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문제 정의
- 본 연구에서는 기능성 베리류인 아로니아 열매를 사용하여 식초를 제조하기 위해 알코올 발효액을 제조한 후 반응표면분석법(Response surface methodology, RSM)을 이용하여 최적 초산 발효조건을 확립하고자 하였다.
- 본 연구에서는 기능성 베리류인 아로니아 열매를 사용한 식초를 제조하기 위해 아로니아 열매로 알코올 발효액을 제조하였고, 초산 발효 조건의 최적화를 목적으로 반응표면 분석을 통해 시험구별로 제조된 초산 발효액의 특성을 조사한 후 최적 조건을 확립하고자 하였다. 식초 제조를 위해 아로니아 착즙액을 알코올 발효시킨 결과 8일 후 13.
가설 설정
- 1)Acetic acid bacteria numbered 9.1×106 CFU/mL in initial culture fluid.
제안 방법
- 아로니아 식초의 발효 최적조건을 알아보기 위해 ANOVA test 및 회귀분석을 이용하였으며 model의 적합성 여부는 F-test로 유의성을 검증하였고, 변수들 사이의 상관관계분석을 실시하였다. 각 성분들의 반응을 보기 위해서는 pertubation plot와 response surface 3D plot을 이용하였다.
- 아로니아 식초의 초산 발효 조건의 최적화를 위해 초기 알코올 함량과 초기 초산 농도, 초산균 접종량에 대한 접근은 canonical 모형의 수치 최적화(Numerical optimization) 와 모형적 최적화(Graphical optimization)를 통해 선정하였다. 독립변수인 초기 알코올 농도와 초기 초산 농도, 초산균 접종량의 범위 내에서 유의적인 결과를 나타낸 반응변수 중 초산 생성량을 최대로, 잔류 알코올 함량과 pH를 최저로 설정하여 모델화에 의해 결정된 반응식을 이용하여 수치점을 예측하였다. 그 중 가장 높은 만족도를 갖는 최적점을 선택하여 지점 예측을 통해 도출하였으며, 예측된 최적값은 Fig.
- 모형의 최적화는 각 반응에 대한 최소 혹은 최대 제한점을 결정하여 입력하였을 때 가능한 범위에서 그래프가 중첩되는 부분으로 구하였다.
- 아로니아 알코올 발효액과 초산 발효액의 발효 특성을 알아보기 위해 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도를 측정하였다. 발효조건에 따른 아로니아 식초의 초산 생성량은 0.1 N NaOH를 이용하여 초산 발효액을 중화 적정하여 acetic acid를 측정한 후 초기 초산 농도를 빼고 초산 생성량을 계산하였다(Park S 등 2012). 알코올 함량은 발효액을 23,193×g에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액을 알코올 분석기(Alcolyzer Wine, Anton Paar, Graz, Austria)를 이용하여 측정하였다.
- 아로니아 식초는 초산 발효에 의해 갈변이 진행되므로 식초의 품질 특성을 조사하기 위해 16개 실험구의 색도를 측정하였다. 초산 발효액의 색도를 측정한 결과 명도인 L값은 47.
- 아로니아 식초원료로 사용하기 위해 아로니아 열매를 착즙하여 알코올 발효를 실시하였다. 아로니아 열매를 파쇄한 후 액상과당을 사용하여 28 °bx가 되도록 보당하고 효소(PectinexⓇ ultra clear, Novozymes, Hellerup, Denmark) 를 첨가하고, 시판 효모(Fermivin)로 25°C에서 8일간 발효시킨 후 여과한 여액을 초산 발효 기질로 사용하였다.
- 아로니아 알코올 발효액과 초산 발효액의 발효 특성을 알아보기 위해 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도를 측정하였다. 발효조건에 따른 아로니아 식초의 초산 생성량은 0.
- 아로니아 알코올 발효액의 초산발효 최적 조건을 찾기 위해 중심합성 실험계획법에 의하여 발효조건이 다른 16개 실험구와 그것에 따른 아로니아 식초의 특성조사를 실시하였고, 결과는 Table 2와 같았다. 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도(L, a, b)는 반응표면 분석의 결과 R2가 0.
- 아로니아 열매를 파쇄한 후 액상과당을 사용하여 28 °bx가 되도록 보당하고 효소(PectinexⓇ ultra clear, Novozymes, Hellerup, Denmark) 를 첨가하고, 시판 효모(Fermivin)로 25°C에서 8일간 발효시킨 후 여과한 여액을 초산 발효 기질로 사용하였다.
- 아로니아 초산 발효를 위해 아로니아 알코올 발효액을 일정 농도로 희석하고 빙초산으로 초기 산도를 조정한 후 초산균을 접종하여 30°C에서 14일간 발효시키면서 특성 조사를 실시하였다.
- 아로니아 열매를 파쇄한 후 액상과당을 사용하여 28 °bx가 되도록 보당하고 효소(PectinexⓇ ultra clear, Novozymes, Hellerup, Denmark) 를 첨가하고, 시판 효모(Fermivin)로 25°C에서 8일간 발효시킨 후 여과한 여액을 초산 발효 기질로 사용하였다. 알코올 발효 종료는 알코올 함량과 환원당 함량을 측정하여 확인하였다.
- 알코올 함량은 발효액을 23,193×g에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액을 알코올 분석기(Alcolyzer Wine, Anton Paar, Graz, Austria)를 이용하여 측정하였다.
- 알코올 함량은 발효액을 23,193×g에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액을 알코올 분석기(Alcolyzer Wine, Anton Paar, Graz, Austria)를 이용하여 측정하였다. 초산 발효액의 pH는 pH meter (Seveneasy, Mettler-Toledo, Greifensee, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 색도는 분광색차계 (CM-5, Konica Minolta, Tokyo, Japan)를 사용하여 L, a, b 값을 측정하였다.
- 1%의 알코올이 생성되었다. 초산발효 조건 확립하기 위해 중심합성계획법에 따라 초기 알코올 함량, 초기 초산 농도, 초산균 접종량을 독립변수로 하여 실험을 계획하였고, 발효액의 특성을 반응변수로 하여 분석한후 발효 조건을 최적화하였다. 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도(L, a, b)는 반응표면 분석 결과 0.
- , Minneapolis, MN, USA) 프로그램을 사용하여, 반응표면 실험계획법(Response surface methodology)의 중심합성디자인에 따라 설계하였다. 초산발효에 영향을 미칠 수 있는 발효 조건(초기 알코올 함량, 초기 초산 농도, 초산균 접종량)을 Table 1과 같이 각각 독립변수로 하고 실험결과인 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도는 반응변수로 설정하였다. 아로니아 식초의 발효 최적조건을 알아보기 위해 ANOVA test 및 회귀분석을 이용하였으며 model의 적합성 여부는 F-test로 유의성을 검증하였고, 변수들 사이의 상관관계분석을 실시하였다.
대상 데이터
- 아로니아는 전라북도 고창군에서 재배된 열매를 농가로부터 구입하여 냉동보관하면서 사용하였다. 알코올 발효에 사용된 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 시판 효모인 Fermivin (Lallemand Inc.
- 아로니아는 전라북도 고창군에서 재배된 열매를 농가로부터 구입하여 냉동보관하면서 사용하였다. 알코올 발효에 사용된 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 시판 효모인 Fermivin (Lallemand Inc., Fredericia, Denmark)을 사용하였고, 초산 발효를 위한 초산균은 농촌진흥청에서 Gluconoacetobacter inermedius CV2를 분양받아 사용하였다. 초산균 배양을 위한 배지 제조시 사용된 yeast extract, peptone, agar는 BD Difco (Becton, Dickinson & Co.
- 초산균 배양을 위한 배지 제조시 사용된 yeast extract, peptone, agar는 BD Difco (Becton, Dickinson & Co., Paris, France)에서, 이를 제외한 모든 시약은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 초산발효에 영향을 미칠 수 있는 발효 조건(초기 알코올 함량, 초기 초산 농도, 초산균 접종량)을 Table 1과 같이 각각 독립변수로 하고 실험결과인 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도는 반응변수로 설정하였다. 아로니아 식초의 발효 최적조건을 알아보기 위해 ANOVA test 및 회귀분석을 이용하였으며 model의 적합성 여부는 F-test로 유의성을 검증하였고, 변수들 사이의 상관관계분석을 실시하였다. 각 성분들의 반응을 보기 위해서는 pertubation plot와 response surface 3D plot을 이용하였다.
이론/모형
- 아로니아 식초의 초산 발효 조건의 최적화를 위해 초기 알코올 함량과 초기 초산 농도, 초산균 접종량에 대한 접근은 canonical 모형의 수치 최적화(Numerical optimization) 와 모형적 최적화(Graphical optimization)를 통해 선정하였다. 독립변수인 초기 알코올 농도와 초기 초산 농도, 초산균 접종량의 범위 내에서 유의적인 결과를 나타낸 반응변수 중 초산 생성량을 최대로, 잔류 알코올 함량과 pH를 최저로 설정하여 모델화에 의해 결정된 반응식을 이용하여 수치점을 예측하였다.
- 아로니아 식초의 초산발효 실험 계획, 분석, 최적화 분석은 Design Expert 9 (Stat-Easy Co., Minneapolis, MN, USA) 프로그램을 사용하여, 반응표면 실험계획법(Response surface methodology)의 중심합성디자인에 따라 설계하였다. 초산발효에 영향을 미칠 수 있는 발효 조건(초기 알코올 함량, 초기 초산 농도, 초산균 접종량)을 Table 1과 같이 각각 독립변수로 하고 실험결과인 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도는 반응변수로 설정하였다.
성능/효과
- 0001 이하로 모두 유의성이 인정되었다. 14일간의 초산 발효 후 16개 실험구의 초산생성량은 26.34~57.82 g/L였고, 잔류 알코올 함량은 0.80~1.53%였으며 pH는 3.19~3.43이었다. 색도는 초산발효 진행에 따라 명도는 낮아지고 적색도와 황색도는 증가하였다.
- 0001으로 유의적인 차이를 나타냈다(Table 3). Fig. 2의 pertubation plot과 반응표면곡선을 보면 발효초기 알코올 함량과 초기 초산농도가 높을수록 잔류 알코올 함량이 감소하였으며, 잔류 알코올 함량을 최소로 하는 최적 조건은 초기 아로니아 알코올 농도 7.78%, 초기 초산농도 1.58%, 초산균 접종량 20.94%였으며 이때 잔류 알코올 함량은 0.76%로 예측되었다. 이론상 초산 발효는 1분자의 알코올로부터 1분자의 초산이 생성되고 1.
- 독립변수인 초기 알코올 농도와 초기 초산 농도, 초산균 접종량의 범위 내에서 유의적인 결과를 나타낸 반응변수 중 초산 생성량을 최대로, 잔류 알코올 함량과 pH를 최저로 설정하여 모델화에 의해 결정된 반응식을 이용하여 수치점을 예측하였다. 그 중 가장 높은 만족도를 갖는 최적점을 선택하여 지점 예측을 통해 도출하였으며, 예측된 최적값은 Fig. 3과 Fig. 4와 같이 초기 알코올 함량 7.78%, 초기 초산 농도 1.58%, 초산균 접종량 19.39%였다. Kang BH 등(2011)은 사과식초 발효조건의 최적화 조건으로 초기 알코올 농도 5%, 초기 산도 1%라고 보고하였고, Hong SM 등(2012)은 복분자 식초 발효의 최적 조건을 알코올 함량6%, 초기 산도 2%, 발효기간 9일이었다고 보고하여 본 연구와는 다른 결과들을 알 수 있었다.
- 초기 초산농도는 초산 생성량과 양의 상관관계를 가지며 잔류 알코올 함량, pH와 음의 상관관계를 가지고 있었다. 따라서 아로니아의 초산발효에서 중요한 초산생성량과 발효액의 pH에는 초기 알코올 농도와 초산 농도가 중요한 역할을 하는 것으로 생각되었다.
- 색도는 초산발효 진행에 따라 명도는 낮아지고 적색도와 황색도는 증가하였다. 분석 결과 아로니아 식초의 초산발효 최적조건은 초기 알코올 함량 7.78%, 초기 초산 농도 1.58%, 초산균 접종량 19.39%였으며, 초기 알코올 함량은 초산생성량, pH, 적색도, 황색도와 양의 상관관계를 보였고 잔류 알코올 함량과 명도와는 음의 상관관계를 나타내었다.
- 43이었다. 색도는 초산발효 진행에 따라 명도는 낮아지고 적색도와 황색도는 증가하였다. 분석 결과 아로니아 식초의 초산발효 최적조건은 초기 알코올 함량 7.
- 아로니아 식초의 pH는 초산 생성에 따라 감소하는 경향은 있으나 비례적으로 감소하지는 않았으며 초산 생성량이 더 높은 시료에서 pH가 더 높게 나타난 경우도 있었다. Baek CH 등(2013)도 현미 식초의 발효가 진행되는 동안 pH가 전반적으로 감소하는 경향이었으며, 20°C 발효구간은 발효종료 후 적정산도가 감소함에도 pH가 상승하지 않고 유지되었으나, 30°C 발효구간에서는 적정산도가 감소하면 pH가 증가하였다고 보고하였다.
- 아로니아 식초의 초산 발효 조건인 초기 알코올 함량, 초기 초산 농도, 초산균 접종량과 반응변수인 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도 값 사이의 상관관계를 분석한 결과(Table 4) 발효초기 알코올 함량은 초산 생성량, pH, 적색도인 a값, 황색도인 b값과 양의 상관관계를 가지고 있고 잔류 알코올 함량, 명도 L값과 음의 상관관계에 있었다. 초기 초산농도는 초산 생성량과 양의 상관관계를 가지며 잔류 알코올 함량, pH와 음의 상관관계를 가지고 있었다.
- 아로니아 와인의 초산 발효를 위한 초산균의 고체배지 조성은 glucose 0.5%, yeast extract 0.5%, Glycerin 1.0%, MgSO4·H2O 0.02%, ethanol 5%, acetic acid 1%, agar 2.0%였으며, 초산균 액체 배지 조성은 glucose 0.5%, yeast extract 0.5%, glycerin 1.0%, MgSO4·7H2O 0.02%이었으며 배양온도는 30°C이었다.
- 1과 같았다. 알코올 발효가 진행됨에 따라 환원당은 감소 하면서 알코올이 생성되는 것을 확인하였다. 환원당은 3일 이후로 급격히 감소하여 7일 이후 4~5%에 도달하였고, 알코올 함량은 3일 이후 급격히 증가하여 최종적으로 13.
- 알코올은 초산균의 영양원이자 발효기질로 초산발효에 영향을 주는 중요한 조건 중 하나이며 본 연구에서는 아로니아 알코올 발효액의 알코올 농도를 3~9%로 조절하여 초산발효를 진행한 결과 7.70%일 때 최적조건으로 예측되었다. Kang BH 등(2011)은 사과 식초를 제조한 결과 초기 알코올 농도가 적정농도 이하와 이상의 농도 에서는 정상적인 발효가 유도되지 않았으며 특히 고농도의 기질이 존재할 때에는 알코올에 대한 내성의 약화로 인해 초산균의 증식 및 발효가 유도되지 않았다고 하였다.
- 아로니아 초산 발효를 위해 아로니아 알코올 발효액을 일정 농도로 희석하고 빙초산으로 초기 산도를 조정한 후 초산균을 접종하여 30°C에서 14일간 발효시키면서 특성 조사를 실시하였다. 예비실험을 통해 최소 및 최대 범위를 각각 아로니아 알코올 발효액의 초기 알코올 함량은 3~9%, 초기 초산 농도는 0.3~1.9%, 초산균 배양액의 접종량은 5~20%로 정하였다. 초산발효에 사용한 초산균 배양액의 초기 초산균의 총균수는 9.
- 76%로 예측되었다. 이론상 초산 발효는 1분자의 알코올로부터 1분자의 초산이 생성되고 1.0 L의 알코올은 약 1.0 kg 의 초산이 생성되어야 하나 본 연구 결과 초산 생성량에 비해 발효 후 잔류된 알코올 함량이 적었다. Kim YT 등 (1997)은 알코올 잔류량이 많은 것은 초산 발효가 원만하게 진행되지 않은 것이며 순수 초산 수득율에 비해 잔류 알코올량이 적은 것은 온도와 통기 교반에 의한 알코올 손실량이 컸기 때문이라고 하였다.
- 이상의 연구 결과로 보아 식초의 초산 발효에는 초기 알코올 함량과 초산 농도가 식초 발효에 중요한 영향을 미치므로 발효 초기 알코올과 초산이 적정 농도 이상으로 함유되어 있어야 초산균이 활성화 되는 데 도움을 주어 원활한 초산 발효가 일어날 수 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과를 토대로 아로니아 식초 제조의 최적조건을 확립하여 표준화된 방법으로 식초 제조를 할 수 있을 것 이라고 생각된다.
- Kang BH 등(2011)은 사과식초 발효조건의 최적화 조건으로 초기 알코올 농도 5%, 초기 산도 1%라고 보고하였고, Hong SM 등(2012)은 복분자 식초 발효의 최적 조건을 알코올 함량6%, 초기 산도 2%, 발효기간 9일이었다고 보고하여 본 연구와는 다른 결과들을 알 수 있었다. 이와 같이 식초를 제조하고자 하는 원료와 초산균의 종류의 차이가 발효 조건에 영향을 주었음을 알 수 있었다.
- 아로니아 식초는 초산 발효에 의해 갈변이 진행되므로 식초의 품질 특성을 조사하기 위해 16개 실험구의 색도를 측정하였다. 초산 발효액의 색도를 측정한 결과 명도인 L값은 47.58~71.00, 적색도를 나타내는 a값은 31.77~51.15, 황색도를 나타내는 b값은 18.45~48.57이었다(Table 2). 초산발효의 진행에 따라 초산이 많이 생성된 시료일수록 L 값은 낮고 a값과 b값은 높은 경향이었으며 Fig.
- 아로니아 알코올 발효액의 초산발효 최적 조건을 찾기 위해 중심합성 실험계획법에 의하여 발효조건이 다른 16개 실험구와 그것에 따른 아로니아 식초의 특성조사를 실시하였고, 결과는 Table 2와 같았다. 초산 생성량, 잔류 알코올 함량, pH, 색도(L, a, b)는 반응표면 분석의 결과 R2가 0.92~0.99로 높은 편이었으며 p value 결과가 1% 미만으로 모두 유의성이 인정되었다(Table 3).
- 2에서와 같이 pertubation plot과 반응표면곡선을 보면 아로니아 알코올농도와 초기 초산 함량이 높을수록 최종 초산 농도가 증가하였다. 초산 생성량의 최적점은 아로니아 알코올 농도 7.70%, 초산 농도 1.56%, 초산균 접종량 19.87%일 때였으며, 초산 생성량은 57.87 mg/L로 예측되었다.
- 57이었다(Table 2). 초산발효의 진행에 따라 초산이 많이 생성된 시료일수록 L 값은 낮고 a값과 b값은 높은 경향이었으며 Fig. 2의 pertubation plot과 반응표면곡선에서도 초기 아로니아 알코올 함량이 높을수록 L값은 감소하고 a값과 b값은 증가 하는 경향이었다. Yae MJ 등(2007)은 석류 식초를 발효시킨 결과 발효 진행에 따라 L값과 a값은 감소하고 b값은 증가하는 경향을 보고하여 아로니아 식초와는 다른 경향을 나타냈다.
- 알코올 발효가 진행됨에 따라 환원당은 감소 하면서 알코올이 생성되는 것을 확인하였다. 환원당은 3일 이후로 급격히 감소하여 7일 이후 4~5%에 도달하였고, 알코올 함량은 3일 이후 급격히 증가하여 최종적으로 13.1%의 아로니아 알코올 발효액이 생성되었다. Park S 등(2012)과 Choi HS 등(2005)은 복분자 열매를 사용하여 알코올 발효에 의해 11.
후속연구
- 이상의 연구 결과로 보아 식초의 초산 발효에는 초기 알코올 함량과 초산 농도가 식초 발효에 중요한 영향을 미치므로 발효 초기 알코올과 초산이 적정 농도 이상으로 함유되어 있어야 초산균이 활성화 되는 데 도움을 주어 원활한 초산 발효가 일어날 수 있다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과를 토대로 아로니아 식초 제조의 최적조건을 확립하여 표준화된 방법으로 식초 제조를 할 수 있을 것 이라고 생각된다.
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