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문제 정의
- 본 연구에서는 지실의 KP 10 (MFDS Notification No. 2013-103, 2013)에 지표물질로 설정되어있는 poncirin과 naringin의 효과적인 동시 분석법을 정립하고 추출용매, 시료 · 용매조성 비율, 추출시간 및 추출온도 등의 최적의 추출 조건을 확립하고자 한다.
- Lee 등 (2011)은 poncirin과 naringin의 함량 분석에서 초음파 추출법을 이용하였지만 초음파를 이용한 최적의 추출법과 관련된 연구는 미비한 실정이다. 식물체 내에 존재하는 많은 화합물들은 추출용매, 용매비율, 추출 시간과 온도 등 추출조건이 식물 화합물의 함량과 이화학적인 특성에 영향을 미치므로 (Kim et al., 2010) 조건별 추출법을 최적화하고자 한다.
제안 방법
- HPLC는 LC-20AD pump, SPD-10A UV-Vis detector과 SIL-20A auto sampler등으로 구성된 LC-20A series (Shimadzu, Japan)이고 분석용 컬럼은 XBridgeTM C18 (4.6× 250 ㎜, 5 ㎛, Waters, USA)를 이용하였다.
- 45 ㎛ syringe filter를 통과시킨 여액을 시료로 사용하였다. Poncirin, naringin 표준품 각 2 ㎎ 을 정밀히 재어 10 ㎖ methanol에 용해시켜 200 ㎍/㎖로 만들어 표준원액을 제조한 후, methanol로 단계적으로 희석하여 10, 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도가 되도록 표준용액을 만들어 3반복 정량 분석하였다.
- 본 연구를 통하여 지실의 poncirin, naringin에 대한 동시분석 정량법과 초음파를 이용하여 최적의 추출법을 확립하고 검증하였다. 지실의 poncirin, naringin은 70% methanol로 1 : 300의 시료용매비율, 10 min 동안 40℃에서 추출효율이 가장 좋은 최적의 추출조건을 확립하였다.
- 용매 조성 추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50 ㎖ 와 60 min, 상온에서 각 시료용매 비율별 지실 분말을 사용하여 추출수율 변화를 비교해 보았다. 시료와 용매의 비율을 1 : 50, 1 : 100, 1 : 300, 1 : 500, 1 : 1000으로 설정하여 추출한 결과, 각각 1 : 300에서 poncirin 2.
- 지실 분말을 50 ㎖ 용량 플라스크에 넣은 후, 용매 종류별, 용매 농도별, 시료·용매 비율별, 추출 시간별, 추출 온도별로 초음파 추출기 (Branson 8510, 40 kHz, Emerson Industrial Automation, USA)를 이용하여 추출하였고 추출조건별 수율 및 성분 정량분성은 3회 반복 실시하였다.
- 지실의 지표성분인 poncirin, naringin에 대한 동시 정량 분석법을 확립하고자 KP 10 (MFDS Notification No. 2013-103, 2013) 기준을 참고하여 다양한 용매와 용매조성에 대하여 분석조건을 변화시킨 결과 Water : Methanol : Acetonitrile (70 : 15 : 15 → 50 : 25 : 25) 기울기 용리조건을 확립하여 분석하였다.
- 추출용매 조건의 변화에 따른 추출효율을 알아보기 위하여 지실 분말 0.5 g, 용매 50 ㎖, 60 min, 상온에서 flavonoid glycoside계 화합물은 alcohol, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것이 일반적이라는 것을 참고하여 (Kim et al., 1989) 에탄올, 물, 메탄올로 추출하였다. 평균 함량은 에탄올, 물, 메탄올에서 각각 poncirin 1.
대상 데이터
- 경북 춘양산에서 수집한 자연산 지실을 운곡한약품에서 2013년 6월에 구입하였고 최고야 박사로부터 기원의 진위와 품질상태를 검증받았다. 건조 지실은 Mixer (HMF-3000s, Hanil, Korea)로 분쇄한 후 70 mesh의 체로 쳐서 기밀용기에 보관하여 사용하였다.
- 지실의 지표성분인 poncirin (≥ 96.0%)은 Fluka사 (USA), naringin (≥ 96.8%)은 Chromadex사 (USA)에서 구입하였으며 (Fig. 1), 시료의 추출 및 분석에 사용된 용매인 acetonitrile, distilled water, ethyl alcohol, methanol은 Burdick & Jackson사 (USA)의 HPLC급 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 검출한계 (Limit of Detection)와 검량한계 (Limit of Quantification) 값은 HPLC/UV-vis에 주입 후 얻은 결과 값을 통해 측정에 대한 표준편차(σ)를 계산하고, 선형검정곡선을 작성하여 기울기 (s)를 LOQ는 3.3 × σ/S와 LOQ는 10 × σ/S로 계산하였다 (Ma et al., 2013).
- , 2013). 동일 시료에 대해 실험환경의 변동이 미치는 변화를 확인하기 위해 일내 (intra day, repeatability) 및 일간 (inter day, reproducibility) 정밀성 (precision)을 3가지 농도에서 평가하였고, 결과는 상대표준편차 (RSD)로 나타내었다. 정확성 평가를 위한 회수율 시험 (recovery)은 표준물 첨가법에 의하여 상대표준편차를 측정하여 확인하였다.
- 동일 시료에 대해 실험환경의 변동이 미치는 변화를 확인하기 위해 일내 (intra day, repeatability) 및 일간 (inter day, reproducibility) 정밀성 (precision)을 3가지 농도에서 평가하였고, 결과는 상대표준편차 (RSD)로 나타내었다. 정확성 평가를 위한 회수율 시험 (recovery)은 표준물 첨가법에 의하여 상대표준편차를 측정하여 확인하였다.
- 통계분석은 Minitab 16 (Minitab Inc., USA)을 이용하였고, 추출방법에 따른 추출수율은 ANOVA (Analysis of Variance)를 이용하여 분산 분석 후 Tukey법으로 사후검정을 실시하였고, Korean Pharmacopoeia Tenth Edition (KP 10, MFDS Notification No. 2013-103, 2013) 추출 방법과의 비교는 독립표본 t-test로 분석하여 추출 수율의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 분석법 validation은 ICH 가이드라인 (Gandhimathi and Ravi, 2008)에 준하여 지실의 poncirin, naringin의 검량선은 10 ~ 200 ㎍/㎖ 범위에서 작성하였다. 검출한계 (Limit of Detection)와 검량한계 (Limit of Quantification) 값은 HPLC/UV-vis에 주입 후 얻은 결과 값을 통해 측정에 대한 표준편차(σ)를 계산하고, 선형검정곡선을 작성하여 기울기 (s)를 LOQ는 3.
성능/효과
- , 2010). 70% 메탄올 추출물에서 poncirin 함량은 2.18%로 통계적으로 유의성 있게 함량이 가장 높았고, naringin은 50, 70% 메탄올에서 유의적으로 높은 결과를 보였지만 평균수율이 50% 메탄올은 1.57%, 70% 메탄올은 1.59%로 산술적으로 높은 값을 보였다 (Fig. 3).
- 15%로 최적화된 추출법에서 더 높은 함량을 보였다. Naingin은 약전 추출법에서 1.49%와 최적화된 추출법에서 1.60% 함량을 보였고, t-test결과 p-value가 0.05이하로 나타나 유의적인 차이를 보이는 것을 확인 할 수 있었다.
- 65%으로 높은 수율을 보였다. Tukey 사후 검정 결과 poncirin은 10분에서 유의적으로 높았고 naringin은 5, 10, 20분에서 유의적으로 높았지만 10분에서 산술적으로 높은 평균 수율을 보였으며 시간이 길수록 추출수율이 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 5).
- 새롭게 개발된 분석방법을 검증하고자 직선성, 특이성, 정밀성, 정확성의 검증하여 신뢰성을 높이고자 하였고, 2가지 성분을 동시 분석할 수 있도록 그 조건을 확립함으로써 경제적, 시간적 및 인력에 대한 효율을 증대시킬 수 있었다. 기존의 KP 10 (MFDS Notification No. 2013-103, 2013)의 추출법과 정립된 추출법과 비교하였을 때 poncirin 함량은 2.12%와 2.15%로 최적화된 추출법에서 더 높은 함량을 보였다. Naingin은 약전 추출법에서 1.
- 999)은 모두 양호한 직선성을 보였다. 농도범위와 LOD, LOQ 값은 poncirin은 10.2 ~ 203.0 ㎍/㎖ 농도범위에서 0.019 ㎍/㎖, 0.056 ㎍/㎖이고, naringin은 10.3 ~ 205.0 ㎍/㎖ 농도범위에서, 0.016 ㎍/㎖, 0.049 ㎍/㎖으로 미량의 성분까지 검출 가능하였다 (Table 2).
- , 2008)와 비슷한 결과를 보였다. 또한 초음파 추출법은 낮은 온도에서 추출하여 유용성분의 파괴를 줄일 수 있고 짧은 시간에도 높은 추출수율과 생리활성을 기대할 수 있다는 결과 (Woo et al., 2009)와 같이 10분이라는 짧은 추출시간과 40℃의 온도에서 높은 추출수율을 보였다.
- 분석법의 정밀성 평가를 위해 두 지표물질의 직선성이 확인된 농도 구간 중 3가지 농도를 기준으로 일간 (inter-day) 정밀도와 일내 (intra-day) 정밀도를 3회 반복 측정하였는데 일간 정밀도는 0.02 ~ 0.11%, 일내 정밀도는 0.01 ~ 0.07%의 상대표준편차 (RSD%) 값을 보여주었다 (Table 3).
- 분석법의 정확성 평가를 위하여 회수율 실험을 진행한 결과 poncirin은 98.77%, naringin은 100.80%의 회수율을 나타내었고 각각 0.082, 0.023% 상대표준편차를 보였다 (Table 4).
- 새롭게 개발된 분석방법을 검증하고자 직선성, 특이성, 정밀성, 정확성의 검증하여 신뢰성을 높이고자 하였고, 2가지 성분을 동시 분석할 수 있도록 그 조건을 확립함으로써 경제적, 시간적 및 인력에 대한 효율을 증대시킬 수 있었다. 기존의 KP 10 (MFDS Notification No.
- 용매 조성 추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50 ㎖ 와 60 min, 상온에서 각 시료용매 비율별 지실 분말을 사용하여 추출수율 변화를 비교해 보았다. 시료와 용매의 비율을 1 : 50, 1 : 100, 1 : 300, 1 : 500, 1 : 1000으로 설정하여 추출한 결과, 각각 1 : 300에서 poncirin 2.19%, naringin 1.64%으로 높은 수율을 보였고, 통계 결과는 두 성분 모두 1 : 300에서 유의적으로 높은 결과를 보였다 (Fig. 4).
- 지실의 poncirin, naringin은 70% methanol로 1 : 300의 시료용매비율, 10 min 동안 40℃에서 추출효율이 가장 좋은 최적의 추출조건을 확립하였다. 조건별로 살펴본 결과 용매와 용매비율별로 비교하였을 때 추출수율이 poncirin 1.40 ~ 2.18%, naringin 0.86 ~ 1.59%로 가장 많은 차이를 보였는데 이는 초음파 추출에서 용매가 추출효율에 가장 효과적인 영향을 미친다는 기존의 연구결과 (Ma et al., 2008)와 비슷한 결과를 보였다. 또한 초음파 추출법은 낮은 온도에서 추출하여 유용성분의 파괴를 줄일 수 있고 짧은 시간에도 높은 추출수율과 생리활성을 기대할 수 있다는 결과 (Woo et al.
- 본 연구를 통하여 지실의 poncirin, naringin에 대한 동시분석 정량법과 초음파를 이용하여 최적의 추출법을 확립하고 검증하였다. 지실의 poncirin, naringin은 70% methanol로 1 : 300의 시료용매비율, 10 min 동안 40℃에서 추출효율이 가장 좋은 최적의 추출조건을 확립하였다. 조건별로 살펴본 결과 용매와 용매비율별로 비교하였을 때 추출수율이 poncirin 1.
- 지실의 지표성분인 poncirin (R2= 1), naringin (R2= 0.999)은 모두 양호한 직선성을 보였다. 농도범위와 LOD, LOQ 값은 poncirin은 10.
- 추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50 ㎖, 지실 분말 0.167 g, 초음파 시간 10 min과 온도에 따른 함량변화를 알아보기 위해 30, 40, 50, 60, 70℃의 조건에서 추출하였을 때, 각각 40℃에서 poncirin 2.22%, naringin 1.68%으로 높은 수율을 보였다. 통계 결과는 두 성분 모두 40℃에서 유의적으로 높은 결과를 보였고 40℃ 이후로 온도가 올라갈수록 추출수율이 떨어지는 경향이 나타났다 (Fig.
- 추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50 ㎖, 지실 분말 0.167 g과 상온에서 다른 초음파 시간 (5, 10, 20, 40, 60, 80 min)을 설정하여 추출하였을 때, 각각 10 min에서 poncirin 2.15%, naringin 1.65%으로 높은 수율을 보였다. Tukey 사후 검정 결과 poncirin은 10분에서 유의적으로 높았고 naringin은 5, 10, 20분에서 유의적으로 높았지만 10분에서 산술적으로 높은 평균 수율을 보였으며 시간이 길수록 추출수율이 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig.
- 68%으로 높은 수율을 보였다. 통계 결과는 두 성분 모두 40℃에서 유의적으로 높은 결과를 보였고 40℃ 이후로 온도가 올라갈수록 추출수율이 떨어지는 경향이 나타났다 (Fig. 6).
- , 1989) 에탄올, 물, 메탄올로 추출하였다. 평균 함량은 에탄올, 물, 메탄올에서 각각 poncirin 1.40%, 1.97%, 2.01%, naringin 0.86%, 1.55%, 1.28%로 poncirin은 메탄올에서 naringin은 물에서 높은 수율을 보였다. 메탄올은 극성용매와 비극성용매에서 용출되는 물질 모두가 잘 용출되고 용해도가 크고 가격이 저렴하고 추출 조작이 편리하여 식물추출 용매로 자주 사용되어진다 (Shin and Lee, 2011).
후속연구
- 지실의 유효성분인 poncirin, naringin의 동시 분석법과 최적의 추출조건 확립을 위하여 실험을 진행하였고, 정립된 분석법과 초음파를 이용한 최적의 추출조건이 지실의 품질관리에 신속하고 효율적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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