxidant activity and in vitro anticancer effects of rough rice (Oryza sativa L.) by germination periods. Rough rice was germinated at $37^{\circ}C$ for 8 days and then extracted with 70% ethanol. It was then analyzed for total polyphenol content, reduci...
This study was conducted on the antioxidant activity and in vitro anticancer effects of rough rice (Oryza sativa L.) by germination periods. Rough rice was germinated at $37^{\circ}C$ for 8 days and then extracted with 70% ethanol. It was then analyzed for total polyphenol content, reducing power, antioxidant activities, and in vitro anticancer effects. Total polyphenol content increased from 3.12 mg/g for raw rough rice to 4.05 mg/g at 4 days of germination. Also reducing power increased from 0.96 to 1.25 (p<0.05). DPPH radical scavenging activity increased from 29.25% at 0 day to 34.82% at 2 days. ABTS radical scavenging activity increased from 3.05 mg AA eq/100 g at 0 day to 3.84 mg AA eq/100 g at 4 days, and then decreased afterward. The anticancer effect of ethanol extract at 4 days on stomach cancer cell line (AGS) and colon cancer cell line (HCT-116) showed higher values compared with raw rough rice extract. These results suggest that the best germination periods for increasing biological activities may be 3~4 days.
This study was conducted on the antioxidant activity and in vitro anticancer effects of rough rice (Oryza sativa L.) by germination periods. Rough rice was germinated at $37^{\circ}C$ for 8 days and then extracted with 70% ethanol. It was then analyzed for total polyphenol content, reducing power, antioxidant activities, and in vitro anticancer effects. Total polyphenol content increased from 3.12 mg/g for raw rough rice to 4.05 mg/g at 4 days of germination. Also reducing power increased from 0.96 to 1.25 (p<0.05). DPPH radical scavenging activity increased from 29.25% at 0 day to 34.82% at 2 days. ABTS radical scavenging activity increased from 3.05 mg AA eq/100 g at 0 day to 3.84 mg AA eq/100 g at 4 days, and then decreased afterward. The anticancer effect of ethanol extract at 4 days on stomach cancer cell line (AGS) and colon cancer cell line (HCT-116) showed higher values compared with raw rough rice extract. These results suggest that the best germination periods for increasing biological activities may be 3~4 days.
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문제 정의
최근 곡류의 기능성을 향상시키기 위하여 발아처리공정을 많이 적용하고 있으며, 벼 전곡의 발아 전후 성분 변화 및 생리활성 등의 연구는 진행되어져 왔으나 적절한 발아기간 선정에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 벼 전곡의 발아 정도와 발아기간에 따른 항산화 성분과 활성의 변화 그리고 암세포주 성장 억제효과를 살펴봄으로써 생리활성이 가장 많이 증가하는 적절한 발아 기간을 선정하고자 하였다.
제안 방법
각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 U/mL penicillin G, 50μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640(Gibco Co., Grand Island, NY, USA)과 DMEM(Gibco Co.)을 사용하여 5% CO2, 37°C 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하였다.
, Beijing, China)로 발아시켰다. 발아 온도는 37℃, 습도는 85%로 유지하였으며, 발아기간은 0일, 2일, 4일, 6일 및 8일로 하였다. 발아 기간별 발아된 벼는 50℃의 건조기(WFO-459PD, Eyela, Tokyo, Japan)에서 2일 동안 건조시킨 후 80 mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
발아기간에 따른 발아 벼 추출물의 항산화성분, 항산화활성 및 암세포주 성장억제효과를 살펴보았다. 발아는 0, 2, 4, 6 및 8일 동안 진행하였으며, 발아 후 70% 에탄올로 추출물을 제조하였다.
발아기간에 따른 발아 벼 추출물의 항산화성분, 항산화활성 및 암세포주 성장억제효과를 살펴보았다. 발아는 0, 2, 4, 6 및 8일 동안 진행하였으며, 발아 후 70% 에탄올로 추출물을 제조하였다. 발아가 진행됨에 따라 항산화성분 및 항산화활성은 2～4일까지는 증가하였다가 그 이후에는 감소하였다.
배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT시약을 well 당 10 μL씩 분주한 다음 37°C, 5% CO2 배양기에서 4시간 후 MTT시약이 포함된 배지를 제거하고 DMSO 100 μL를 가한 후 상온에서 발색시키고, ELISA microplate reader(ELx808, Bio-tekⓇ Inc., Winooski, VT, USA)를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
즉, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 동결건조된 추출물을 100% dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma Aldrich)에 100 mg/mL 농도로 용해한 후 일정 농도(62, 125, 250, 500 μg/mL)로 희석하여 각 well 당 100 μL를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
즉, 각 추출물 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분 방치하여 50% FolinCiocalteu reagent 100 μL를 가하였다.
추출물 250 μL에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 250 μL, 1% potassium ferricyanide[K3Fe(CN)6] 250 μL를 각각 혼합하여 50°C에서 20분 동안 반응시킨 후 1% trichloroacetic acid(CCl3COOH, w/v)를 가하였다.
희석된 ABTS 용액 1mL에 추출액 50 μL를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 60분 후에 측정하였으며, 표준물질로서 L-ascorbic acid(AA, Sigma Aldrich)를 동량 첨가하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 시료는 농촌진흥청에서 2010년 재배 생산된 일반 벼인 일품벼(Ilpumbyeo, Oryza sativa L.)를 분양받아 사용하였다.
본 실험에서 사용한 암세포주는 대장암세포주(HCT-116, colorectal carcinoma: KCLB 10247) 및 위암세포주(AGS, stomach adenocarcinoma: KCLB 21739)이었으며, 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 U/mL penicillin G, 50μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640(Gibco Co.
실온에서 30분 방치 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 표준물질로 tannic acid(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 5, 10, 25 및 50배로 희석하여 사용하였으며, 검량선 작성 후 총 폴리페놀 함량은 시료 100 g 중의 mg tannic acid로 나타내었다.
데이터처리
1)Means with the different letters (a-d) on the bars are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
통계분석은 SPSS(Statistical package for the social sci- ence, Ver 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준편차를 산출하였으며, 분산분석을 실시한 후 Duncan의 다중검정을 실시하였다.
이론/모형
발아기간별 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량은 Velioglu 등(20)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다. 즉, 각 추출물 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분 방치하여 50% FolinCiocalteu reagent 100 μL를 가하였다.
발아기간에 따른 DPPH(Sigma Aldrich) 라디칼 소거능은 Tepe 등(21)의 방법에 따라 전자공여능(Electron donating ability, EDA)을 측정하였다. 즉, 0.
발아기간에 따른 벼 추출물의 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 Ishiyama 등(24)의 방법에 따라 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay로 측정하였다. 즉, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 동결건조된 추출물을 100% dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma Aldrich)에 100 mg/mL 농도로 용해한 후 일정 농도(62, 125, 250, 500 μg/mL)로 희석하여 각 well 당 100 μL를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
발아는 Kim 등(19)의 방법에 따라 일품 벼 500 g을 20℃의 물로 수세하고 3일간 침지시킨 다음 발아기(TP-CB 400, Ezione Inc., Beijing, China)로 발아시켰다. 발아 온도는 37℃, 습도는 85%로 유지하였으며, 발아기간은 0일, 2일, 4일, 6일 및 8일로 하였다.
총 항산화력은 ABTS cation decolorization assay 방법 (22)에 의하여 측정하였다. 7.
환원력은 Mau 등(23)의 방법에 의해 측정하였다. 추출물 250 μL에 0.
성능/효과
250 μg/mL의 농도에서 대장암 세포주인 HCT-116에 대한 암세포 성장억제 효과는 발아 전 0일차에서 54.42%의 생존율을 나타내었지만 4일차에서는 13.70%로 가장 낮은 생존율을 나타내어 발아 전 0일 차보다 약 40% 정도 암세포 성장억제율이 높게 나타났다 (Fig. 5A).
500 μg/mL의 농도에서 위암 세포주인 AGS의 성장억제 효과는 0, 2, 4, 6 및 8일차에서 각각 43.51, 25.85, 37.48, 43.96 및 44.46%의 생존율을 나타내었다(Fig. 5B).
각각의 발아기간별 시료에 대하여 4가지 농도(62, 125, 250 및 500 μg/mL)로 암세포주 성장 억제 효과를 살펴본 결과 농도 의존적으로 암세포 성장억제 효과를 나타내었다.
5A). 또한 6일 및 8일차에서는 각각 20.51 및 15.41%의 생존율을 나타내었으며, 위암 세포주보다는 대장암 세포주의 성장억제효과가 더 높은 것으로 나타났다. 한국산 발아벼 추출물의 암세포주 증식 억제 효과(30)에서도 품종 별로 약간의 차이는 있지만 발아 후 항암활성이 증가하는 것으로 보고하였으며, 메일을 발아시킬 경우에도(31) 농도 의존적으로 암세포 증식억제 효과가 뚜렷하게 증가하였다는 연구 결과로 미루어 볼 때 종자의 발아 시 다양한 생리활성성분들이 생성되거나 증가되어 암세포주 성장억제효과가 증가하는 것으로 판단되며, 추후 이러한 성분들에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
2에서 보는 바와 같이 발아기간이 증가함에 따라 발아 2일차에 최고값을 보인 후 감소하는 경향을 나타내었다. 발아 전 0일차 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 29.25%(1 mg/mL 농도)이었던 것이 발아 2일차에는 34.82%로 증가하였지만 발아 4일차에서는 31.17%로 감소하였으며, 발아 6일 및 8일차에서는 각각 26.27 및 18.51%로 감소하여 발아 2일차에 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 발아 4일차까지 증가하는 경향으로 나타내었지만 DPPH 라디칼 소거능은 발아 2일차에서 가장 높은 활성을 나타낸 것은 DPPH 라디칼 소거와 관련된 물질의 차이에 의한 영향으로 판단된다.
3). 발아 전 0일차 추출물의 총 항산화력은 3.05 mg AA eq/100 g이었으나 발아 2, 4, 6 및 8일차에서는 각각 3.17, 3.84, 2.43 및 2.16 mg AA eq/100 g으로 발아 4일차에서 가장 높은 값을 보인 후 감소하였다. 이러한 결과는 총 폴레페놀 함량의 변화(Fig.
4). 발아 전 0일차 추출물의 환원력은 0.96이었으나 발아 2일 및 4일차에서는 각각 1.20 및 1.25로 증가하였고 발아 6일 및 8일차에서는 각각 0.94 및 0.89로 감소하는 경향을 나타내어 발아 4일차에 가장 높은 환원력을 나타내었다. 특수미 발아 시 항산화 활성을 연구한 결과에 의하면 시판 특수 미를 3일간 발아시킨 후 환원력은 발아 전보다 월등히 높게 증가하였다 하였는데(29) 본 연구에서는 8일간 발아시킴에 따라 4일차에서 최대 환원력을 나타냄을 확인할 수 있었다.
발아기간에 따른 발아 벼 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 발아기간이 증가함에 따라 발아 2일차에 최고값을 보인 후 감소하는 경향을 나타내었다. 발아 전 0일차 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 29.
발아기간에 따른 발아 벼 추출물의 총 항산화력을 측정한 결과 총 폴리페놀 함량 변화와 유사하게 발아 4일차에 가장 높은 값을 보인 후 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 3). 발아 전 0일차 추출물의 총 항산화력은 3.
25로 가장 높게 나타났다. 암세포주 성장억제효과는 위암세포주(AGS) 보다 대장암세포주(HCT-116)에서 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 생리활성 증가를 위해서 벼를 발아시킬 경우 3～4일이 적당한 것으로 판단되며, 추후 새로운 물질의 생성과 생리활성 성분들에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
이러한 결과는 총 폴레페놀 함량의 변화(Fig. 1)와 유사한 경향이었으며, 전보(28)의 항산화 성분인 vitamin E 및 γ-oryzanol이 발아 4일차에 최댓값을 보인 후 감소하는 결과와 유사하게 나타났다.
51%로 감소하여 발아 2일차에 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 발아 4일차까지 증가하는 경향으로 나타내었지만 DPPH 라디칼 소거능은 발아 2일차에서 가장 높은 활성을 나타낸 것은 DPPH 라디칼 소거와 관련된 물질의 차이에 의한 영향으로 판단된다. 거대배아미의 발아 전후 에탄올 추출물의 라디칼 소거능을 살펴본 결과에서도 발아 전 25～40%의 DPPH 라디칼 소거능을 보이던 것이 발아 3일 후 58～64%로 증가하였다는 결과(27)와 유사한 경향을 나타내었다.
발아가 진행됨에 따라 항산화성분 및 항산화활성은 2～4일까지는 증가하였다가 그 이후에는 감소하였다. 총 폴리페놀 함량은 발아 4일차에서 4.05 mg/g으로 가장 높았으며, DPPH 라디칼 소거능은 0, 2, 4, 6 및 8일차 각각 29.25, 34.82, 31.17, 26.27 및 18.51%로 발아 2일차에 가장 높았으며, 총 항산화력은 발아기간별로 각각 3.05, 3.17, 3.84, 2.43 및 2.167 mg AA eq/100 g으로 발아 4일차에서 가장 높게 나타났다. 환원력 또한 발아 4일차에 1.
89로 감소하는 경향을 나타내어 발아 4일차에 가장 높은 환원력을 나타내었다. 특수미 발아 시 항산화 활성을 연구한 결과에 의하면 시판 특수 미를 3일간 발아시킨 후 환원력은 발아 전보다 월등히 높게 증가하였다 하였는데(29) 본 연구에서는 8일간 발아시킴에 따라 4일차에서 최대 환원력을 나타냄을 확인할 수 있었다.
5B). 특히 발아 2일차에 25.85%의 생존율을 보이며 가장 높은 성장억제 효과를 나타내었지만 그 이상의 발아기간에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 250 μg/mL의 농도에서 대장암 세포주인 HCT-116에 대한 암세포 성장억제 효과는 발아 전 0일차에서 54.
후속연구
암세포주 성장억제효과는 위암세포주(AGS) 보다 대장암세포주(HCT-116)에서 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 생리활성 증가를 위해서 벼를 발아시킬 경우 3～4일이 적당한 것으로 판단되며, 추후 새로운 물질의 생성과 생리활성 성분들에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
41%의 생존율을 나타내었으며, 위암 세포주보다는 대장암 세포주의 성장억제효과가 더 높은 것으로 나타났다. 한국산 발아벼 추출물의 암세포주 증식 억제 효과(30)에서도 품종 별로 약간의 차이는 있지만 발아 후 항암활성이 증가하는 것으로 보고하였으며, 메일을 발아시킬 경우에도(31) 농도 의존적으로 암세포 증식억제 효과가 뚜렷하게 증가하였다는 연구 결과로 미루어 볼 때 종자의 발아 시 다양한 생리활성성분들이 생성되거나 증가되어 암세포주 성장억제효과가 증가하는 것으로 판단되며, 추후 이러한 성분들에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
벼의 구성은 무엇인가?
)는 우리나라를 비롯한 아시아 및 아프리카 지역에서 주식으로 이용되는 곡물로 특히 아시아 지역에서는 하루 열량의 절반 이상을 섭취하고 있는 중요한 곡류이다(1). 벼는 현미 80%, 왕겨 20%로 구성되어 있으며, 현미는 과피, 종피 및 호분층으로 구성된 미강과 배아 및 배유로 이루어져 있다(2,3). 그중 미강은 외피의 주요성분인 식이섬유가 대부분이며 인체 소화효소로는 분해될 수 없는 비소화성 물질로 cellulose, hemicellulose, lignin, pectin 및 gum 등을 함유하고 있으며, 최근 연구에서는 혈중 콜레스테롤 저하효과, 항산화 효과 및 혈압상승 억제 효과가 우수하고 (4) 특히 항산화력 등 생리활성이 우수한 tocopherol, phytic acid, phenolic acid, oryzanol, GABA 및 ferulic acid 등이 함유되어 있다고 보고되었다(5).
벼(Oryza sativa L.)은 무엇인가?
벼(Oryza sativa L.)는 우리나라를 비롯한 아시아 및 아프리카 지역에서 주식으로 이용되는 곡물로 특히 아시아 지역에서는 하루 열량의 절반 이상을 섭취하고 있는 중요한 곡류이다(1). 벼는 현미 80%, 왕겨 20%로 구성되어 있으며, 현미는 과피, 종피 및 호분층으로 구성된 미강과 배아 및 배유로 이루어져 있다(2,3).
벼의 구성 중 효능이 뛰어난 부분은 어디이며, 그 효과는 무엇인가?
벼는 현미 80%, 왕겨 20%로 구성되어 있으며, 현미는 과피, 종피 및 호분층으로 구성된 미강과 배아 및 배유로 이루어져 있다(2,3). 그중 미강은 외피의 주요성분인 식이섬유가 대부분이며 인체 소화효소로는 분해될 수 없는 비소화성 물질로 cellulose, hemicellulose, lignin, pectin 및 gum 등을 함유하고 있으며, 최근 연구에서는 혈중 콜레스테롤 저하효과, 항산화 효과 및 혈압상승 억제 효과가 우수하고 (4) 특히 항산화력 등 생리활성이 우수한 tocopherol, phytic acid, phenolic acid, oryzanol, GABA 및 ferulic acid 등이 함유되어 있다고 보고되었다(5).
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