약용버섯류 자실체의 아질산염 소거능 및 항염증 효능 분석 Comparative analysis of nitrite scavenging activity and anti-inflammation effects in the fruiting bodies of medicinal mushrooms원문보기
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, $100{\mu}g/ml$의 농도로 처리하여 아질산염 소거능을 실험한 결과 양성대조구인 Ascorbic acid는 25%의 소거능을 보이는데 반해 영지버섯 중 ASI 7080은 40%이상 소거하는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 상황버섯이 37%를 보였다. ASI 7002도 양성대조구보다 높게 나타났고, 그 이외의 다른 실험구는 양성대조구인 Ascorbic acid보다 낮은 아질산염 소거능을 보였다. NO assay 실험을 한 결과, 양성대조구로 쓰인 Ascorbic acid는 항염증 효능이 55%인데 반해 ASI 7002는 78.5%로 가장 높은 항염증 효능을 보였으며, 그 다음으로 ASI 7063이 67.5%를 보였다. 기타 약용버섯류인 동충하초는 71.2%로 가장 높게 나타났으며, 노루궁뎅이 버섯은 59.7%의 소거능을 보였다. 영지버섯 ASI 7002를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 농도별(10, 50, $100{\mu}g/ml$)로 처리하고 LPS$10{\mu}g/ml$ 처리한 RAW 264.7 cell 에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 Real-time PCR kit를 이용하여 염증 관련 유전자인 iNOS와 COX-2와 TNF-a의 primer를 Table 1과 같이 제작하였고, iNOS와 COX-2와 TNF-a의 발현정도를 본 결과 세 유전자 모두 농도 의존적으로 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, $100{\mu}g/ml$의 농도로 처리하여 아질산염 소거능을 실험한 결과 양성대조구인 Ascorbic acid는 25%의 소거능을 보이는데 반해 영지버섯 중 ASI 7080은 40%이상 소거하는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 상황버섯이 37%를 보였다. ASI 7002도 양성대조구보다 높게 나타났고, 그 이외의 다른 실험구는 양성대조구인 Ascorbic acid보다 낮은 아질산염 소거능을 보였다. NO assay 실험을 한 결과, 양성대조구로 쓰인 Ascorbic acid는 항염증 효능이 55%인데 반해 ASI 7002는 78.5%로 가장 높은 항염증 효능을 보였으며, 그 다음으로 ASI 7063이 67.5%를 보였다. 기타 약용버섯류인 동충하초는 71.2%로 가장 높게 나타났으며, 노루궁뎅이 버섯은 59.7%의 소거능을 보였다. 영지버섯 ASI 7002를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 농도별(10, 50, $100{\mu}g/ml$)로 처리하고 LPS $10{\mu}g/ml$ 처리한 RAW 264.7 cell 에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 Real-time PCR kit를 이용하여 염증 관련 유전자인 iNOS와 COX-2와 TNF-a의 primer를 Table 1과 같이 제작하였고, iNOS와 COX-2와 TNF-a의 발현정도를 본 결과 세 유전자 모두 농도 의존적으로 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
This study was carried out to compare the anti-inflammation effects of various fruiting body of Ganoderma species and Cordyceps militaris, Phelinus linteus extracts. We concentrated Ganoderma species and other medicinal mushrooms by extracting with ethanol. And We made it $100{\mu}g/ml$ c...
This study was carried out to compare the anti-inflammation effects of various fruiting body of Ganoderma species and Cordyceps militaris, Phelinus linteus extracts. We concentrated Ganoderma species and other medicinal mushrooms by extracting with ethanol. And We made it $100{\mu}g/ml$ concentration. As a result of nitrite scavenging activity, in the contrast to the positive control; Ascorbic acid was 25%, ASI 7080 of Ganoderma species was disappeared up to around 40%. And in the contrast to Ascorbic acid was 55%, ASI 7002 was 78.5% that was the highest anti-inflammation effect in the result of "No assay test". The Cordyceps militaris showed 75% and Hericium erinaceus showed 59.7% of anti-inflammation effect. As a result of the fungus yield control test of $TNF-{\alpha}$ through ELISA method to ASI 7002 of Ganoderma species that showed the highest anti-inflammation, it was reduced as same as LPS non-treatment. We extracted RNA from ASI 7002 Ganoderma species 10, 50, $100{\mu}g/ml$ concentration and LPS $10{\mu}g/ml$ of Raw 264.7 cell. And we tested the expression of iNOS, COX-2 and TNF-a that are kinds of inflammation gene after synthesizing RNA with cDNA. Finally we could find that iNOS, COX-2 and TNF-a were all controlled expression in the result of above experiment.
This study was carried out to compare the anti-inflammation effects of various fruiting body of Ganoderma species and Cordyceps militaris, Phelinus linteus extracts. We concentrated Ganoderma species and other medicinal mushrooms by extracting with ethanol. And We made it $100{\mu}g/ml$ concentration. As a result of nitrite scavenging activity, in the contrast to the positive control; Ascorbic acid was 25%, ASI 7080 of Ganoderma species was disappeared up to around 40%. And in the contrast to Ascorbic acid was 55%, ASI 7002 was 78.5% that was the highest anti-inflammation effect in the result of "No assay test". The Cordyceps militaris showed 75% and Hericium erinaceus showed 59.7% of anti-inflammation effect. As a result of the fungus yield control test of $TNF-{\alpha}$ through ELISA method to ASI 7002 of Ganoderma species that showed the highest anti-inflammation, it was reduced as same as LPS non-treatment. We extracted RNA from ASI 7002 Ganoderma species 10, 50, $100{\mu}g/ml$ concentration and LPS $10{\mu}g/ml$ of Raw 264.7 cell. And we tested the expression of iNOS, COX-2 and TNF-a that are kinds of inflammation gene after synthesizing RNA with cDNA. Finally we could find that iNOS, COX-2 and TNF-a were all controlled expression in the result of above experiment.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯, 동충하초 자실체를 70% 에탄올로 추출하여 아질산염 소거능과 RAW 264.7세포에서 NO 생성 저해 효과, 염증관련 단백질인 iNOS, COX-2, TNF-a의 발현 억제율을 확인하여 질병 치료 및 예방에 효과가 있는 천연물로서의 가치를 알아보기 위하여 연구를 진행하였다.
제안 방법
24시간 후, 각각의 well에서 100 μl씩의 배지를 회수하여 griess reagent 100 μl 씩과 혼합하여 15분간 반응시킨 후, 540 nm에서 O.D값을 측정하였다.
ASI 7002를 열수추출 하여 농도별(10, 50, 100 μg/ml) 처리와 LPS 10 μg/ml 처리한 RAW 264.7 cell 에서 total RNA를 추출한 후, 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 complementary DNA (cDNA)를 만들고 합성된 cDNA와 primer로 PCR을 이용하여 유전자의 발현정도를 측정하였다.
7 cell 에서 total RNA를 추출한 후, 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 complementary DNA (cDNA)를 만들고 합성된 cDNA와 primer로 PCR을 이용하여 유전자의 발현정도를 측정하였다. PCR 산물은 1.5% 한천(agarose) 겔에서 전기영동 후 EtBr(ethidium^bromide)로 염색하여 UV에서 증폭된 DNA band를 확인하였다. (Table 2)
RAW 264.7 cell을 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 37℃ 배양기에서 5% CO2 농도 하에 계대배양한 후 96 well plate에 2×105 cells/ml 농도로 조절한 cell을 100 μl씩 넣고 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 계대배양한 후 2시간 후에 각각의 시료(200 ug/ml)와 LPS(1 ug/ml) 농도로 첨가된 배지로 교체하였다.
lipopolysaccharide를 가하여 16시간 배양한 후, 상층액을 취해 ELISA Kit (Biosource, USA)를 이용해 TNF-α를 정량하였다.
또한 NO(nitrite oxide)형성은 체내방어기능, 신호전달기능, 혈관확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있지만 과도한 NO의 형성은 염증을 심화시켜 조직의 손상, 유전자변이, 패혈성 쇼크 및 신경손상 등을 일으킨다고 알려져 있다. 마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell에 LPS (lipopolysaccharides)로 자극하여 많은 양의 NO를 형성하며 이에 의한 염증반응 관여 정도를 알아보았고, 이와 더불어 염증관련 단백질인 iNOS, COX-2, TNF-a의 발현을 억제하는지 여부를 RTPCR을 통해 확인하였다. 그리고 ELISA assay를 통해 TNF-a의 생성량이 줄어드는 것을 확인하였다.
7 cell을 24 well plate에 1×105 cells/ml의 농도로 24 well plate에 seeding하여 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 하였다. 배지를 제거하고 혈청이 배제된 DMEM를 가하여 12시간 starvation 시킨 후, FBS가 첨가되지 않은 DMEM에 희석한 실험물질을 가해 20분간 전처리하고. lipopolysaccharide를 가하여 16시간 배양한 후, 상층액을 취해 ELISA Kit (Biosource, USA)를 이용해 TNF-α를 정량하였다.
4 ml을 혼합시킨다. 이를 15분간 암반응 시킨후 흡광도 520 nm에서 측정하여 잔존하는 아질산염량을 구하였다. 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.
대상 데이터
재배법은 영지버섯의 표준재배법에 따라 참나무 원목에 재배하여 각각의 자실체를 수확한 후에 열풍건조하여 분쇄한 시료를 얻었다. 나머지 버섯(노루궁뎅이 버섯, 상황버섯, 동충하초)은 건물을 구입하여 실험에 사용하였다. (Table 1)
실험에 사용된 영지버섯자실체는 Table 1과 같이 농촌 진흥청 국립원예특작과학원 버섯과에 보존되어 있는 ASI(Agricultural Sciences Institute) 균주 중 6종을 충북 음성군에 위치한 버섯과 버섯종합재배동 원목재배사에서 재배하였다. 재배법은 영지버섯의 표준재배법에 따라 참나무 원목에 재배하여 각각의 자실체를 수확한 후에 열풍건조하여 분쇄한 시료를 얻었다.
이론/모형
실험에 사용된 영지버섯자실체는 Table 1과 같이 농촌 진흥청 국립원예특작과학원 버섯과에 보존되어 있는 ASI(Agricultural Sciences Institute) 균주 중 6종을 충북 음성군에 위치한 버섯과 버섯종합재배동 원목재배사에서 재배하였다. 재배법은 영지버섯의 표준재배법에 따라 참나무 원목에 재배하여 각각의 자실체를 수확한 후에 열풍건조하여 분쇄한 시료를 얻었다. 나머지 버섯(노루궁뎅이 버섯, 상황버섯, 동충하초)은 건물을 구입하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 100 μg/ml의 농도로 처리하여 아질산염 소거능을 실험한 결과 양성대조구인 Ascorbic acid는 25%의 소거능을 보이는데 반해 영지버섯 중 ASI 7080은 40%이상 소거하는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 상황버섯이 37%를 보였다. ASI 7002도 양성대조구보다 높게 나타났고, 그 이외의 다른 실험구는 양성대조구인 Ascorbic acid보다 낮은 아질산염 소거능을 보였다.
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 100 μg/ml의 농도로 처리하여 아질산염 소거능을 실험한 결과 양성대조구인 Ascorbic acid는 25%인데 반해 영지버섯 중 ASI 7080은 40%이상 소거하는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 상황버섯이 37% 소거능을 보였다. ASI 7002도 양성대조구보다 높은 소거능을 보였고, 그 이외의 다른 실험구는 양성대조구인 Ascorbic acid보다 낮은 아질산염 소거능을 확인 할 수 있었다. (Fig.
NO assay 실험을 한 결과, 양성대조구로 쓰인 Ascorbic acid는 항염증 효능이 55%인데 반해 ASI 7002는 78.5%로 가장 높은 항염증 효능을 보였으며, 그 다음으로 ASI 7063이 67.5%를 보였다. 기타 약용버섯류인 동충하초는 71.
7 cell에 LPS (lipopolysaccharides)로 자극하여 많은 양의 NO를 형성하며 이에 의한 염증반응 관여 정도를 알아보았고, 이와 더불어 염증관련 단백질인 iNOS, COX-2, TNF-a의 발현을 억제하는지 여부를 RTPCR을 통해 확인하였다. 그리고 ELISA assay를 통해 TNF-a의 생성량이 줄어드는 것을 확인하였다.
5%였다. 기타 약용버섯류인 동충하초는 71.2%로 가장 높게 나타났으며, 노루궁뎅이는 59.7%의 항염증 효능을 보였다. (Fig.
영지버섯 ASI 7002를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 농도별(10, 50, 100 μg/ml)로 처리하고 LPS 10 μg/ml 처리한 RAW 264.7 cell 에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 Real-time PCR kit를 이용하여 염증 관련 유전자인 iNOS와 COX-2와 TNF-a의 primer를 Table 1과 같이 제작하였고, iNOS와 COX-2와 TNF-a의 발현정도를 본 결과 세 유전자 모두 농도 의존적으로 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 100 μg/ml의 농도로 처리하여 NO assay 실험을 한 결과, 양성대조구로 사용한 Ascorbic acid는 항염증 효능이 55%인데 반해 ASI 7002는 78.5%로 가장 높은 항염증 효능을 보였으며, 그 다음으로 ASI 7063이 67.5%였다.
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 100 μg/ml의 농도로 처리하여 아질산염 소거능을 실험한 결과 양성대조구인 Ascorbic acid는 25%의 소거능을 보이는데 반해 영지버섯 중 ASI 7080은 40%이상 소거하는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 상황버섯이 37%를 보였다.
영지버섯과 기타 약용버섯류를 에탄올 용매로 추출하여 농축한 뒤, 100 μg/ml의 농도로 처리하여 아질산염 소거능을 실험한 결과 양성대조구인 Ascorbic acid는 25%인데 반해 영지버섯 중 ASI 7080은 40%이상 소거하는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 상황버섯이 37% 소거능을 보였다.
영지버섯류 중 ASI 7002의 추출물을 처리하여 면역관련 TNF-α 생성량을 ELISA assay를 통해 살펴 본 결과, LPS를 처리하지 않았을 때의 값과 비슷하게 줄이는 것을 알 수 있었다.
7 cell에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 Real-time PCR kit를 이용하여 염증 관련 유전자인 iNOS와 COX-2와 TNF-a의 primer를 Table 2. 와 같이 제작하였고, iNOS와 COX-2와 TNF-a의 발현정도를 본 결과 세 유전자 모두 농도 의존적으로 염증관련 유전자 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. (Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마우스 대식세포에 영지버섯과 기타 약용버섯류 노루궁뎅이 버섯, 상황버섯, 동충하초의 에탄올 추출물 농축액을 100 μg/ml의 농도로 NO assay 실험한 결과, 기타 약용버섯류 중 가장 높은 항염증 효능을 보인 것은?
5%였다. 기타 약용버섯류인 동충하초는 71.2%로 가장 높게나타났으며, 노루궁뎅이는 59.
아질산염이 생성하는 발암물질은?
아질산염은 2급 및 3급 amine류와 반응하여 발암물질인 Nitrosoamine을 생성하는 것으로 알려져 있으며, Nitrosoamine은 체내에서 diazoalkane(CnH2nN2)으로 변화 하여 핵산이나 단백질 또는 세포내의 성분을 알카리화함으로써 암을 유발한다고 보고되어 있다. 또한 NO(nitrite oxide)형성은 체내방어기능, 신호전달기능, 혈관확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있지만 과도한 NO의 형성은 염증을 심화시켜 조직의 손상, 유전자변이, 패혈성 쇼크 및 신경손상 등을 일으킨다고 알려져 있다.
아질산염이 발암물질인 Nitrosoamine을 생성하는 반응은?
아질산염은 2급 및 3급 amine류와 반응하여 발암물질인 Nitrosoamine을 생성하는 것으로 알려져 있으며, Nitrosoamine은 체내에서 diazoalkane(CnH2nN2)으로 변화 하여 핵산이나 단백질 또는 세포내의 성분을 알카리화함으로써 암을 유발한다고 보고되어 있다. 또한 NO(nitrite oxide)형성은 체내방어기능, 신호전달기능, 혈관확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있지만 과도한 NO의 형성은 염증을 심화시켜 조직의 손상, 유전자변이, 패혈성 쇼크 및 신경손상 등을 일으킨다고 알려져 있다.
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