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문제 정의
- 이에 악성흑생종 세포주인 B16F10 세포의 생존율에 미치는 영향, 멜라닌 색소 생성 저해, Tyrosinase 활성 저해능, 제 1형 및 4형 Elastase 억제에 미치는 영향을 연구함으로써 구기자가 피부 미백 및 주름에 미치는 영향을 알아보았다.
제안 방법
- Melanin 생성량 측정은 Hosei 등12)의 방법을 변형하여 사용하였다. 간략히 정리하면, B16F10세포를 배양하여 24 well plate에 각 well당 세포를 5×104 cell/well로 분주한 후, 부착 및 안정화를 위하여 24시간을 배양하였다.
- 枸杞子 추출물(LFE)의 피부 미백 및 탄력 유지 효과를 관찰하기 위하여 악성흑색종 세포인 B16F10에 처리하고 증식율 및 Melanin 생성량, Tyrosinase 저해 효과와 Elastase 저해 등을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 악성흑색종 세포인 B16F10세포에 LFE를 처리하여 생존율을 관찰하고, 멜라닌 생성량과 Tyrosinase 저해 활성, Elastase에 미치는 영향을 관찰하여, 피부 미백 효과 및 탄력 유지 작용이 있는지를 알아보았다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 LFE 100 g을 증류수 1,500 ㎖과 함께 전기약탕기(대웅, 한국)로 100℃에서 3 시간 동안 전탕하여 물 추출을 시행하였다. 전탕한 추출물을 부직포로 거른 다음 동결건조기(삼원, 한국)를 이용하여 동결건조 분말을 얻었다.
- 특히 구기자 및 구기엽 추출물이 피부과색소 조절효과에 대한 보고가 있으며8), 지질 조성 변화 및 collagen 합성 저하를 회복시킨다는 보고가 있었고9), 數種의 한약재의 콜라겐 생합성 효과에 대한 연구에서 구기자의 효과가 가장 우수하다고 보고하였다10). 이러한 연구들을 바탕으로 구기자의 효과를 알아보고자 하였으며, 또한 기존 논문들의 에탄올 추출법이 아닌 물 추출법을 통해 연구를 진행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 枸杞子(Lycii Fructus Extracts, LFE)으로는 가지과에 속한 蔓生灌木인 구기자나무 (Lycium chinense MILL.) 또는 寧夏枸杞(L. barbarum L.)의 성숙한 과실을 건조한 것3)으로, 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 후, 정선하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 4,5-dimethy lthiazol-2yl-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), Tris, N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, Elastase 1, Elastase 4, Tyrosinase, L-DOPA 등의 시약은 Sigma 제품 (Sigma Chemical Co., USA)을 사용하였으며. 측정 기기로는 Microplate Reader (Bio-rad, USA) 등을 사용하였다.
- 악성흑색종 세포주인 B16F10의 생육 배지로는 RPMI 1640 (Sigma, R4130) 배지를 사용하였고, 배지에는 10% fetal bovine serum (Gibco LOT. NO.
- 인간 유래 악성흑색종 (melanoma) 세포주인 B16F10 세포주는 한국세포주은행 (KCLB, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SigmaPlot 11.0 for windows program을 사용하여실시하였으며, Student-t-test를 이용하여 P값이 0.05미만 일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- LFE가 세포 증식율에 미치는 영향 측정은 MTT assay11)를 통해 확인하였다. 간략히 정리하면, 96 well plate에 5×104 cell/㎖의 농도로 분주하여 배양기에서 37℃, 5% CO2를 유지하며 24 시간 동안 pre-incubation시킨 후 62.
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법13)에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- 엘라스틴 분해효소(Elastase) 저해 활성은 James 등의 방법15)으로 측정하였다. 간단히 소개 하자면, 먼저 0.
성능/효과
- 1. LFE가 세포 증식율에 미치는 영향은 250 ㎍/㎖ 이상의 고농도를 처리하였을 때 B16F10 세포의 증식율이 유의성 있게 억제되었다.
- 2. LFE가 Melanin 생성에 미치는 영향은 125 ㎍/㎖이상의 고농도로 처리하였을 때 Melanin의 생성이유의성 있게 억제되었다.
- 3. LFE의 Tyrosinase 활성에 미치는 저해율은 시험관 내에서 유의성있게 나타났지만 IC50은 구할 수가 없었고, B16F10의 세포 내에서도 유의성 있게 나타났으며, IC50은 456.52 ㎍/㎖으로 계산되었다.
- 4. LFE가 Elastase 활성에 미치는 저해율은 시험관 내에서 Elastase type Ⅰ 및 Ⅳ에서 250 ㎍/㎖이상의 농도에서 유의성 있게 나타났으며, IC50은 각각 399.79 ㎍/㎖과 771.99 ㎍/㎖로 계산되었다.
- 5. LFE가 Elastase 활성에 미치는 저해율은 B16F10의 세포 내에서 유의성 있게 나타났으며, IC50은 983.05 ㎍/㎖로 계산되었다.
- 이상의 결과, LFE는 Melanin 색소의 생성을 억제하였고, 세포 내에서 효과적으로 Tyrosinase의 활성을 억제하였다. Elastase에 대해서는 제 Ⅰ형과 Ⅳ형 모두 직접적으로 활성을 유의하게 억제하였고, 세포 내에서도 유의하게 억제하여 임상상 LFE가 피부 미백이나 피부 탄력유지에 효과가 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- LFE에서 분리되는 대표적인 성분으로는 betaine, rutin, kukoanine A, β-sitosterol 등이 있으며 이외에도 무기질, 비타민 등이 골고루 분포해있다. LFE 성분 중의 phytoestrogen이 estrogen 유사효과를 나타내어 etrogen 감소로 생기는 지질 조성 변화 및 collagen 합성 저하를 회복시킨 다는 보고가 있으며9), LFE 자체가 항산화 효과가 있어서 정상 세포를 보호할 수 있다는 보고가 있어25) LFE가 피부의 주름 방지및 탄력 유지에 효과가 있을 것으로 기대하고 연구를 진행하였다.
- Elastase에 대해서는 제 Ⅰ형과 Ⅳ형 모두 직접적으로 활성을 유의하게 억제하였고, 세포 내에서도 유의하게 억제하여 임상상 LFE가 피부 미백이나 피부 탄력유지에 효과가 있을 것으로 생각된다. 따라서 추후 피부 미백 및 탄력 유지에 대한 연구에본 연구 결과가 활용 될 수 있을 것으로 생각한다.
- 본 연구에서는 몇 가지 Elastase 중 가장 중요한 제Ⅰ형과 제 Ⅳ형 Elastase에 대하여 LFE의 활성 억제 효과를 관찰한 결과, LFE는 Elastase type Ⅰ과 Ⅳ 모두에서 유의한 저해율을 나타내었고(Fig. 5), B16F10세포 내에서도 Elastase 활성 저해 효과를 검증한 결과 유의한 결과를 나타내었다(Fig. 6). 이는 LFE가 elastase inhibitor로서 작용할 가능성이 있기에 다른 항산화제들과의 비교연구가 필요할 것으로 생각되며, 후속 연구를 통하여 이를 규명하여야 할 것으로 생각 된다.
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