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문제 정의
- 그러나 Bae et al(2012)의 연구는 이러한 효소 반응의 최적 조건에 대한 실험은 수행하지 않았으며, 특히 전분 추출 공정 후 남은 잔여물(R1)에 상당량의 전분이 남아 있었으며, 게다가 습식 제분(wet milling) 시 빠른 분쇄 속도(speed 3)로 인하여 전분 손상도가 높은 문제점이 있는 것으로 조사되었다(data not shown). 따라서 본 연구는 추출한 전분의 손상도를 낮추기 위해 보리의 전처리 중 수침 조건과 roll milling 횟수를 달리하고, 습식 제분 시 분쇄 속도를 낮추었으며, 전분 추출 공정의 방법을 변형하여 잔여물(R1)에서 여분의 전분을 추출하고자 하였다. 또한 β-glucanase를 이용한 보리전분 추출 조건 최적화를 위하여 반응 시간, 효소량, 가수량을 독립 변수로 하여 반응 표면 분석법(response surface methodology)을 통한 효소 반응의 최적 조건을 검토하고, 최종적으로 효소 처리 유무에 따른 전분 간의 이화학적 특성을 비교하는데 실험 목적이 있다.
- 또한 β-glucanase를 이용한 보리전분 추출 조건 최적화를 위하여 반응 시간, 효소량, 가수량을 독립 변수로 하여 반응 표면 분석법(response surface methodology)을 통한 효소 반응의 최적 조건을 검토하고, 최종적으로 효소 처리 유무에 따른 전분 간의 이화학적 특성을 비교하는데 실험 목적이 있다.
가설 설정
- 2) Values with different superscripts within a row are significantly different at p<0.05.
제안 방법
- β-Glucanase를 이용하여 국내산 찰보리로부터 전분을 추출하고 전분 추출 수율을 최적화하는 효소 반응 조건을 반응 표면 분석법을 통해 조사하고자 하였다.
- 겔 형성과정에서의 시료의 유변학적 특성은 전분겔의 선형 점탄성 구간(linear viscoelastic region)인 1 Hz의 조건에서 측정하였으며, 결과는 각 품종별 보리전분의 따라 storage modulus(G’)로 표현하였다.
- 다음으로 3,000 × g의 조건에서 원심 분리하여 침전물 및 상등액(R2)를 얻었으며, 침전물은 Table 1의 반응 시간(X1), 효소 첨가량(X2), 가수량(X3, w/w)을 독립 변수로 하여 효소 반응을 시켰다.
- , UK)를 이용하여 in-situ(cone and plate type, diameter:40 mm)에서 분석하였다. 보리 전분 수용액(25 wt%)을 rheometer plate에 넣고, 시료의 증발을 억제하기 위하여 저점도 실리콘 오일을 얇은 막의 형태로 도포한 후 시료를 가열하여 겔 형성을 유도하였다. 시료 가열 프로토콜은 시료의 온도를 1℃/min 속도로 40℃에서 90℃까지 상승시키고, 90℃에서 10분간 유지하였으며, 이때 형성된 전분겔 강도의 변화를 측정하였다.
- 보리전분의 추출은 Bae et al(2012)의 방법을 변형하여 추출하였고, 이를 Fig. 1에 나타내었다. 먼저 분쇄 보리 35 g(dry basis)을 250 mL의 침지액에 넣고 45℃ 인큐베이터에서 16시간동안 침지시켰다.
- 흰찰 쌀보리의 전분 추출을 위한 전처리 공정은 이전 연구인 Bae et al(2012)의 방법을 변형하였다. 본 실험에서는 전분 손상도를 낮추기 위해 도정한 보리의 5배(w/w)의 20℃ 수돗물을 가하고, 침지 시간을 늘려 2시간 침지하였으며(이전 연구 10분), 이후 수침 시료를 체에 걸러 물기를 제거한 후 30℃, 80% 상대 습도 조건에서 30분간 건조시켜 roll 통과 횟수를 3회로 줄여(이전 연구 5회) roll milling하였다(roll 간격 : 1 mm). 이렇게 하여 얻은 분쇄 보리(crushed barley)는 저장 중 변질을 방지하기 위해 —20℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 이용하였다.
- 보리 전분 수용액(25 wt%)을 rheometer plate에 넣고, 시료의 증발을 억제하기 위하여 저점도 실리콘 오일을 얇은 막의 형태로 도포한 후 시료를 가열하여 겔 형성을 유도하였다. 시료 가열 프로토콜은 시료의 온도를 1℃/min 속도로 40℃에서 90℃까지 상승시키고, 90℃에서 10분간 유지하였으며, 이때 형성된 전분겔 강도의 변화를 측정하였다. 시료 냉각 프로토콜은 시료의 온도를 1.
- 시료 가열 프로토콜은 시료의 온도를 1℃/min 속도로 40℃에서 90℃까지 상승시키고, 90℃에서 10분간 유지하였으며, 이때 형성된 전분겔 강도의 변화를 측정하였다. 시료 냉각 프로토콜은 시료의 온도를 1.5℃/min 속도로 90℃에서 5℃까지 하강시키고, 5℃에서 20분간 유지하여 노화 과정의 전분겔 강도의 변화를 측정하였다. 겔 형성과정에서의 시료의 유변학적 특성은 전분겔의 선형 점탄성 구간(linear viscoelastic region)인 1 Hz의 조건에서 측정하였으며, 결과는 각 품종별 보리전분의 따라 storage modulus(G’)로 표현하였다.
- 전분의 입자 표면 형태는 Jeong et al(2013)의 방법을 응용하고 주사 전자 현미경(S-4800, Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 시료를 알루미늄 표본 지지대 위에 얹고, Cressington sputter coater(208 HR, Cressington Scientific Instruments Ltd., UK)를 이용하여 백금 도금한 후 주사 전자 현미경으로 1,500배, 3,000배, 10,000배 확대하여 관찰, 비교하였다.
- 전분 1 g(건물량 기준)과 증류수 40 mL를 혼합하여 1시간 동안 교반하고, 15,000 × g에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 제거한 다음, 침전된 전분의 무게를 측정하였으며, 다음 공식을 이용하여 물결합력을 계산하였다.
- 전분 추출 수율을 향상시키기 위한 효소 최적 추출 조건을 도출하기 위해 반응 표면 분석에 적합한 D-optimal design에 따라 실험을 설계하였다(Table 1). 독립 변수(Xn)로는 반응 시간(X1), 효소 첨가량(X2), 가수량(X3)을 설정했으며, 반응 변수(Yn)는 추출 수율(Y1)로 하였다.
- 전분겔의 유변학적 특성은 Jeong et al(2013)의 방법을 응용하고, controlled stress rheometer(CS-10, Bohlin instruments Ltd., UK)를 이용하여 in-situ(cone and plate type, diameter:40 mm)에서 분석하였다. 보리 전분 수용액(25 wt%)을 rheometer plate에 넣고, 시료의 증발을 억제하기 위하여 저점도 실리콘 오일을 얇은 막의 형태로 도포한 후 시료를 가열하여 겔 형성을 유도하였다.
- 전분의 DSC 측정은 Kim et al(1999)의 방법을 응용하고 thermal analyzer(DSC 1, Mettler-Toledo Inc., Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 3 mg(건물량 기준)의 전분을 70% 수분 함량이 되게 증류수를 가한 뒤 aluminium sample pan에 넣어 밀봉하고, 이를 시료로 하여 10℃/min의 속도로 25℃부터 120℃까지 가열해 흡열 peak를 얻었다.
- 전분의 입자 표면 형태는 Jeong et al(2013)의 방법을 응용하고 주사 전자 현미경(S-4800, Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 시료를 알루미늄 표본 지지대 위에 얹고, Cressington sputter coater(208 HR, Cressington Scientific Instruments Ltd.
- 흡열 peak로부터 호화 개시 온도(TO), 호화 정점 온도(TP), 호화 종결 온도(TC) 및 호화 엔탈피(ΔH(J/g))를 구하였다.
대상 데이터
- 국내산 쌀보리 중 흰찰 쌀보리는 소비자의 선호도가 높을 뿐만 아니라, 수요량 및 재배면적이 해마다 증가하고 있는 품종으로서 본 연구의 재료로 사용하게 되었다. 하지만 일반적인 메보리의 β-glucan 함량이 약 5%인 것에 비하여 흰찰쌀보리는 약 8%로(Lee et al 2011), β-glucan 함량이 높아 전분 추출이 용이하지 않다.
- 본 실험에 사용된 흰찰 쌀보리(2012년)는 국립식량과학원(농촌진흥청 벼맥류과)에서 재배된 것으로 Sadake test mill(M05, Satake, Japan)을 이용하여 보리 200 g을 중량 대비 23%도정해 시료로 사용하였다.
- 사용된 효소 Ultraflo L(Novozyme, Denmark)은 Humicola insolens에서 얻은 것으로, 열에 안정적인 β-glucanase이며, endo β-1,3(4)-D-glucan에 작용해 oligosaccharides 또는 glucose 단위로 분해한다.
데이터처리
- 모든 실험 결과들은 3회 이상 반복 측정하여 평균치와 표준 편차로 나타내었으며, 각 처리별 평균치 간의 유의성 검정은 SAS(statistical analysis system version 9.3)을 이용하여 ANOVA 분석 후 p<0.05에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성 검증을 하였다.
- 독립 변수(Xn)로는 반응 시간(X1), 효소 첨가량(X2), 가수량(X3)을 설정했으며, 반응 변수(Yn)는 추출 수율(Y1)로 하였다. 추출 수율(Yield, %)은 다음 공식을 이용해 계산하였으며, 모든 실험값들은 Modde version 5.0 software(Umertsics, Sweden)를 사용하여 분석하였다.
이론/모형
- 분쇄 보리 및 추출한 전분의 일반 성분은 AOAC 법(1990)을 이용하여 측정했으며, 수분은 상압가열 건조법, 조회분은 직접 회화법, 조지방은 Soxhlet 법, 조단백질은 Micro-Kjeldahl 법으로 측정하였다. 전분의 순도를 측정하기 위한 실험 방법으로 AOAC 방법의 amyloglucosidase/α-amylase method를 이용한 kit(K-TSTA, Megazyme International Ltd, Ireland)를 사용하여 분석하였다.
- 전분의 물결합력은 Medcalf & Gilles(1965)의 방법을 이용하여 측정하였다.
- 전분의 순도를 측정하기 위한 실험 방법으로 AOAC 방법의 amyloglucosidase/α-amylase method를 이용한 kit(K-TSTA, Megazyme International Ltd, Ireland)를 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- 겔 강도가 증가하기 시작하는 겔 형성 지점에서 최대의 겔 강도를 나타내는 온도 범위는 효소 비처리 전분과 효소 처리 전분이 각각 63.5∼66.0℃, 65.7∼67.7℃로 측정되었다.
- 2에 나타내었다. 눈에 띄는 변화로는 효소량이 증가할수록 전분 수율이 증가하는 결과를 보였으며, 전반적으로 반응 시간이 짧을수록, 효소량이 많을수록, 가수량이 많을수록 수율은 증가하는 경향을 나타내었다.
- 따라서 본 실험에 사용된 효소에 의해 β-glucan 및 arabinoxylan 등의 보리 섬유질이 효과적으로 분해되어 거의 모든 전분이 수용액 상으로 노출된 것으로 추정되며, 이러한 결과는 β-glucanase 외 다수의 효소를 사용하여 보리 섬유질을 제거하고, 보리 전분 추출 수율을 높인 Zheng & Bhatty(1998)의 결과와 잘 일치하고 있다.
- Zheng & Bhatty(1998)에 따르면, β-glucanase외 다수의 효소를 처리하여 보리전분을 추출한 경우, 전분의 이화학적 성질의 변화 없이 전분을 획득할 수 있다고 하였다. 따라서 본 실험의 효소 처리 유무에 따른 전분의 열적 특성은 서로 유사한 것으로 판단되며, 효소를 처리한 경우에도 전분의 열적 특성 변화를 일으키지 않는 것으로 사료되었다.
- 효소 처리 전분 입자의 경우, 큰 입자와 작은 입자 외에도 작은 입자들이 서로 붙어서 cluster 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었는데, McDonald & Stark(1988)에 의하면 갈색층인 R5에 함유되어 있는 전분의 약 99%가 B-granule로 이루어져 있으며, 이들은 단백질에 붙어 matrix 형태로 존재하고 있는 모양이라 하였다. 따라서 본 실험의 효소를 처리한 경우, 나타나는 cluster 형태의 전분 입자는 주로 R5에 기인된 것으로 추정되며, 효소 처리에 의하여 R5에 내재되어 있던 B-granule-protein matrix가 분리되어 전분 추출 수율이 증가한 것으로 사료되었다(Bae et al 2012).
- 또한 전분겔의 최대 강도는 효소 비처리 전분과 효소 처리 전분이 각각 1,099±161, 957±143 Pa를 나타내어 효소 처리 전분의 겔 강도가 다소 낮게 나타났다.
- 따라서 전분 추출 수율이 증가한 주된 요인은, 전분 추출 공정 중 발생하는 잔여물 중 상당량의 전분을 내포하고 있던 R1과 R5에 β-glucanase가 작용하여 β-glucan 및 섬유질 등이 효과적으로 분해․ 제거되어 전분의 분리가 잘 이루어졌기 때문인 것으로 사료되었다. 또한 주사 전자 현미경을 통한 효소 처리 및 효소 비처리 전분 입자의 형태를 분석한 결과, 효소를 처리한 경우, 작은 크기의 전분 입자인 B-granule이 효율적으로 분리되었음을 알 수 있었다. 효소 처리 유무에 따른 전분의 순도는 효소 처리 시 다소 낮았으며, 이화학적 특성을 비교한 결과, 두 전분 간에는 대체로 유사한 경향을 나타내어 효소 처리에 따른 전분의 이화학적 특성 변화는 없는 것으로 사료되었다.
- 이는 효소량이 증가함에 따라 보리 배유부의 세포벽을 구성하고 있는 β-glucan과 arabinoxylan 등이 효과적으로 분해되어 전분 입자의 노출을 용이하게 만들기 때문인 것으로 사료되며, 이러한 결과는 β-glucanase를 이용해 보리전분을 분리한 Seo HC(1999)의 결과와 일치하고 있다. 반응 시간에 따른 추출 수율의 변화는 반응 2시간 후 최대 수율 88.6%, 6시간 후 83.2%로 반응 시간이 증가할수록 수율은 감소하는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 수율 감소의 원인은 사용된 효소(Ultraflo-L) 내에 포함되어 있는 전분 분해 효소(α-amylase)의 작용으로 인해 효소 반응 시간이 증가할수록 전분이 분해되기 때문인 것으로 추정된다.
- 3% 증가한 것을 볼 수 있는데, Bae et al(2012)에 의하면 이는 효소에 의해 분해된 β-glucan 및 기타 mucilage 등이 원심 분리 시 침전되지 않고, 상등액 내에 존재하기 때문이라고 하였다. 원심 분리 후 침전물의 상층부에 존재하는 갈색층인 R5의 경우, 효소 처리 공정 시 효소 비처리 공정에 비하여 중량이 5.25%에서 0.54%로 약 4.7% 감소하였으며, 전분 함량 또한 1.41 g에서 0.15 g으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. R5는 불용성의 단백질, 섬유질, mucilage 등이 전분 입자 중 smallgranule과 matrix를 형성하여 침전되어 있는 형태로(McDonald & Stark 1988), β-glucanase 처리 시 전술한 matrix를 분해하여 효과적으로 전분을 분리할 수 있다고 한 Bae et al(2012)의 결과와 잘 일치하고 있었다.
- 전분겔 최대 강도 이후의 지속적인 가열에 따라 효소처리 유무에 따른 두 전분 모두 겔 강도는 감소하였으며, 90℃에서의 유지 및 5℃까지의 냉각 과정에 따라 두 전분 모두 겔 강도가 지속적으로 감소하다가 80∼85℃ 이후의 냉각 범위에서 겔 강도가 완만하게 증가하였다.
- 08%의 지방을 함유하고 있었으며, 약 64%의 탄수화물을 함유하고 있었다. 전분에 있어서 효소 비처리 전분, 효소 처리 전분 간의 수분, 지방, 회분, 단백질, 탄수화물의 유의적 차이는 없는 것으로 확인되었다.
- β-Glucanase를 이용하여 국내산 찰보리로부터 전분을 추출하고 전분 추출 수율을 최적화하는 효소 반응 조건을 반응 표면 분석법을 통해 조사하고자 하였다. 추출 수율은 독립 변수인 반응 시간이 짧을수록, 효소량이 많을수록, 가수량이 많을수록 높았으며, 효소량이 추출 수율에 가장 큰 영향을 주었다. 회귀 분석 결과, 최대 추출 수율을 나타내는 최적 조건은 반응 시간 2.
- 이와 같은 수율 감소의 원인은 사용된 효소(Ultraflo-L) 내에 포함되어 있는 전분 분해 효소(α-amylase)의 작용으로 인해 효소 반응 시간이 증가할수록 전분이 분해되기 때문인 것으로 추정된다. 한편, 가수량에 따른 수율의 변화는 2.87배에서 최저 수율 87.7%, 5배에서 최대 수율 88.9%로 나타나 가수량이 증가할수록 수율이 소폭 증가했지만, 전분 추출 수율에 미치는 영향은 효소량과 반응 시간에 비해 상대적으로 적은 것으로 추정되었다.
- 870로 나타났다. 회귀 분석 결과, 모델식의 최대 추출 수율을 나타내는 최적 조건은 반응 시간 2.63시간, 효소량 1.70%, 가수량 4.38배일 때 추출 수율 91.34%로 예측되었다.
- 추출 수율은 독립 변수인 반응 시간이 짧을수록, 효소량이 많을수록, 가수량이 많을수록 높았으며, 효소량이 추출 수율에 가장 큰 영향을 주었다. 회귀 분석 결과, 최대 추출 수율을 나타내는 최적 조건은 반응 시간 2.63시간, 효소량 1.7%, 가수량 4.38배로 예측되었다. 효소를 처리하여 전분을 추출하는 경우 추출 수율이 크게 증가하였으며, 이의 원인을 규명하기 위해 전분 추출 공정 중 발생하는 잔여물(R1-R5)들의 전분 balance를 측정한 결과, 효소를 처리했을 때 R1과 R5에 함유되어 있던 전분량이 크게 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
- 효소 처리 유무에 따라 추출한 전분의 순도는 효소 비처리 전분이 96.39%, 효소처리 전분이 93.51%로 측정되어, 효소 처리 시 전분의 순도가 약 2.88% 감소하였다. 이는 효소를 처리한 경우, 전분 추출 공정 중 발생하는 침전물의 상층부인 갈색층(R5)이 전분층과의 경계가 불분명하여, 이를 효율적으로 제거하지 못했기 때문인 것으로 사료되었다.
- 또한 주사 전자 현미경을 통한 효소 처리 및 효소 비처리 전분 입자의 형태를 분석한 결과, 효소를 처리한 경우, 작은 크기의 전분 입자인 B-granule이 효율적으로 분리되었음을 알 수 있었다. 효소 처리 유무에 따른 전분의 순도는 효소 처리 시 다소 낮았으며, 이화학적 특성을 비교한 결과, 두 전분 간에는 대체로 유사한 경향을 나타내어 효소 처리에 따른 전분의 이화학적 특성 변화는 없는 것으로 사료되었다.
- 38배로 예측되었다. 효소를 처리하여 전분을 추출하는 경우 추출 수율이 크게 증가하였으며, 이의 원인을 규명하기 위해 전분 추출 공정 중 발생하는 잔여물(R1-R5)들의 전분 balance를 측정한 결과, 효소를 처리했을 때 R1과 R5에 함유되어 있던 전분량이 크게 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 따라서 전분 추출 수율이 증가한 주된 요인은, 전분 추출 공정 중 발생하는 잔여물 중 상당량의 전분을 내포하고 있던 R1과 R5에 β-glucanase가 작용하여 β-glucan 및 섬유질 등이 효과적으로 분해․ 제거되어 전분의 분리가 잘 이루어졌기 때문인 것으로 사료되었다.
- 효소처리 유무에 따라 추출한 전분의 물결합력은 효소 비 처리 전분이 156.20%, 효소처리 전분이 143.62%로 측정되어, 효소처리 시 전분의 물결합력이 약 12.58% 낮은 것으로 나타내었다. 이러한 차이는 전술한 전분의 순도 차이가 물결합력에 영향을 미쳐 초래된 것으로 추정하였다.
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