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문제 정의
- 하지만 이들 두 종 추출물의 항산화 활성을 비교한 연구는 발표된 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 이들 두 가지 품종 복분자들의 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량을 비교해보고자 한다.
- 본 연구에서는 토종 복분자와 외래종 복분자의 항산화 활성과 장세포 산화스트레스 보호의 차이를 알아보기 위해 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, FRAP assay를 이용한 환원력을 비교 조사하였고, 사람의 장내 세포인 Caco-2 cell에 과산화수소를 이용하여 자극시켜 장세포 산화스트레스 보호를 확인하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 외래종 복분자가 유의적으로 높은 것으로 나타났다.
제안 방법
- 어두운 곳에서 혼합용액을 잘 섞고 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 검량곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였고 각각의 모든 sample은 triplicates로 분석하였다.
- )를 160 μL 넣고 실온에서 5분간 방치한 다음 10% sodium carbonate를 300 μL씩 첨가하고 실온으로 암실에서 30분간 방치한 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 검량곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였고 각각의 모든 sample은 triplicates로 분석하였다.
- 건조된 복분자는 최종 농도가 1,000 μg/mL가 되도록 증류수 및 DPBS에 녹여 사용하였다.
- 제조된 FRAP reagent 150 μL에 각 농도별 시료 20 μL를 넣고 593 nm에서 0분과 4분 후에 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 증류수를 넣어 측정하였고 standard로 ascorbic acid를 시료 대신 넣어 측정하였다.
- 동결건조 된 곡성(토종) 및 고창(외래종) 복분자는 모두 농촌진흥청(Suwon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 두 가지 복분자는 수확되어 spectrophotometer를 이용해 완숙된 과일을 선별하였다. 선별된 복분자를 세척하고 동결건조 하였다.
- 선별된 복분자를 세척하고 동결건조 하였다. 두 가지 복분자의 동결건조 된 분말을 0%, 25%, 50%, 75%, 100% 농도별 에탄올로 추출하고 감압 농축기로 농축한 다음 진공건조기로 건조하여 사용하였다. 건조된 복분자는 최종 농도가 1,000 μg/mL가 되도록 증류수 및 DPBS에 녹여 사용하였다.
- 항산화 활성을 평가하는 in vitro 방법은 기전에 따라 크게 5가지 유형으로 수소공여기전, 금속이온 킬레이팅, 일중항산소 제거기전, 산소 소거기전 및 항산화성 효소기전 등으로 나누어 볼 수 있다(31,32). 본 연구에서는 두 가지 복분자의 항산화 성분과 항산화 활성 및 세포독성을 평가하였으며, 실험 결과를 바탕으로 항산화 성분과 각 항산화 활성에 대한 상관관계를 비교하였다(Table 1). ABTS, FRAP 및 세포독성 실험에 대해서는 P-value가 0.
- 두 가지 복분자는 수확되어 spectrophotometer를 이용해 완숙된 과일을 선별하였다. 선별된 복분자를 세척하고 동결건조 하였다. 두 가지 복분자의 동결건조 된 분말을 0%, 25%, 50%, 75%, 100% 농도별 에탄올로 추출하고 감압 농축기로 농축한 다음 진공건조기로 건조하여 사용하였다.
- 장세포에서의 산화스트레스 보호 효과를 확인하기 위해 토종 및 외래 복분자 추출물을 미리 처리한 다음 과산화수소수로 산화스트레스를 유발한 후 세포의 생존율을 비교하였다. 대조군에 비해서 과산화수소군의 세포 생존력이 유의하게 감소하고, 외래종 75%, 100% 에탄올 추출물을 미리 처리한 군에서 각각 93.
- 총 폴리페놀 화합물은 Folin-Ciocalteu 방법(16,17)을 약간 변형하여 분석하였다. 토종 및 외래종 복분자의 에탄올 비율별 추출물 300 μL와 증류수 250 μL, 2 N Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.
- 토종 및 외래종 복분자의 에탄올 비율별 추출물 300 μL와 증류수 250 μL, 2 N Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 160 μL 넣고 실온에서 5분간 방치한 다음 10% sodium carbonate를 300 μL씩 첨가하고 실온으로 암실에서 30분간 방치한 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- Caco-2(대장 상피세포, KCLB30037.1)는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아서 사용하였다. 각각의 세포는 10%의 fetal bovine serum(FBS, Cellgro, Manassas, VA, USA)과 1% penicillin-streptomycin(Gibco, Grand Island, NY, USA)이 함유된 minimum essential medium(MEM) 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 동결건조 된 곡성(토종) 및 고창(외래종) 복분자는 모두 농촌진흥청(Suwon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 두 가지 복분자는 수확되어 spectrophotometer를 이용해 완숙된 과일을 선별하였다.
데이터처리
- Different letters on bars mean significant differences by Duncan's multiple range test (P<0.05, n=3).
- 05에서 비교하였다. Pearson 상관계수 역시 SPSS program(18.0, SPSS Inc.)을 이용하여 이변량 상관계수를 활용하여 분석하였다.
- 측정된 결과는 SPSS program(18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치분산분석을 실시한 후 유의적 차이가 있는 경우 다중비교분석법인 Duncan's multiple range test를 활용하여 유의수준 P<0.05에서 비교하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거 활성 측정은 Jeon 등(20)의 방법에 따라서 측정하였다. ABTS 용액(2,2-azino-bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, Fluka, Neu-Ulm, Germany) 7 mM 5 mL와 140 mM potassium persulfate(K2S2O8) 88 μL를 섞고 어두운 곳에서 16시간 동안 방치한 후, 이 용액 1 mL에 ethanol 88 mL를 첨가하여 혼합용액을 만들었다.
- DPPH radical 소거능은 Goupy 등(19)의 방법에 따라 측정하였다. DPPH working solution은 methanol 50 mL에 용해한 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl을 빛을 차단하여 얼음에 보관하며 사용했다.
- FRAP는 Benzie와 Strain(21)의 방법에 따라 측정하였다. FRAP reagent는 acetate buffer(300 mM, pH 3.
- 총 플라보노이드 함량은 Marinova 등(18)의 방법에 따라 분석하였다. 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해 토종 및 외래종 복분자 에탄올 비율별 추출물을 4 mL의 증류수가 들어있는 15 mL conical tube에 첨가하였다.
성능/효과
- 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 외래종 복분자가 유의적으로 높은 것으로 나타났다. ABTS 라디칼 소거능과 FRAP assay을 이용한 환원력에서도 외래종 복분자가 유의적으로 높은 것으로 나타났으나 DPPH 라디칼 소거능은 토종과 외래종 복분자 모두 비슷하게 나타났다. 장세포 산화스트레스 보호 역시 외래종 복분자가 유의적으로 높게 나타났다.
- 본 연구에서는 두 가지 복분자의 항산화 성분과 항산화 활성 및 세포독성을 평가하였으며, 실험 결과를 바탕으로 항산화 성분과 각 항산화 활성에 대한 상관관계를 비교하였다(Table 1). ABTS, FRAP 및 세포독성 실험에 대해서는 P-value가 0.01 수준에서 유의하고 DPPH에 관해서는 0.05 수준에서 유의한 것으로 나타나 이들 방법들 모두 총 폴리페놀 및 플라보노이드 성분들과 유의하게 양의 상관관계를 보이는 것으로 확인되었다. 특히 이들 항산화 활성 방법 중 FRAP value가 총 플라보노이드와 폴리페놀 함량과 0.
- ABTS에서와 마찬가지로 외래종 복분자 50% 에탄올 추출물(0.49±0.02%)에서 FRAP value가 가장 높았으며 전반적으로 외래종 복분자의 FRAP value가 토종 복분자의 FRAP value보다 높았다.
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 외래종 50%, 75%, 100% 에탄올 추출물(11.78±0.81 mg/g, 10.91±1.17 mg/g, 11.78±0.19 mg/g)에서 총 플라보노이드 함량이 가장 높았다.
- 대조군에 비해서 과산화수소군의 세포 생존력이 유의하게 감소하고, 외래종 75%, 100% 에탄올 추출물을 미리 처리한 군에서 각각 93.54±3.37%, 97.19±0.74%로 유의하게 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 항산화 성분과 항산화 활성의 상관관계는 모두 유의하게 양의 상관관계를 보이는 것으로 나타났으며, FRAP value가 가장 높은 상관관계를 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 FRAP value가 높았던 외래종 복분자 100% EtOH 추출물이 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, ABTS 라디칼 소거능, DPPH 라디칼 소거능, 장세포 산화스트레스 보호능 모두 높은 추출물로 확인되었다.
- 페놀성 화합물의 hydroxyl group은 DPPH와 반응하기 쉬운 입체구조를 갖는 것으로 알려져 있는데(24), hydroxyl group의 위치와 개수 등에 따라 화합물들의 항산화능에 차이가 난다고 알려져 있다(25). 따라서 총 폴리페놀 함량과 DPPH 결과와의 차이는 복분자 추출물들에 함유되어 있는 폴리페놀들의 종류에 따라 나타나는 것으로 판단된다.
- 외래종 복분자 50% 에탄올 추출물(29.65±2.41%)에서 ABTS 라디칼 소거 활성이 가장 높았다.
- 외래종 복분자 중에서는 75% 에탄올 추출물(83.17±0.62%)에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 높았다.
- 외래종 복분자의 경우 50% 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 46.97±2.79 mg/g으로 가장 높았으며, 토종 복분자는 물 추출물에서 31.00±1.49 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였다.
- 토종 복분자 추출물들과 외래종 복분자 추출물들의 ABTS 라디칼 소거 활성을 비교해 보면 모든 추출물에서 외래종 복분자의 ABTS 라디칼 소거 활성이 토종 복분자에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 이 결과는 DPPH 라디칼 소거 활성과는 다르게 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량의 결과와 일치하는 경향을 보임을 확인할 수 있었다.
- Yang 등(13)의 연구에서는 복분자의 주요 지표성분으로 알려진 ellagic acid의 함량을 성숙도에 따라 비교하였다. 이 결과에서는 토종 복분자 중 half ripened 복분자의 에탄올 추출물이 유의하게 높은 ellagic acid 함량을 보이고 이외의 추출물에서는 복분자의 성숙도에 관계없이 유사한 함량을 보이고 있었다. 이번 연구에서는 특정한 화합물이 아닌 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드를 비교한 결과로서 본 연구에서 사용한 성숙한 복분자에는 토종 복분자에 비해 외래종 복분자의 플라보노이드 함량이 높은 것을 알 수 있었다.
- 이 결과에서는 토종 복분자 중 half ripened 복분자의 에탄올 추출물이 유의하게 높은 ellagic acid 함량을 보이고 이외의 추출물에서는 복분자의 성숙도에 관계없이 유사한 함량을 보이고 있었다. 이번 연구에서는 특정한 화합물이 아닌 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드를 비교한 결과로서 본 연구에서 사용한 성숙한 복분자에는 토종 복분자에 비해 외래종 복분자의 플라보노이드 함량이 높은 것을 알 수 있었다. 따라서 ellagic acid가 주요한 복분자의 플라보노이드 성분이라 하더라도 다른 생리활성이 높은 플라보노이드가 많이 함유되어 있는 것으로 추정되므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다.
- 49 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였다. 전체적으로 외래종 복분자의 총 폴리페놀 함량이 토종 복분자에 비해 유의적으로 높은 것을 알 수 있었다.
- 62%)에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 높았다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 결과와는 다르게 토종 및 외래종 복분자 모두 모든 추출물에서 유사한 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다. 페놀성 화합물의 hydroxyl group은 DPPH와 반응하기 쉬운 입체구조를 갖는 것으로 알려져 있는데(24), hydroxyl group의 위치와 개수 등에 따라 화합물들의 항산화능에 차이가 난다고 알려져 있다(25).
- 본 연구에서는 토종 복분자와 외래종 복분자의 항산화 활성과 장세포 산화스트레스 보호의 차이를 알아보기 위해 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, FRAP assay를 이용한 환원력을 비교 조사하였고, 사람의 장내 세포인 Caco-2 cell에 과산화수소를 이용하여 자극시켜 장세포 산화스트레스 보호를 확인하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 외래종 복분자가 유의적으로 높은 것으로 나타났다. ABTS 라디칼 소거능과 FRAP assay을 이용한 환원력에서도 외래종 복분자가 유의적으로 높은 것으로 나타났으나 DPPH 라디칼 소거능은 토종과 외래종 복분자 모두 비슷하게 나타났다.
- 37 mg/g)에서 함량이 높았다. 총 플라보노이드 함량 역시 외래종 복분자가 토종 복분자에 비해 2배 정도 높은 함량을 가지고 있음을 본 실험에서 확인할 수 있었다. Yang 등(13)의 연구에서는 복분자의 주요 지표성분으로 알려진 ellagic acid의 함량을 성숙도에 따라 비교하였다.
- 토종 복분자 중에는 50%, 75% 에탄올 추출물(17.23±2.39%, 17.08±1.85%)에서 비교적 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다.
- 85%)에서 비교적 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다. 토종 복분자 추출물들과 외래종 복분자 추출물들의 ABTS 라디칼 소거 활성을 비교해 보면 모든 추출물에서 외래종 복분자의 ABTS 라디칼 소거 활성이 토종 복분자에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 이 결과는 DPPH 라디칼 소거 활성과는 다르게 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량의 결과와 일치하는 경향을 보임을 확인할 수 있었다.
- 토종 복분자의 경우 50% 에탄올 추출물(84.8±2.15%)에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높았다.
- 05 수준에서 유의한 것으로 나타나 이들 방법들 모두 총 폴리페놀 및 플라보노이드 성분들과 유의하게 양의 상관관계를 보이는 것으로 확인되었다. 특히 이들 항산화 활성 방법 중 FRAP value가 총 플라보노이드와 폴리페놀 함량과 0.9 이상의 높은 상관관계를 보이는 것으로 확인되었다.
- 장세포 산화스트레스 보호 역시 외래종 복분자가 유의적으로 높게 나타났다. 항산화 성분과 항산화 활성의 상관관계는 모두 유의하게 양의 상관관계를 보이는 것으로 나타났으며, FRAP value가 가장 높은 상관관계를 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 FRAP value가 높았던 외래종 복분자 100% EtOH 추출물이 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, ABTS 라디칼 소거능, DPPH 라디칼 소거능, 장세포 산화스트레스 보호능 모두 높은 추출물로 확인되었다.
후속연구
- 이번 연구에서는 특정한 화합물이 아닌 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드를 비교한 결과로서 본 연구에서 사용한 성숙한 복분자에는 토종 복분자에 비해 외래종 복분자의 플라보노이드 함량이 높은 것을 알 수 있었다. 따라서 ellagic acid가 주요한 복분자의 플라보노이드 성분이라 하더라도 다른 생리활성이 높은 플라보노이드가 많이 함유되어 있는 것으로 추정되므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다.
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