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문제 정의
- 산수유의 다양한 생리적 효능이 입증되고 있으나 항산화 활성을 증진시키기 위한 유용성분 추출 조건의 확립이 필요한 실정이다. 이에 본 연구에서는 마이크로웨이브 에너지, 추출 용매, 추출시간 등의 조건을 달리하여 활성을 측정하여 마이크로웨이브 추출공정의 최적 추출조건을 예측하고자 하였다.
제안 방법
- 중심합성계획에서 독립(조건)변수로 마이크로웨이브 에너지(30～150 watt, X1), 에탄올 농도(0～100%, X2), 추출시간(1～9분, X3)을 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 16구간으로 설정하여 추출하였다(Table 1). 또한 추출물의 품질 특성에 관련된 종속(반응)변수(Yn)로서는 전자공여작용(Y1), tyrosinase 저해효과(Y2), SOD 유사활성(Y3), 폴리페놀 함량(Y4)으로 하였으며, 모든 실험은 3반복 측정하여 평균값을 회귀분석에 사용하였다. 회귀분석에 의한 최적조건의 예측은 statistical analysis system(SAS version 8.
- 산수유의 최적 추출조건을 설정하기 위해 전자공여작용, tyrosinase 저해효과, SOD 유사활성 및 총 폴리페놀 함량의 생리활성 측정 결과에 대한 4차원 반응표면을 superimposing하여 중복되는 범위로 최적 추출조건 범위를 예측하였다(Fig. 5). 그 결과, Table 5에서 보는바와 같이 마이크로웨이브 에너지 78～98 watt, 에탄올 농도 3～33%, 추출시간 3.
- 산수유의 추출조건별 추출물의 최적 추출조건을 설정하기 위해 중심합성법에 따라 마이크로웨이브에너지(30, 60, 90, 120 및 150 watt), 에탄올 농도(0, 25, 50, 75 및 100%), 추출시간별(1, 3, 5, 7 및 9분)로 추출조건에 따라 생리활성을 측정하였다. 이때 반응표면의 회귀식 R2값이 전자공여작용, tyrosinase 저해효과, SOD 유사활성, 총 폴리페놀 함량에서 각각 0.
- 5 mL를 가하여 혼합, 3분간 정치 후 2% Na2CO3용액을 10 mL를 첨가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 반응 후 분광광도계를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하고, 표준물질 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량(mg%)을 구하였다.
- 조건별 각 추출물의 최적 추출조건 예측은 전자공여작용, tyrosinase 저해효과, SOD 유사활성, 폴리페놀 함량에 대한 contour map superimposing 하였을 때 중복되는 부분의 범위에서 최적 추출조건 범위를 예측하였다.
- 본 실험에서는 추출조건에 대하여 중심합성계획(central composite design)(9)을 사용하여 실험 설계하였고, 추출조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)(10,11)을 사용하였다. 중심합성계획에서 독립(조건)변수로 마이크로웨이브 에너지(30～150 watt, X1), 에탄올 농도(0～100%, X2), 추출시간(1～9분, X3)을 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 16구간으로 설정하여 추출하였다(Table 1). 또한 추출물의 품질 특성에 관련된 종속(반응)변수(Yn)로서는 전자공여작용(Y1), tyrosinase 저해효과(Y2), SOD 유사활성(Y3), 폴리페놀 함량(Y4)으로 하였으며, 모든 실험은 3반복 측정하여 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
- 즉, 추출물 0.2 mL에 4×10-4 M DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 0.8 mL와 99.9% 에탄올 2 mL를 가하여 총액의 부피가 3 mL가 되도록 하였다.
- 마이크로웨이브 추출은 마이크로웨이브 추출장치(MAP, Soxwave-100, Prolabo, Paris, France)를 사용하였다. 추출조건으로 각 시료의 건물 중량에 대한 추출용매의 비율을 50 mL/g의 부피(W/V)로 하였으며, 마이크로웨이브 에너지 용량, 추출용매 및 추출시간은 중심합성계획에 의해 따른 조건으로 추출하였다. 추출물은 whatman filter paper No.
- 0)에 용해하여 사용하였다. 효소활성의 측정은 추출물 0.1 mL, 10 mM catechol 용액 2.8 mL에 tyrosinase 조효소액 0.2 mL를 가하고, 대조구에는 tyrosinase 조효소액 대신 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 가한 후 분광광도계(UV/VIS spectrometer, Jasco, Hachioji, Japan)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase에 대한 효소활성 저해 효과는 단위시간당 변화된 초기 흡광도의 변화 값을 측정하여 다음 식과 같이 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 구례에서 채취 후 건조된 산수유를 구입하여 동결건조(No. MCFD 8508, Ilshin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)하였다. 동결건조된 시료는 분쇄기(Kaiser, KFN-400S, Kingston Electromotor Co.
- 추출조건으로 각 시료의 건물 중량에 대한 추출용매의 비율을 50 mL/g의 부피(W/V)로 하였으며, 마이크로웨이브 에너지 용량, 추출용매 및 추출시간은 중심합성계획에 의해 따른 조건으로 추출하였다. 추출물은 whatman filter paper No. 2에 거르고 감압 농축 후 동일 용량으로 정용하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 또한 추출물의 품질 특성에 관련된 종속(반응)변수(Yn)로서는 전자공여작용(Y1), tyrosinase 저해효과(Y2), SOD 유사활성(Y3), 폴리페놀 함량(Y4)으로 하였으며, 모든 실험은 3반복 측정하여 평균값을 회귀분석에 사용하였다. 회귀분석에 의한 최적조건의 예측은 statistical analysis system(SAS version 8.0, 2004, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) program을 이용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 활성 저해의 측정은 Wong 등(13)의 방법에 따라 측정하였으며, tyrosinase 조효소액은 mushroom tyrosinase를 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 사용하였다. 효소활성의 측정은 추출물 0.
- 본 실험에서는 추출조건에 대하여 중심합성계획(central composite design)(9)을 사용하여 실험 설계하였고, 추출조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)(10,11)을 사용하였다. 중심합성계획에서 독립(조건)변수로 마이크로웨이브 에너지(30～150 watt, X1), 에탄올 농도(0～100%, X2), 추출시간(1～9분, X3)을 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 16구간으로 설정하여 추출하였다(Table 1).
- 총 폴리페놀의 함량(total polyphenol content)은 FolinsDenis(15) 방법에 의해 측정하였다. 시료 0.
- 추출물의 전자공여작용(electron donating ability, EDA)은 Blois(12)의 방법에 준하여 전자공여효과로 나타나는 각 추출물에 대한 환원력을 측정하였다. 즉, 추출물 0.
성능/효과
- 71분으로 Table 3과 같았다. Tyrosinase 저해효과의 경우 추출조건에서 마이크로웨이브 에너지에 대한 영향을 가장 크게 받는 것으로 나타났으나, 에탄올 농도와 추출시간에 대한 영향은 크게 받지 않는 것으로 나타났다(Table 4). 양파는 tyrosinase 저해효과가 에탄올 농도가 낮을수록, 마이크로웨이브 에너지가 높을수록 증가하는 경향을 보인다는 보고(19)와는 다소 상이한 결과를 보였다.
- 5). 그 결과, Table 5에서 보는바와 같이 마이크로웨이브 에너지 78～98 watt, 에탄올 농도 3～33%, 추출시간 3.6～9분에서 생리활성이 최적으로 추출되는 범위로 예측되었다.
- 86 mg%의 값을 보였다. 산수유의 페놀함량의 경우 마이크로웨이브 에너지에 의해 많은 영향을 받았고, 에탄올 농도에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났다(Table 4). 노루궁뎅이버섯(22)은 에탄올 농도가 낮을수록 페놀성 화합물 함량이 높은 것으로 보고된바 있어 본 연구와 다소 비슷한 경향을 보였다.
- 9254로 1% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다(Table 2). 예측된 정상점은 4차원 반응표면 분석에 의하면 안장점으로 최대값이 105.92%로 나타났다. Fig.
- 05 수준에서 유의성이 인정되었다. 예측된 정상점은 최대점으로, 산수유 추출조건이 마이크로웨이브 에너지 119.71 watt, 에탄올 농도 7.71%, 추출시간 4.21분일 때 81.27%로 가장 높은 값으로 측정되었다(Table 3). Table 4에서 보는바와 같이 산수유의 전자공여능은 마이크로웨이브 에너지 영향을 가장 많이 받고, 추출용매에 의해서도 영향을 다소 받는 것으로 나타났다.
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