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문제 정의
- 또한 정량 및 정성 분석방법으로 LC-MS, GC-MS, HPLC 및 GC가 널리 사용되고, 특히 thin-layer chromatography (TLC)는 쉽게 접근하여 빠르게 분석 및 정제를 할 수 있다 [19-21]. 따라서 본 연구에서는 한약재로 널리 이용되고 식품소재로 잘 알려진 강황으로부터 초음파 및 침적방법을 이용한 curcuminoids의 curcumin (MW =368), DMC (MW = 338) 및 BDMC (MW = 308)을 추출하여 추출량의 최적조건을 제시하였으며 효율적인 활성소재 확보를 위한 선택적추출 가능성을 검토하고 TLC, RP-HPLC 및 LC-MS를 이용하여 추출량을 실험적으로 구하여 비교하였다.
- 본 연구에서는 기능성 물질 탐색 및 소재개발의 생산성 활용에 적용하기 위해 강황에 포함된 curcumanoids의 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)의 추출량을 실험적으로 고찰하고 TLC, LC-MS및 RP-HPLC로 분석하여 추출량과 수치 계산에 의해 순수 물질분리를 하였다.
제안 방법
- 강황으로부터 생물활성 물질인 curcuminoids의 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)의 효율적인 활성소재 확보를 위한 선택적 추출은 C18 컬럼 사용과 유속은 1.0 mL/min, 주입부피는 10 μL, 컬럼오븐 온도 (40℃, UV 파장 425 nm을 고정시켜 전 처리한 추출액에 포함된 유용성분을 일정 용매 용출법으로 분석하고 추출조건을 실험적으로 모색하여 최적조건을 제시하였다.
- 또한 silica XHL TLC plates glass (5 × 10 cm, 250 μm, Sorbent Tec., USA)를 사용하여 확인하였다.
- 272)과 HPLC-DAD를 사용하였다. 또한 표준시료은 LC-MS (Varian: 500-MS IT Mass Spectrometer)를 사용하여 정량 및 정성분석을 하였다. 분석에 사용된 컬럼은 5 µm 물질이 충전된 분석용 역상 컬럼 Knauer Eurospher RP-column (250 × 3.
- 시료의 균일성을 위하여 수분 조절 용기 (desiccator)에 보관하여 사용하였고, 모든 시료들은 주입하기 전에 막 여과지 (PVDF 0.2 µm, Waters co)를 이용하여 여과를 하였다.
- 크로마토그래피의 분리정제에 있어서 정량 및 정성분석은 최적의 분리시간과 분리도 예측은 이동상의 조성과 유속 및 주입량에 따라 그리고 물질에 따라 다르게 정의되며 모든 조건을 실험적으로 확인하여 최적조건의 상관도를 정하기가 어렵다. 여기에서는 주입량에 따른 분리도를 실험상관식으로 예측하였다. 표준물질 200 ppm을 이용한 유속 1.
- 2%였다. 이후 강황분말 5 g을 500 mL 비이커에 추출용매 메탄올 100% 200 mL을 첨가하여 초음파 및 침적방법을 이용하여 추출 (시간 1~7 h) 하였다. 침적 방법은 상온 (23℃ ± 1)에서 수행, 초음파 방법은 bath type의(Branson ultrasonic Co.
- 전처리한 강황추출물을 분석용 컬럼을 사용하여 이동상 1.0 mL/min 주입부피 10 μL와 425 nm의 실험조건에서 분석하여 확인하였다.
- 초음파 및 침적방법의 각각의 추출물은 회전식 감압 농축 및 동결건조 (refrigerated vapor trap)를 48 h 동안 진행되었고 2차 반복 실험의 평균값을 적용하여 아래 보여지는 계산식을 사용하였다.
- 추출물에는 많은 양의 불순물들이 포함되어 있기 때문에 용매 추출 후 여지필터 (pore size: 5 μm)에서 감압 여과 하여 시료 잔유물과 분리시켜 감압 농축후 (10 mL) 동결 건조 (refrigerated vapor trap)를 하여 전체 추출 수율을 계산 하였다.
- 추출은 일정한 상온에서 수행 하였으며, 건조 분쇄된 시료는 입자를 체 거름 (30 μm)으로 분별하여 시료로 사용하였고 수분 함유량은 11.2%였다.
- 표준물질 200 ppm을 이용한 유속 1.0 mL/min에서 주입부피 2, 4, 6, 8, 10 및 15 μL를 증가시켜 실험값과 이론값을 비교하여 나타내었다 (Fig. 6).
대상 데이터
- Curcumin의 표준시료 (순도: 80%) 4 mg을 고순도 메탄올 20 mL취하여 200 ppm의 표준원액을 제조하였다.
- 0 mL/min, 주입부피는 10 μL, 컬럼오븐 온도 40℃로 고정하였다. UV detector는 DAD의 파장범위를 200~500 nm로 하였고, 크로마토그래피는 425 nm로 나타내었다. 이동상은 이성분계 A: Water/acetic acid (99.
- 본 연구에 사용된 강황 시료는 중국 지방에서 재배되었으며, 한국한의학연구원 한의신약연구그룹에서 처리된 시료를 사용하였다. 표준시료인 curcumin은 Sigma co.
- 2 µm, Waters co)를 이용하여 여과를 하였다. 용매는 HPLC급 (99.9%)으로 메탄올, 아세토나이트릴, 아세트산은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, U.S.A.) 그리고 물은 2차 증류수 (Division of Millipore, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다.
- UV detector는 DAD의 파장범위를 200~500 nm로 하였고, 크로마토그래피는 425 nm로 나타내었다. 이동상은 이성분계 A: Water/acetic acid (99.9/0.1, vol.%), B: Acetonitrile/acetic acid (99.9/0.1, vol.%)을 사용하여 (A: 60/B: 40 vol.%)까지 30 min동안 일정용매 용출법으로 실험하였다. Table 1에서는 HPLC의 분석조건을 보여주고 있다.
- 5에서는 UV detector (DAD)의 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)의 스펙트럼을 보여주고 있다. 파장의 범위는 200~500 nm로 하였고 크로마토그래피는 425 nm로 나타내었다. 이때 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)은 각각 425, 420 및 418로 확인되었고 선행연구에서 보고된 결과와 일치하였다 [1].
- 본 연구에 사용된 강황 시료는 중국 지방에서 재배되었으며, 한국한의학연구원 한의신약연구그룹에서 처리된 시료를 사용하였다. 표준시료인 curcumin은 Sigma co. (제조국: 중국, 순도: 80%)에서 구입하였다. 시료의 균일성을 위하여 수분 조절 용기 (desiccator)에 보관하여 사용하였고, 모든 시료들은 주입하기 전에 막 여과지 (PVDF 0.
성능/효과
- 따라서 X는 피크면적 (mAU × min)이며, Y는 함량 (mg, ug)으로 나타낼 수 있다. 그 결과 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)의 실험값은 각각 0.987, 0.997 및 0.998로 이론값과 매우 잘 일치 하였다.
- 또한 curcuminoids 3가지 전체함량 (mAU × min)은 침적방법에서 (1~7 h: 4442.834~5913.632로 33.1% 증가)와 초음파 방법에서 (1~7 h: 6396.107~8083.192로 26.4% 증가)로 1 h에서는 44%와 7 h에서는 37%의 추출 효율을 보였다.
- 또한 초음파 7 h에서 3가지 성분은 8083.192 (mAU × min)로 추출되었고 전체 추출 함량은 0.433 g으로 (침적 7 h 0.393 g) 보다 12% 높았다.
- 0 mL/min, 주입부피는 10 μL, 컬럼오븐 온도 (40℃, UV 파장 425 nm을 고정시켜 전 처리한 추출액에 포함된 유용성분을 일정 용매 용출법으로 분석하고 추출조건을 실험적으로 모색하여 최적조건을 제시하였다. 또한 초음파 및 침적방법을 추출시간 (1~7 h)의 변화에 따라 RP-HPLC-UV, TLC, LC-MS 를 연속적으로 확인하여 정성 및 정량을 할 수 있었다. 위 연구결과에 의하면 초음파 7 h에서 0.
- 66%으로 추출 효율이 가장 우수하였고 최적의 추출조건은 4 h이다. 수치분석 상관도는 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)은 200 ppm에서 각각 r2= 0.987, 0.997 및 0.999로 이론값과 매우 잘 일치 하였고 고순도 (95% >) curcuminoids의 화합물을 얻을 수 있었다. 이것은 강황의 추출가공 연구시 기초자료로 충분한 가치가 있다고 판단된다.
- 0 mL/min 주입부피 10 μL와 425 nm의 실험조건에서 분석하여 확인하였다. 여기에서 침적추출은 초음파추출에 비해 낮은 intensity의 크로마토그램을 보이고 있으며 시료 중의각 성분인 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)은 안정된 intensity에 의해 최적의 분리 효율을 볼 수 있었다. 또한 초음파 7 h에서 3가지 성분은 8083.
- 또한 초음파 및 침적방법을 추출시간 (1~7 h)의 변화에 따라 RP-HPLC-UV, TLC, LC-MS 를 연속적으로 확인하여 정성 및 정량을 할 수 있었다. 위 연구결과에 의하면 초음파 7 h에서 0.433 g 8.66%으로 추출 효율이 가장 우수하였고 최적의 추출조건은 4 h이다. 수치분석 상관도는 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)은 200 ppm에서 각각 r2= 0.
- 7에서는 최적 추출조건인 (초음파 4 h)의 추출물을 분석한 크로마토그램을 보여주고 있다. 이 결과 이동상 조성, 컬럼오븐 온도 및 주입량에 따른 분리능은 우수하였고 이동상에 따른 주입량의 실험상관식을 신뢰할 수 있었다. Fig.
- 5 L)로써 반응기 내 초기 온도조건은 (19℃ ± 1) 에서 (추출시간: 1 h：10, 2 h：8, 3 h：6, 4 h：3, 5 h：2, 6 h：1 및 7 h 0℃ ± 1)로 최대 (49℃ ± 1)까지 약 (30℃ ± 1)의 온도가 증가되었고 curcumin (1), DMC (2) 및 BDMC (3)의 체류시간은 각각 17, 15, 및 13 min이었다. 추출수율 (%)은 침적방법에서 (1~7 h: 6.48~7.89로 12.2% 증가)와 초음파방법에서 (1~7 h: 7.00~8.71로 12.5% 증가)로 두 추출방법의 비교 결과1 h에서는 10.8% 7 h에서는 11%의 차이가 있었다. 또한 curcuminoids 3가지 전체함량 (mAU × min)은 침적방법에서 (1~7 h: 4442.
후속연구
- 9). 따라서 본 연구에서 수행된 연구 결과는 사실을 실험적으로 입증하는 기초자료로 이용될 수 있다.
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