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문제 정의
- −본 연구에서는 두 가지의 양성 대조군, silymarin과 forskolin을 사용하여 烏梅 추출물에 대한 항 아토피 효과를 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 폐기를 수렴시켜 기침을 멎게 하고, 오랜 설사를 그치게 하며 회충으로 인한 구토와 복통을 없애주는데 사용되는 烏梅의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 선정하였다. 또한 烏梅의 70% EtOH 추출물에 대한 RAW264.
제안 방법
- − HaCaT 세포 1×106 cells/mL로 6-well plate에 분주한 후 TNF-α/IFN-γ (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 각각 10 μg/mL씩 처리한 후 24시간 후 상층액에서 hTARC를 EIA (TARC Duo set, R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 방법으로 검색하였다.
- − HaCaT 세포를 위의 방법과 동일하게 처리 후 상등액을 제거하고 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 RNA을 분리하였으며, 모든 실험은 RNase-free 상태에서 진행하였다.
- − Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포와 (ATCC, WA, USA)과 human keratinocyte cell line인 HaCaT 세포를 96-well plate에 각각 3×103 cells/well과 1×103 cells/well로 분주하고 약재 추출물을 1-1000 μg/mL 농도로 처리하였다.
- − NOS의 활성화에 의해 생성되는 NO의 양을 측정하여 항염증 활성을 검색 하였다.
- − 烏梅 내 주요성분인 5-HMF, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid의 동시 정량분석을 위해 Shimadzu 사의 LC-20A 시리즈를 사용하여 분석하였다.
- − 건조 및 분쇄된 烏梅 약 400 g을 70% 에탄올을 시료의 10배(w/v, 4 L)로 첨가하여 60분간 초음파 추출방법으로 3회 추출하였다.
- − 시료의 처리로 PGE2의 생성량이 감소하면 COX의 활성이 억제된 것으로 항염증 효능을 검증하였다.
- − 활성산소 중 하나이며, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 NO는 LPS 처리에 의해 배양액 중 유리된 NO 농도를 NO2-의 형태로 측정하였다.
- A)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Control well의 흡광도에 대한 약물첨가 well의 흡광도 비를 %로 계산하였고, 여러 well의 평균값을 사용하였다. 계산식은 다음과 같다.
- 각 primer는 Table I과 같다. PCR은 iCyler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 각각의 primer에 대해 94℃에서 30초, 55~60℃에서 30초, 72℃에서 2분이며 PCR에 의해 생성된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ChemiDocTM XRS+ imagsing system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 band를 확인하였다.
- RAW264.7 세포를 48-well plate에 분주한 후 16시간 안정화 시킨 다음 negative control에는 배지만 처리하고 유발군에는 LPS를 1 μg/mL이 되도록 처리하고 약물 처리군에는 각 약물을 여러 가지 농도로 처리 하였다.
- RAW264.7과 HaCaT 세포는 각각 5.5% FBS 및 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37°C, 5% CO2조건에서 배양하였다.
- 5 μg의 total RNA를 oligo(dT)20 primer, iScript reverse transcriptase로 42℃에서 70분, 85℃에서 5분 반응으로 진행하였다. TARC, MDC 및 RANTES 발현변화를 검색하기 위하여 PCR 반응을 진행하였으며 housekeeping gene으로 GAPDH를 사용하였다. 각 primer는 Table I과 같다.
- cDNA 합성은 iScipt select cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하였으며, 1.5 μg의 total RNA를 oligo(dT)20 primer, iScript reverse transcriptase로 42℃에서 70분, 85℃에서 5분 반응으로 진행하였다.
- PDA 검출 파장은 5-HMF는 280 nm, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid는 320 nm에서 각각 검출하였다. 검액에서의 피크 확인은 표준물질의 피크 머무름 시간과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였다. 5-HMF, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid 등 5종의 성분은 5.
- 본 연구에서는 폐기를 수렴시켜 기침을 멎게 하고, 오랜 설사를 그치게 하며 회충으로 인한 구토와 복통을 없애주는데 사용되는 烏梅의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 선정하였다. 또한 烏梅의 70% EtOH 추출물에 대한 RAW264.7과 HaCaT 세포에서의 염증효과와 아토피 관련 유전자인 TARC, MDC 및 RANTES의 mRNA 발현과 관련된 항알러지 효과를 확인하였다.
- 본 시험에 사용된 烏梅의 품질관리를 위해 주요성분인 5-HMF, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid 등 5종에 대하여 다성분 동시분석법을 확립하였다. 또한 烏梅 추출물의 NO와 PGE2을 억제하는 항염증 효과와 HaCaT 세포에서의 알러지 관련 유전자인 TARC, MDC 및 RANTES 발현을 감소시키는 항아토피 효과가 있음을 확인하였다.
- 양성 대조군으로는 indomethacine (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며 18시간 배양한 다음 arachidonic acid의 최종농도가 30 μM이 되도록 처리 후 상층액을 수집하고 PGE2 생성량을 측정하였다.
- 0 mL/min으로 흘려 주었으며 주입량은 10 μL였다. 이동상은 1.0% (v/v) 초산이 함유된 물 (A)과 1.0% (v/v) 초산이 함유된 아세토나이트릴 (B)을 사용하여 다음과 같이 기울기 용매조건 (10% B (0min), 10% B (5min), 50% B (30 min), 50% B (35min), 10% B (40 min))으로 흘려주었으며, 검출파장은 280 nm와 320 nm에서 검출하였다.
대상 데이터
- − RAW264.7 세포주(mouse macrophage cell line)는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았고, HaCaT 세포주(human keratinocyte cell line)는 세종대학교 이나경 교수님(Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다.
- − 본 실험에 사용된 烏梅(Mume Fructus, 중국)는 (주)HMAX (Jecheon, Korea)에서 규격품을 구입한 후 이제현 교수(Dongguk University, Gyeongju, Korea)로부터 감별 받은 후 사용하였으며, 한약재 표본(2008-ST18)은 한국 한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
- − 분석에 사용된 표준물질인 5-HMF, neochlorogenic acid 및 cryptochlorogenic acid는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, chlorogenic acid와 4-hydroxycinnamic acid는 Acros Organics (Pittsburgh, PA, USA)와 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 각각 구입하였다.
- −烏梅의 주요성분인 5-HMF, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid 등 5종의 성분을 분석 대상으로 각각 1.0% (v/v) 초산이 함유된 물 (A)과 아세토나이트릴 (B)의 이동상을 이용하여 기울기 용매 조건으로 분리능 2.0이상으로 20분 이내에 모두 분리하였다.
- 0% 이상이었다. HPLC 분석을 위한 물, 아세토 나이트릴 및 메탄올은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 초산은 특급시약으로 Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- 0이상으로 20분 이내에 모두 분리하였다. PDA 검출 파장은 5-HMF는 280 nm, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid는 320 nm에서 각각 검출하였다. 검액에서의 피크 확인은 표준물질의 피크 머무름 시간과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였다.
- 동시 분석을 위해 사용 된 칼럼은 Phenomenex사의 Gminin C18 (5 μm, 4.6×150 mm, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였으며, 칼럼온도는 40°C로 유지하였다.
- 약물 처리군에는 각 약물을 여러 가지 농도로 처리하고 모든 well에 최종 DMSO농도는 1%가 되도록 하였다. 양성 대조군으로 NOS inhibitor인 NG-methyl-L-arginine (LNMMA, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 18시간 배양 후 상층액을 분리하고 NO 생성량 측정하기 위해 Griess reagent (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 그 방법에 따라 진행하였으며 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 함량분석을 위한 HPLC는 Shimadzu사의 LC-20A 시리즈 (Kyoto, Japan)를 사용하였으며, 이 시스템은 pump (LC-20AT), on-line degasser (DGU-20A3), column oven (CTO-20A), autosampler (SIL-20AC) 및 PDA detector (SPD-M20A)로 구성되어 있다. 분석 결과는 Shimadzu사의 software인 LCsolution software (Version 1.
데이터처리
- −실험결과 자료의 통계처리는 SYSTAT 프로그램(SYSTAT Version 8.0 SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하고 각 군 간의 차이를 검증하기 위하여 Bonferroni multiple comparison test를 이용하여 사후분석을 실시하였다.
- ), column oven (CTO-20A), autosampler (SIL-20AC) 및 PDA detector (SPD-M20A)로 구성되어 있다. 분석 결과는 Shimadzu사의 software인 LCsolution software (Version 1.24)를 이용하여 처리하였다.
이론/모형
- Louis, MO, USA)를 사용하였다. 18시간 배양 후 상층액을 분리하고 NO 생성량 측정하기 위해 Griess reagent (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 그 방법에 따라 진행하였으며 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Louis, MO, USA)을 사용하였으며 18시간 배양한 다음 arachidonic acid의 최종농도가 30 μM이 되도록 처리 후 상층액을 수집하고 PGE2 생성량을 측정하였다. PGE2 생성량은 PGE2 Biotrak Enzymeimmunoassay (EIA) system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)의 방법을 따라서 시행하였으며 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- − HaCaT 세포에 TI를 처리하면 TARC, MDC 및 RNATES의 발현이 증가됨을 확인하고 양성대조군인 silymarin (50 μg/ mL)과 forskolin (30 μM)에서 각각의 유전자가 감소됨을 확인하였고 烏梅 추출물을 농도별로 처리 시 양성대조군인 silymarin의 억제 효과만큼 억제됨을 확인하였다(Fig. 6A).
- −烏梅 추출물의 세포 독성 농도를 검색한 결과, 처리 최고농도인 1000 μg/ml에서 RAW264.7 세포에 대해 대조군의 199.17±1.86%, HaCaT 세포에 대해 130.39±9.80%로 두 가지 세포에서 독성이 나타나지 않았다.
- −烏梅의 주요성분에 대한 함량분석을 위한 검량선은 상관계수(r2)를 구하여 직선성을 판단하였으며, 5종 성분에 대한 검량선 작성 결과 상관 계수(r2) 값이 0.9998 이상으로 1.0에 가까운 양호한 직선성을 나타내었다.
- 검액에서의 피크 확인은 표준물질의 피크 머무름 시간과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였다. 5-HMF, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid 등 5종의 성분은 5.61분, 7.41분, 11.61분, 13.03분 및 18.03분에 각각 검출되었다(Fig. 2).
- 는 염증 매개물의 대사과정에 간섭하여 염증반응을 유도하는 작용을 한다고 알려져 있다. COX-2 inhibitor로 알려진 indomethacin은 농도 의존적으로 PGE2 생성을 억제하며 20 ng/mL에서는 유발군에 비해 약 86% 감소되었다. 烏梅 추출물(100-1000 μg/mL) 처리 결과, 농도 의존적으로 PGE2 생성이 억제 되었고 특히 처리한 전체적인 농도에서 PGE2를 억제함을 확인하였다(Fig.
- 6A). HaCaT 세포에 TI로 chemokine을 유도하고 烏梅 추출물을 처리한 결과, 烏梅 추출물은 MDC, TARC 및 RANTES의 발현을 농도 의존적으로 억제시킴을 확인 하였다(Fig. 6B, 6C, and 6D). 烏梅 추출물은 배양액에서 TARC 분비를 억제시킴과 동시에 염증이 유도된 HaCaT 세포에서 항아토피 유전자들의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다.
- TI처리 후 hTARC 분비 억제 효과를 검색한 결과, 유발군인 TI군은 정상군(3.12±0.31 ng/mL)에 비해 약 7.9배 (24.79±2.01)의 hTARC을 분비함을 확인 하였다.
- 烏梅 추출물(100-1000 μg/mL) 처리 결과, 농도 의존적으로 PGE2 생성이 억제 되었고 특히 처리한 전체적인 농도에서 PGE2를 억제함을 확인하였다(Fig. 4).
- 烏梅 추출물은 200 μg/mL에서 약 54% (13.00±0.62 ng/mL)의 억제 효과를 나타내 양성 대조군인 forskolin에 비해 우수한 효과를 나타내었으며 최고농도인 1000 μg/mL에서는 6.97±0.81 ng/mL로 hTARC 생성을 약 82% 억제하였다(Fig. 5).
- 4). 烏梅 추출물은 NO생성 억제뿐만 아니라 PGE2 생성 억제 반응을 통해 항염증 활성을 나타냄을 확인하였다.
- 6B, 6C, and 6D). 烏梅 추출물은 배양액에서 TARC 분비를 억제시킴과 동시에 염증이 유도된 HaCaT 세포에서 항아토피 유전자들의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다.
- 烏梅 추출물을 20-1000 μg/mL로 처리 시, 농도 의존적으로 NO의 생성이 억제되는 것으로 나타났고(IC50= 427.08 μg/mL) 1000 μg/mL에서 약 78%의 NO 생성 억제 효과가 있음을 확인하였다 (Fig. 3).
- 본 시험에 사용된 烏梅의 품질관리를 위해 주요성분인 5-HMF, neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid 및 4-hydroxycinnamic acid 등 5종에 대하여 다성분 동시분석법을 확립하였다. 또한 烏梅 추출물의 NO와 PGE2을 억제하는 항염증 효과와 HaCaT 세포에서의 알러지 관련 유전자인 TARC, MDC 및 RANTES 발현을 감소시키는 항아토피 효과가 있음을 확인하였다. 이에 烏梅의 품질관리와 항염증 및 항아토피 효과에 대한 기전 연구에 필요한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 70 ng/mL로 각각 나타났다(Table II). 설정된 HPLC-PDA 동시 분석법으로 烏梅의 5종 성분에 대한 함량 분석을 실시한 결과 5-HMF가 1.01 mg/g, neochlorogenic acid가 0.32 mg/g, chlorogenic acid가 0.22 mg/g, cryptochlorogenic acid가 0.29 mg/g 및 4-hydroxycinnamic acid가 0.24 mg/g로 나타났다(Table III).
- 양성 대조군으로 사용된 NMMA의 IC50는 43.71 nM로 나타났으며, 특히 200 μM에서는 LPS 유발군보다 약 80% 억제되는 것으로 나타났다.
- 양성대조군으로 사용된 silymarin을 20 μg/mL으로 처리 시 9.46±0.98 ng/mL로 유발군에 비해 약 70%, forskolin을 30 μM로 처리 시 15.97±1.66 ng/mL로 약 41% 억제됨을 확인하였다.
- 검출 한계와 정량한계는 신호(signal; S) 대 잡음(noise; N) 비를 이용하여 각각 3과 10을 기준으로 정하였다. 이들 5종 성분에 대한 검출한계와 정량한계는 15.01-56.01 ng/mL와 50.22-186.70 ng/mL로 각각 나타났다(Table II). 설정된 HPLC-PDA 동시 분석법으로 烏梅의 5종 성분에 대한 함량 분석을 실시한 결과 5-HMF가 1.
후속연구
- 또한 烏梅 추출물의 NO와 PGE2을 억제하는 항염증 효과와 HaCaT 세포에서의 알러지 관련 유전자인 TARC, MDC 및 RANTES 발현을 감소시키는 항아토피 효과가 있음을 확인하였다. 이에 烏梅의 품질관리와 항염증 및 항아토피 효과에 대한 기전 연구에 필요한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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